Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы
1.1 Этиология и патогенез лейкоплакии слизистой оболочки полости рта
1.2 Методы лечения пациентов с лейкоплакией 20
1.3 Использование лазерных технологий для иссечения мягких тканей 25
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования
2.1 Клинические методы исследования 35
2.1.1 Распределение пациентов по группам исследования 35
2.1.2 Оценка послеоперационного болевого синдрома 37
2.1.3 Определение степени выраженности коллатерального отёка в послеоперационной области
2.1.4 Изучение заживления послеоперационной раны после лазерного воздействия и традиционной методики
2.2 Физические и технические характеристики эрбиевого и углекислого лазеров
2.2.1 Показания к клиническому использованию лазеров 44
2.3 Методики хирургического лечения пациентов с веррукозной формой лейкоплакии слизистой оболочки полости рта
2.3.1 Методика хирургического лечения пациентов с использованием излучения эрбиевого лазера
2.3.2 Методика хирургического лечения пациентов с использованием излучения углекислого лазера
2.3.3 Методика хирургического лечения пациентов с использованием излучения эрбиевого и углекислого лазеров
2.3.4 Традиционная методика хирургического лечения пациентов с веррукозной формой лейкоплакии слизистой оболочки полости рта
2.4 Биохимические методы исследования 52
2.4.1 Методика получения смешанной слюны для исследования 52
2.4.2 Методика получения и подготовки биоптатов слизистой оболочки полости рта пациентов для биохимического исследования 2.4.3 Количественное определение аннексина V в супернатанте 53 смешанной слюны и гомогенатах слизистой оболочки полости рта пациентов
2.4.4 Количественное определение каспазы-9 в супернатанте смешанной слюны и гомогенатах слизистой оболочки полости рта пациентов
2.5 Гистологический метод исследования 55
2.6 Статистическая обработка материала 56
Результаты собственных исследований
ГЛАВА III. Характеристика пациентов с веррукознои формой лейкоплакии слизистой оболочки полости рта
3.1 Результаты клинического обследования пациентов 57
3.2 Исследование смешанной слюны у пациентов с веррукозной формой лейкоплакии слизистой оболочки полости рта
3.3 Исследование количества аннексина V и каспазы-9 в биоптатах слизистой оболочки полости рта у пациентов с веррукозной формой лейкоплакии
3.4 Морфологическое исследование биоптатов, полученных из участков слизистой оболочки полости рта пациентов с веррукозной формой лейкоплакии
ГЛАВА IV. Результаты хирургического лечения пациентов с веррукозной формой лейкоплакии слизистой оболочки полостирта
4.1 Результаты хирургического лечения пациентов с веррукозной формой лейкоплакии слизистой оболочки полости рта излучением EnYAG лазера
4.2 Результаты хирургического лечения пациентов с веррукозной формой лейкоплакии слизистой оболочки полости рта излучением СОг лазера
4.3 Результаты хирургического лечения пациентов с веррукозной формой лейкоплакии слизистой оболочки полости рта сочетанным применением излучения EnYAG и С02 лазеров
ГЛАВА V. Заключение. 94
Выводы 101
Практические рекомендации 102
Список литературы 104
- Использование лазерных технологий для иссечения мягких тканей
- Изучение заживления послеоперационной раны после лазерного воздействия и традиционной методики
- Исследование количества аннексина V и каспазы-9 в биоптатах слизистой оболочки полости рта у пациентов с веррукозной формой лейкоплакии
- Результаты хирургического лечения пациентов с веррукозной формой лейкоплакии слизистой оболочки полости рта сочетанным применением излучения EnYAG и С02 лазеров
Введение к работе
Актуальность темы
В настоящее время всё больше внимания уделяется своевременному, адекватному лечению предраковых заболеваний слизистой оболочки полости рта и красной каймы губ, в частности, лейкоплакии (Цветкова Л.А. с соавт., 2006; Анисимова И.В., 2009). Различают несколько форм лейкоплакии -плоскую, веррукозную и эрозивно-язвенную. Веррукозная форма лейкоплакии относится к факультативным предопухолевым заболеваниям. Она характеризуется различной степенью патологического ороговения покровного эпителия и в 70% случаев трансформируется в рак (Джанаева У.Р., 1999; Максимовский Ю. М. с соавт., 2002). Наиболее выраженную склонность к злокачественной трансформации имеет пролиферативная веррукозная форма лейкоплакии с бородавчатыми разрастаниями на поверхности (Анисимова И.В. с соавт., 2008; Лангле Р.П., Миллер К.С., 2008; Bouquot J.E., Gnepp D.R., 1991; Bagan J.V. et al., 2003, 2004).
Эффективность оказания помощи больным с данной формой патологии определяется своевременностью и точностью диагностики заболевания с последующим выбором оптимального метода лечения (Гуськова О.Н.. Солнышкина А.Ф., 2008; Юсупов А.С., 2008). Консервативные методы лечения приемлемы только для плоской формы лейкоплакии. В случае же веррукозной формы лейкоплакии лечение должно быть хирургическим, но даже при традиционном хирургическом лечении веррукозной формы лейкоплакии возможны рецидивы заболевания и, вследствие травматичности данного метода операции, нарушение процесса регенерации в послеоперационном периоде (Лукиных Л.М., 2000; Брусенина Н.Д. с соавт., 2007). Поэтому необходимо искать методы, позволяющие более щадяще иссекать пораженные участки слизистой полости рта и способствующие активации репаративных процессов в послеоперационной ране.
В последние десятилетия в хирургии всё чаще используют методы, / являющиеся альтернативой стандартным хирургическим инструментами \.
Иссечение поражённого участка проводится путём воздействия низких температур, радиоволновым коагулятором, электрокоагулятором и лазерным излучением (Алларионов В.Е., 1994; Боровский Е.В., 2003; Баграмов Р.И. с соавт., 2010).
В настоящее время разработаны высокоэффективные импульсные лазеры нового поколения, которые обеспечивают доступность и визуализацию оперируемой зоны, обезболивание, гемостаз, лимфостаз, иссечение обширного участка без последующего наложения йодоформного тампона. В послеоперационном периоде наблюдается снижение болевого синдрома, уменьшение отёка, а также ускорение регенерации тканей (Тарасенко СВ. с соавт., 2007; Тарасенко И.В., Вавилова Т.П., 2010; Штрунова Л.Н., 2011).
В связи с этим представляет интерес изучение и внедрение в практику лечение веррукозной лейкоплакии слизистой оболочки полости рта (СОПР) с помощью хирургических лазеров последнего поколения.
Цель исследования: повышение эффективности хирургического лечения пациентов с веррукозной формой лейкоплакии слизистой оболочки полости рта с использованием эрбиевого и углекислого лазеров. Задачи исследования
-
Для оценки состояния мембран и проявления апоптоза в клетках слизистой оболочке полости рта при веррукозной форме лейкоплакии определить количество аннексина V и каспазы-9 в смешанной слюне и биоптатах слизистой оболочки полости рта.
-
Выявить в смешанной слюне и биоптатах слизистой оболочки полости рта пациентов с веррукозной формой лейкоплакии взаимосвязь между количеством аннексина V и каспазы-9 от возраста, вредных привычек, продолжительности заболевания и площади поражения
-
Провести сравнительный анализ заживления послеоперационной раны, сформированной различными хирургическими инструментами, по клиническим данным и количеству аннексина V и каспазы-9 в смешанной слюне пациентов.
-
Изучить особенности послеоперационного периода по степени выраженности болевого синдрома и коллатерального отёка у пациентов с веррукозной формой лейкоплакии слизистой оболочки полости рта в зависимости от способа хирургического лечения.
-
Сравнить влияние излучения СОг и EnYAG лазеров в сопоставимых режимах абляции и коагуляции на заживление послеоперационной раны у пациентов с веррукозной формой лейкоплакии.
-
Разработать методику иссечения участка слизистой оболочки полости рта, поражённой веррукозной формой лейкоплакии, с помощью лазерных технологий.
Научная новизна. Впервые была предложена методика сочетанного применения эрбиевого лазера с длиной волны 2940 нм мощностью 4 Вт, длительностью импульса 700 мкс в режиме «long», с энергией 300 мДж, частотой 20 Гц, временем экспозиции 15 с на 1 см с водно-воздушным спреем и углекислого лазера с длиной волны 10600 нм, мощностью 3 Вт, частотой 15 Гц для хирургического лечения веррукозной формы лейкоплакии слизистой оболочки полости рта. При применении эрбиевого лазера возможно безболезненное и щадящее получение материала для биопсии во время операции. Обработка раны углекислым лазером на втором этапе вследствие глубокого проникновения лазерного луча позволяет избежать рецидивов заболевания.
Впервые был проведён сравнительный анализ клинической
эффективности применения эрбиевого, углекислого лазеров, их комбинации, и традиционного хирургического метода лечения пациентов с веррукозной формой лейкоплакии слизистой оболочки полости рта.
Впервые в настоящей работе было исследовано количество аннексина V и каспазы-9 в смешанной слюне и биоптатах слизистой оболочки полости рта при веррукозной форме лейкоплакии и показана разнонаправленность изменений в количестве исследованных белков. Установлена целесообразность определения аннексина V в смешанной слюне для оценки состояния клеточных мембран
при данной форме патологии слизистой оболочки полости рта. Практическая значимость работы. Применение эрбиевого лазера с длиной волны 2940 нм у пациентов с веррукозной формой лейкоплакии для иссечения патологического участка слизистой оболочки способствует ускорению заживления операционной раны без образования грубых рубцов. Используемые во время операции лазерные технологии обеспечивают гемостаз, дезинфекцию операционной раны, снижение интенсивности болевого синдрома и коллатерального отека после операции, риска развития воспалительных осложнений и сокращение сроков временной нетрудоспособности. После лазерной операции иссечения участка слизистой оболочки полости рта, поражённой лейкоплакией, нет необходимости назначения антибактериальной терапии, а формирование с помощью лазеров коагуляционного слоя на поверхности раны избавляет от необходимости закрытия ее иодоформным тампоном. В процессе эпителизации раны отсутствует фаза образования грануляций.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Применение эрбиевого лазера с длиной волны 2940 нм и углекислого лазера с длиной волны 10600 нм, для иссечения участка веррукозной формы лейкоплакии способствует оптимизации течения послеоперационного периода за счёт уменьшения воспаления и сроков заживления операционной раны. В ране отсутствует фаза грануляции и происходит направленная регенерация поверхностного слоя эпителия под фибринозным налётом без формирования рубца.
-
Результаты биохимических исследований показывают, что при веррукозной форме лейкоплакии слизистой оболочки полости рта наблюдается повреждение мембран и апоптоз клеток. Это определяет необходимость иссечения поражённых участков в полном объёме.
-
Данные клинических и биохимических методов исследования свидетельствуют о том, что традиционный метод хирургического лечения
пациентов с веррукозной формы лейкоплакии слизистой оболочки полости рта, в отличие от лазерного излучения, характеризуется более длительным периодом заживления операционной раны.
Внедрение результатов исследования. Хирургическое лечение пациентов с веррукозной формой лейкоплакии с применением излучения эрбиевого и углекислого лазеров внедрено в практику амбулаторного хирургического отделения Центра стоматологии и челюстно-лицевой хирургии ГБОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития России. Полученные данные используются в лекционном курсе кафедры госпитальной хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии с/ф и кафедры биохимии ГБОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития России.
Личный вклад. Автором лично проведено обследование 108 пациентов с веррукозной формой лейкоплакии слизистой оболочки полости рта. В диссертационное исследование по критериям включения были отобраны пациенты, которым автор проводила хирургические операции традиционным методом, с использованием излучения эрбиевого и углекислого лазеров, и их комбинации. В ходе сбора и исследования материала соискателем освоен и использован современный биохимический метод иммуноферментного анализа. Полученные результаты статистически обработаны и представлены в виде таблиц и графиков.
Апробация работы. Результаты исследования были доложены на XXXI Итоговой Конференции общества молодых ученых МГМСУ, март 2009 г., г. Москва (Россия); XI Ежегодном научном форуме «Стоматология 2009» Инновации и перспективы в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, декабрь 2009 г., Москва (Россия); 20-м Конгрессе Европейской ассоциации черепно-челюстно-лицевых хирургов, 2010г. г. Брюгге (Бельгия); Республиканской научно-практической конференции с международным участием «Инновационные подходы в практическом решении актуальных вопросов современной челюстно-лицевой хирургии» - «Паринские чтения 2010», г. Минск (Белоруссия); VII Конгрессе Балтийской ассоциации челюстно-
лицевых и пластических хирургов, посвященный 200-летию Н.И.Пирогова, 2010, г. Рига (Латвия); Первой международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине», ноябрь 2010, г. Санкт-Петербург (Россия); совместном заседании кафедры госпитальной хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии с/ф, кафедры хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии ФПДО, кафедры биохимии ГОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития России (Москва, 2011). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 1 патент, 2 публикации - в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
Объём и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 125 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения и пяти глав: обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, который включает 206 источников, из них 124 отечественных и 82 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 36 рисунками.
Использование лазерных технологий для иссечения мягких тканей
Лечение хронических заболеваний слизистой оболочки полости рта (СОПР) и красной каймы губ - одна из серьезных проблем современной стоматологии (Барер Г.М. 2005; Анисимова И.В. с соавт., 2008). В последние годы частота этих заболеваний возросла под влиянием внешних и внутренних факторов, наблюдается многообразие их клинических форм. Для этих заболеваний характерны быстрое развитие и риск малигнизации. Врачи-стоматологи зачастую испытывают трудности в диагностике и лечении этих заболеваний. (Людчик Т.Б. с соавт., 2004; Брусенина Н.Д. с соавт., 2007; Юсупов А.С., Черняховская И.Е., 2007; Юсупов А.С., 2008; Гончарова Е.И., 2008; Zaridze D. et al., 1993).
Одним из таких хронических заболеваний слизистой оболочки полости рта и красной каймы губ является лейкоплакия (от греч. «leucous» - белый, «plax» — плёнка), частота встречаемости которой составляет 13% от общего числа стоматологических патологий (Лукиных Л.М., 2000; Максимовский Ю.М. с соавт., 2002; Дементьева Е.А. с соавт., 2009). Большинство клинических форм лейкоплакии характеризуется патологическим ороговением покровного эпителия, что является потенциалом к развитию плоскоклеточного рака (Гилева О.С., Петрович Ю.А., 1987; Машкиллейсон А. Л., 1988; Сулейманова Г.Г. 1988.; Бочарова О.А. и др. 2004; Tortorici S. et al., 2008). Известно, что 80% больных лейкоплакией составляют мужчины, и только 20% - женщины (Машкиллейсон А.Л. и соавт., 1988), что предполагает участие мужских половых гормонов в развитии лейкоплакии (Макаров Я.Л., 2004). Однако, последние исследования свидетельствуют о постепенном сглаживании разницы в частоте заболевания между мужчинами и женщинами (Лангле Р.П., Миллер КС, 2008.).
Этиология и патогенез лейкоплакии слизистой оболочки полости рта и красной каймы губ до сих пор не изучены. Возникновение участков лейкоплакии на слизистой оболочки полости рта провоцируют слабые, но длительно действующие раздражители (Li N. et al, 1999). К ним относятся горячая или острая пища, крепкие спиртные напитки, жевание табака и бетеля, метеорологические (холод, ветер) и профессиональные факторы (анилиновые краски и лаки, пек, каменноугольные смолы, фенол, некоторые соединения бензола, формальдегид, продукты сухой перегонки угля, пары бензина, бром и др.) (Шаргородский А.Г. 1988.;Шанидзе М.М. 1989; Курицина И.Ю. 1999). Сочетанное воздействие термических и химических раздражителей на слизистую оболочку СОПР (аммиачные и феноловые соединения, никотин, производные дегтя) наблюдается при курении (Курицына И. Ю., 1999; Каспина А.И. 2003; Liede К. et al., 1998; Bartsch Н. et al., 1999; Albandar J.M. et al. 2000; Bergstrom J. 2000; Walsh P.M., Epstein J.B. 2000; Mahale A, Saranath D. 2000; Anderson K.E. 2001; Straten M.V. 2001).
Показано, что гиперкератоз СОПР также возникает при патологии желудочно-кишечного тракта (Стрюк Р., 2008; Лукина Г.И, 2011), стрессовых ситуациях (Dagli R.G. et al., 2008), недостатке витамина А в организме (Горбачёв В.В., Горбачёва В.Н., 2002; Lippman S.M. et al., 1993; Benner S.E. et al., 1993; Brandt R.B., 1996; Ramaswamy G. et al., 1996; Sankaranayanan R. et al., 1997) гормональных расстройствах (Макаров Я.Л., 2004), генетических факторах (Scully С et al., 2000; Duarte E.C.B. et al., 2006). С риском развития лейкоплакии также связывают экспрессию белка апоптоза р53, а также одновременное присутствие генотипов GSTM 10 и GSTTlo (Duarte E.C.B. et al., 2006). Я.Л. Макаров (2004) и Л.В. Петрова с соавт. (2004, 2005) выявили значительное повышение чувствительности тканей СОПР к андрогенам и повышение содержания свободного тестостерона в сыворотке крови у больных лейкоплакией. Ряд авторов установили взаимосвязь между возникновением лейкоплакии СОПР и хронической кандидозной инфекцией (Lipperheide V. et al., 1996;CaoJ.etal.,2007).
На развитие лейкоплакии в полости рта могут влиять различные механические травмы, вызываемые дефектами твёрдых тканей отдельных зубов и зубных рядов, минерализованными наддесневыми зубными отложениями, некачественно изготовленными зубными протезами (Джанаева У.Р. 1999.; Барер Г.М. с соавт., 2005; Позднякова Т. И., Зуйков Ю.А. 2007; Рабинович И.М., 2007; Дементьева Е.А. с соавт., 2009). Считается, что возникновение электрохимического потенциала в полости рта между различными металлами коронок и металлических пломб также может вызывать гиперкератоз СОПР (Гожая Л.Д., 2001).
Отечественными врачами-исследователями А.Е. Верлоцким, Б.М. Пашковым, А.Х. Шаргородским, И.Ю. Новиковым и др. было предложено множество различных классификаций лейкоплакии. Однако по современной классификации ВОЗ 10 пересмотра (1999) различают гомогенную и негомогенную лейкоплакию. Негомогенная лейкоплакия, в свою очередь, подразделяется на эритроплакию, узелковую, пятнистую и веррукозную формы. Накоплены данные, свидетельствующие о том, что негомогенная лейкоплакия, особенно пятнистая лейкоплакия рта, в 50% случаев представляет собой дисплазию эпителия и характеризуется высокой частотой малигнизации (Лангле Р.П., Миллер К.С. 2008).
Различают следующие формы лейкоплакии: плоскую (простую), веррукозную и эрозивную. На различных участках слизистой оболочки рта возможно сочетание этих форм лейкоплакии у одного и того же пациента.
О.Н. Гусъкова с соавт (2010) полагают, что плоская, веррукозная и эрозивно-язвенная формы лейкоплакии могут быть не только самостоятельными формами заболевания, но и последовательными стадиями его развития. Такой порядок ранжирования отдельных форм лейкоплакии обусловлен также постепенным нарастанием от формы к форме частоты потенциальной возможности развития дисплазии с последующим озлокачествлением процесса и развитием в финале локального или инвазивного рака. Согласно данным К.Р. Schepman с соавт. (1999) у 2,9% находящихся под наблюдением 166 пациентов с лейкоплакией СОПР отмечалась злокачественная трансформация заболевания в течение 2,5 лет, а по данным О.Н. Сирота (1992) и У.Р. Джанаевой (1999) эта цифра варьирует от 30% до 75%. Лангле Р.П., Миллер К.С. (2008) утверждают что в течении 5 лет лейкоплакия трансформируется в рак у 4-6% пациентов. Особенно склонна к злокачественному перерождению лейкоплакия, локализующаяся на дне полости рта, нижней поверхности языка и его краях, твёрдом нёбе и внутренней поверхности слизистой оболочки губы (Colellin G., 1995).
Плоская или простая форма лейкоплакии (leukoplakia plana) никогда не озлокачествляется, но она может быть составной частью других патологических состояний, и по этой причине у 3-5 % больных может малигнизироваться. Причем у одних этот процесс идет быстро (1-1,5 года), а у других может существовать десятилетиями, не трансформируясь в опухоль (Bartsch Н. et al., 1999).
Веррукозная лейкоплакия (leucoplakia verrucosa) является следующим этапом развития плоской лейкоплакии. Основным признаком, отличающим эту форму лейкоплакии от плоской, является более выраженное ороговение, при котором обнаруживается значительное утолщение рогового слоя. Участок лейкоплакии значительно возвышается над уровнем слизистой оболочки и резко отличается по цвету. Различают бляшечную и бородавчатую формы веррукозной лейкоплакии (Gandolfo S. et al., 2009). При бляшечной форме определяются ограниченные молочно-белые, иногда соломенно-желтые бляшки с четкими контурами, возвышающиеся над окружающей слизистой оболочкой. Бородавчатая разновидность веррукозной лейкоплакии характеризуется плотными серовато-белыми бугристыми или бородавчатыми образованиями, возвышающимися на 2-3 мм над уровнем слизистой оболочки. Бородавчатая форма лейкоплакии обладает большей потенцией к озлокачествлению по сравнению с бляшечной. Ряд зарубежных авторов отмечают, что именно веррукозная форма лейкоплакии в 70% случаев трансформируется в плоскоклеточный рак (Лангле Р.П., Миллер К.С., 2008., Lindenmuller I.H., Lambrecht J.T., 2006; Bishen К.А., Sethi A., 2009).
Изучение заживления послеоперационной раны после лазерного воздействия и традиционной методики
Биопсию слизистой оболочки полости рта производили с согласия пациентов до оперативного вмешательства. Часть материала фиксировали в 10% формалине и направляли на гистологическое исследование. Другую часть ткани отмывали от крови в 0,9% растворе NaCl, растирали в фарфоровой ступке с кварцевым песком на холоду в соотношении 1:1. Растворимые белки экстрагировали 0,5 М раствором NaCl в соотношении 1:1. Полученные гомогенаты центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 минут и до начала исследования хранили при температуре -28С. После однократного размораживания в образцах слизистой оболочки полости рта методом иммуноферментного анализа определяли количество аннексина V и каспазы-9 в нг/мг ткани. Для сравнительного анализа был осуществлён забор образцов биоптатов слизистой оболочки полости рта у 5 здоровых пациентов, не имеющих в анамнезе соматических патологий и воспалительных изменений в полости рта, которые были получены в ходе плановых хирургических операций по удалению разрушенных корней зубов. /
Количественное определение аннексина Vв супернатанте смешанной слюны и в гомогенатах слизистой оболочки полости рта пациентов Для определения содержания аннексина V был использован коммерческий набор фирмы «Bender MedSystems», поставляемый ЗАО «БиоХимМак» (Россия). Перед началом определения готовили серию стандартных растворов, содержащих 50,0; 25,0; 12,5; 6,3; 3,2; 1,6; 0,8 нг/мл аннексина V, необходимых для построения калибровочной кривой. В данном исследовании образцы слюны не разбавляли. В лунки микропланшета с иммобилизованными на них моноклональными антителами к аннексину V вносили по 100 мкл образцов и стандартов. В лунку, предназначенную для бланка (холостой пробы), вносили 100 мкл буфера для разбавления. Затем в каждую лунку добавляли по 50 мкл раствора биотинилированных моноклональных антител к аннексину V. Микропланшет закрывали пленкой, препятствующей испарению образцов, и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре при встряхивании (100 об/мин). По окончании инкубации из лунок удаляли жидкость и четырежды промывали 0,30 мл промывочного буфера для удаления не прореагировавших антител. После удаления остатков жидкости во все лунки одновременно вносили по 200 мкл раствора стрептавидин-пероксидазного конъюгата, микропланшет закрывали пленкой и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре при встряхивании (100 об/мин). По окончании инкубации из лунок удаляли жидкость и снова четырежды промывали 0,30 мл промывочного буфера для удаления не связавшегося конъюгата. Затем во все лунки одновременно вносили по 100 мкл раствора субстратов (тетраметилбензидин и пероксид водорода) и инкубировали 10 минут при комнатной температуре в темноте до появления голубого окрашивания. Для остановки реакции и окончательного окрашивания во все лунки вносили по 100 мкл стоп-раствора (1М раствор Н3РО4), тщательно перемешивали на шейкере, после чего измеряли абсорбцию раствора, приобретшего желтый цвет, при длине волны 450 нм. По результатам измерения оптической плотности в лунках со стандартными растворами аннексина V строили калибровочную; 1\1 кривую зависимости поглощения раствора при 450 нм от содержания аннексина V. Используя полученный график, определяли концентрацию исследуемого белка в смешанной слюне в нг/мл и гомогенатах СОПР в нг/мг ткани. 2.4.4. Количественное определение каспазы-9 в супернатанте смешанной слюны и в гомогенатах слизистой оболочки полости рта пациентов Для определения содержания каспазы-9 был использован коммерческий набор фирмы «BioSource», поставляемый ЗАО «БиоХимМак» (Россия). Перед началом определения готовили серию стандартных растворов, содержащих 100; 50,0; 25,0; 12,5; 6,3; 3,1; 1,6 нг/мл каспазы-9, необходимых для построения калибровочной кривой. В данном исследовании образцы слюны не разбавляли. В лунки микропланшета с иммобилизованными на них моноклональными антителами к каспазе-9 вносили по 50 мкл образцов и стандартов. В лунку, предназначенную для бланка (холостой пробы), вносили 100 мкл буфера для разбавления. Затем в каждую лунку добавляли по 50 мкл раствора биотинилированных моноклональных антител к каспазе-9. Микропланшет закрывали пленкой, препятствующей испарению образцов, и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре при встряхивании (100 об./мин). По окончании инкубации из лунок удаляли жидкость и 3 раза промывали 400 мкл промывочного буфера для удаления не прореагировавших антител. Затем во все лунки одновременно вносили по 100 мкл раствора тетраметилбензидина и инкубировали 10 минут при комнатной температуре в темноте до появления тёмно-голубого окрашивания. Для остановки реакции и окончательного окрашивания во все лунки вносили по 100 мкл стоп-раствора (1М раствор Н3РО4), тщательно перемешивали на шейкере, после чего измеряли абсорбцию раствора, приобретшего желтый цвет. По результатам измерения оптической плотности в лунках со стандартными растворами каспазы-9 строили калибровочную кривую зависимости поглощения раствора при 450 нм от содержания каспазы-9. Используя полученный график, определяли концентрацию исследуемого белка в смешанной слюне в нг/мл и гомогенатах СОПР в нг/мг ткани.
Гистологический метод исследования Гистологическое исследование проведено в 108 образцах СОПР. Забор материала производили во время оперативного вмешательства, под местной анестезией. Образцы ткани фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, заливали в парафин. Срезы толщиной 7-10 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, пирофуксином по ван-Гизону, орсеином на эластические волокна. Микропрепараты исследовались при помощи светового микроскопа Leika DM 2000 (Германия) на увеличениях от х25 до хЮОО. Микрофотографии получали с помощью компьютерной программы AxioVision.
Исследование количества аннексина V и каспазы-9 в биоптатах слизистой оболочки полости рта у пациентов с веррукозной формой лейкоплакии
Выявлена сильная высокодостоверная корреляционная связь в количестве аннексина V в смешанной слюне и в участках СОПР, поражённых веррукозной формой лейкоплакии (г=0,7488% р=0,0001), то есть наблюдаемое увеличение содержания данного белка в смешанной слюне несомненно связано с повреждением клеток СОПР опосредованное выбросом аннексина V в ротовую полость (рис.29).
В то же время, несмотря на увеличение количества каспазы-9 в участках гиперплазии СОПР, она не поступает в смешанную слюну, что подтверждено на рисунке 30.
Таким образом, наши исследования количества аннексина V и каспазы-9 в участках гиперплазии СОПР показали, что гиперкератоз характеризуется снижением количества мембраносвязанного кальций-связывающего белка аннексина V и это свидетельствует о повреждении мембран клеток. Выявленные изменения в количестве фермента, участвующего в реакциях апоптоза - каспазы-9, находятся в тесной зависимости от площади поражения СОПР и не зависят от продолжительности заболевания. Каспаза-9 в отличие от аннексина V практически не выделяется в окружающую среду. 3.4. Морфологическое исследование биоптатов, полученных из участков слизистой оболочки полости рта пациентов с веррукозной формой лейкоплакии
Всем пациентам производили биопсию СОПР в участке поражения лейкоплакией. При патогистологическом исследовании оценивали состояние тканевых элементов, характер и степень поражения тканей. Установлено, что морфологическая картина веррукозной формы лейкоплакии имеет ряд характерных признаков, которые в целом могут быть охарактеризованы как гиперпластические процессы (рис.31 Б). Надо отметить, что во всех случаях степень гиперплазии многослойного плоского эпителия имеет выраженный характер, практически всегда с явлениями акантоза и с различными вариантами ороговения - гипер - или паракератоза, а иногда и того и другого одновременно. Гиперплазия эпителия во всех наших наблюдениях происходила в основном за счёт шиповатого и базального слоев. Цитоплазма клеток этих слоев зернистая и в разной степени содержит кератогиалин. Наблюдается наличие воспалительной реакции в субэпителиальной зоне и проникновение гистиоцитов и лимфоидных клеток через очаговую расщеплённую базальную мембрану эпителия. Повышенное содержание вокруг сосудов по ходу инфильтратов с межволокнистым склерозом полисахаридов, в том числе гликозаминогликанов, является адекватной реакцией в субэпителиальной зоне. У пациентов с веррукозной формой лейкоплакии слизистой оболочки полости рта в некоторых случаях выявлялась микроскопическая картина дисплазии различной степени тяжести. Рис. 31. Гистологический срез слизистой оболочки полости рта. А) интактная СОПР; б) участок веррукозной лейкоплакии СОПР. Окраска гематоксилином и эозином (хЮО).
Таким образом, наши гистологические и биохимические исследования участков СОПР, поражённых веррукозной формой лейкоплакии выявили существенные сдвиги в состоянии клеток СОПР, которые по своим характеристикам приближаются к изменениям, наблюдаемым при карциноме. Этим можно объяснить неэффективность терапевтического лечения данной формы лейкоплакии и необходимость хирургического вмешательства
После клинического обследования до начала операции пациенты по показаниям направлялись к гастроэнтерологу, урологу, гинекологу и другим специалистам широкого профиля. Для устранения микротравм в полости рта и санации полости рта пациенты с веррукозной формой лейкоплакии направлялись в терапевтическое и ортопедическое отделения Центра Стоматологии и челюстно-лицевой хирургии ГОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития России. Методом случайной выборки, независимо от вида веррукозной лейкоплакии, все обследованные пациенты были поделены на 4 группы по методике хирургического лечения. Пациентам I группы иссечение патологического очага проводили излучением ErrYAG-лазера, пациентам II группы излучением СОг-лазера, пациентам III группы сочетанным воздействием излучения EnYAG и СОг лазеров, а пациентам IV группы иссечение СОПР проводили режущим хирургическим инструментом.
После операции всем пациентам назначалось полоскание 0,05% раствором хлоргекседина, аппликации облепиховым маслом местно, приём комплекса ") витаминов группы А, Вг, Віг. Во избежание повреждения операционной раны рекомендовалось проведение щадящей гигиены полости рта (ирригатором, мягкими зубными щётками, ополаскивателями) и приём измельчённой, жидкой пищи. В послеоперационном периоде состояние пациентов оценивали по следующим показателям: изменение температуры тела, выраженность послеоперационного болевого синдрома и коллатерального отека, гиперемия тканей в послеоперационной области, особенности сроки заживления раны по скорости сокращения площади фибринозной пленки, эпителизации и формирования рубца.
Результаты хирургического лечения пациентов с веррукозной формой лейкоплакии слизистой оболочки полости рта сочетанным применением излучения EnYAG и С02 лазеров
До настоящего времени, помимо консервативного лечения, наиболее часто иссечение патологических участков, поражённых лейкоплакией СОПР, проводилось с помощью хирургического скальпеля, криовоздействия, излучения С02 лазера и др. (Михайловский А.В., Сулейманова Г.Г., 1988; Барер Г.М., Ремизов СМ. 1989; Боровский Е.В., 2003; Евсеева И.К., 2000; Chiesa F. et al., 1990). Результаты клинических и биохимических исследований доказали эффективность хирургического лечения тканей полости рта с использованием излучения лазера по сравнению с традиционным методом (Куртакова И.В., 2009; Тарасенко И.В. с соавт., 2010; Штрунова Л.Н., 2011 и др.). Было показано, что с помощью лазерных технологий достигается наиболее полное иссечение патологически изменённых тканей, имеется хороший обзор операционного поля, в послеоперационном периоде не требуется назначения антибиотикотерапии и противовоспалительных препаратов. Заживление раны происходит без образования грубых рубцов с более ранней эпителизацией (Тарасенко И.В., 2009; Штрунова Л.Н., 2011). В нашем исследовании участвовало 55% пациентов работоспособного возраста. Применение лазерных технологий способствовало быстрому возвращению пациентов к нормальной жизни и сокращению сроков пребывания на больничном листе. Так при использовании лазерных технологий пребывание на больничном листе в среднем составило 1,5 дня, то после иссечения СОПР скальпелем эти сроки были продлены до 6,5 дней.
По данным J. Ishii с соавт. (2003) использование стандартных хирургических инструментов приводило к раковому перерождению в 38,1% случаях, а применение лазерного излучения только в 9% случаях. Поэтому применение лазерных технологий в лечении лейкоплакии СОПР более обосновано, чем стандартное хирургическое. Поскольку наиболее распространено лечение лейкоплакии СОПР с помощью излучения СОг лазера, то для сравнения была выделена группа пациентов, у которых участок поражения иссекали С02 лазером со следующими параметрами: длина волны 10,6 мкм, мощность 3 Вт и частота 15 Гц. Предложенная нами методика несколько отличается от методик описанных MX. Schoelch с соавт. (1999), S. Betlejewski с соавт. (1997) и P.S. van der Hem с соавт. (2005). Операция иссечения участка СОПР, пораженного веррукозной формой лейкоплакии излучением С02 лазера проходила бескровно с образованием глубокого коагуляционного слоя, покрывающего всю раневую поверхность, с участками карбонизации черного цвета. Учитывая то, что иногда поражённый участок СОПР в ряде случаев обширен и не имеет чётких границ, данная методика позволяет полностью охватить патологическую зону. Послеоперационный период протекал без осложнений, и окончательная эпителизация раны наступала только к 14±0,5 дню. Количество аннексина V в смешанной слюне уже на 3-й день заживления раны приближалось к норме. Наблюдения в отдалённые сроки показали, что у 3-х пациентов имелся рецидив заболевания. Кроме того, во время операции с применением С02 лазера невозможно получение биопсийного материала для гистологического исследования, так как данным способом мягкие ткани подвергаются выпариванию.
Ранее были получены положительные результаты при иссечении мягких тканей полости рта излучением эрбиевого лазера (Тарасенко СВ. с соавт., 2006; Тарасенко И.В. с соавт., 2010; Штрунова Л.Н., 2011 и др.). Это явилось основанием для использования данного вида излучения для удаления патологического очага на СОПР в случае развития лейкоплакии. Согласно нашей методике, защищенной патентом РФ, иссечение участка СОПР с лейкоплакией производили сфокусированным лучом EnYAG лазера при диаметре светового пятна 0,05 см (длина волны 2940 нм, мощность 4 Вт, длительность импульса 700 мкс в режиме «long», энергией 300 мДж, частотой 20 Гц, время экспозиции 15 с на 1 см с водно-воздушным спреем), отступая позади края очага поражения на 0,5 см и постепенно углубляясь в толщу слизистой оболочки на 0,5 см до полного её иссечения. Сапфировый фибер при этом находился на расстоянии не более 0,5 см от поверхности ткани. Затем раневую поверхность обрабатывали расфокусированным лазерным лучом на расстоянии 1,5 - 2 см в режиме коагуляции без водно-воздушного аэрозоля, с мощностью 4 Вт, длительностью импульса 700 мкс в режиме «long», с энергией 300 мДж, частотой 20 Гц, временем экспозиции 15 с на 1 см . Круговыми движениями фибера формировали коагуляционную пленку по всей раневой поверхности. Отмечался хороший обзор операционного поля, и имелась возможность иссечения фрагмента слизистой оболочки в заданном объеме. Данная методика позволяет иссекать пораженный фрагмент слизистой оболочки целиком без его повреждения, что является большим преимуществом при получении материала для биопсии. Кроме того, скорость заживления раны была в 2 раза меньше по сравнению с операцией, проводимой излучением СОг лазера и с помощью скальпеля. В послеоперационном периоде болевые ощущения и коллатеральный отёк были менее выражены или отсутствовали совсем. Однако, в процессе операции раневая поверхность несколько кровоточила, а содержание аннексина V в смешанной слюне повышалось. Это послужило отправным моментом для поиска оптимальной методики с применением лазерных технологий.
Предложенная нами методика сочетанного применения излучения. ,;, эрбиевого и углекислого лазера позволила иссекать пораженный слой СОПР эрбиевым лазером и формировать ещё более глубокий коагуляционный слой, покрывающий всю раневую поверхность, с участками карбонизации черного цвета, в отличие от воздействия излучения только СОг лазера. Такая комбинация лазерного излучения с разной глубиной проникновекния способствовала улучшению интраоперационного гемостаза, ускорению процессов заживления послеоперационной раны до 7 дней, снижению риска возникновения воспалительных осложнений и рецидива заболевания. После применения этой методики для иссечения участка лейкоплакии СОПР уровень аннексина V в слюне на 10-й день приближался к значениям нормы.
Таким образом, полученные результаты показывают, что при веррукозной форме лейкоплакии слизистой оболочки полости рта активируется внутренний путь включения развития апоптотических реакций, при этом страдает система защиты мембран, что выражается в резком уменьшении в биоптатах СОПР белка аннексина V и наличия в высоких количествах каспазы-9. Уменьшение аннексина V в биоптатах СОПР сопровождается увеличением его количества в смешанной слюне. Полученные нами результаты имеют большое значение для клинической практики, поскольку они показывают, что апоптоз при веррукозной форме лейкоплакии СОПР становится необратимым и процессы регенерации замедлены. Поэтому возникает необходимость хирургического лечения для радикального иссечения поражённых участков и наилучшие результаты получены в случае иссечения участков СОПР с лейкоплакией излучением Er:YAG лазера и комбинации лучей EnYAG и СОг лазеров.
