Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления о регенерации костной ткани (обзор литературы) 11
1.1. Морфологические особенности костной ткани 11
1.2. Структурные основы и регуляция физиологической регенерации костной ткани 16
1.3. Репаративный остеогснез и влияние на него различных факторов 26
Глава 2. Материал и методы исследования 42
2.1. Моделирование повреждений костной ткани и хронической эндогенной интоксикации 42
2.2. Морфологические методы исследования 49
2.3. Методы морфометрии и математической обработки данных 51
Глава 3. Влияние хронической эндогенной интоксикации на репаративную регенерацию костной ткани (собственные исследования) 53
3.1. Результаты спонтанной регенерации переломов нижней челюсти 53
3.1.1. Общая динамика формирования костной мозоли 53
3.1.2. Оценка регенераторного потенциала клеток 58
3;2. Репаративная регенерация костной ткани нижней челюсти при хронической эндогенной интоксикации 61
3.2.1. Общая макро- и микроскопическая характеристика... 61
3.2.2. Оценка регенераторного потенциала клеток 66
3.3. Репаративный остеогепез при переломах нижней челюсти на фоне хронической эндогенной интоксикации 70
3.3.1. Общая динамика формирования костной мозоли 70
3.3.2. Оценка регенераторного потенциала клеток 77
3.4. Уровень эндогенной интоксикации и его взаимосвязь с количественными характеристиками регенераторного процесса в костной ткани (корреляционный анализ) 83
Обсуждение полученных результатов 89
Выводы 100
Практические рекомендации 102
Список литературы 103
- Морфологические особенности костной ткани
- Репаративный остеогснез и влияние на него различных факторов
- Моделирование повреждений костной ткани и хронической эндогенной интоксикации
- Результаты спонтанной регенерации переломов нижней челюсти
Введение к работе
Актуальность работы
В настоящее время среди причин смертности и инвалидности в России, травмы вышли на второе место, уступая лидерство лишь сердечнососудистым заболеваниям. Травмы челюстно-лицевой области составляют до 8% всех травматических заболеваний человека [Вернадский Ю. И., 1999; Фомичев Е. В., 1999, 2002; Робустова Т. Г., 2000, 2004; Нарциссов А. Т., Занделов В. Л., 2001; Ефимов Ю. В., 2004; Puelacher W. С, et al., 1996; Woelfel J. В., et al., 1997; Schliephake H., et al., 2001; Budai M., et al., 2003; Mien K. C, et al, 2004; Schimming R., Schmelzeisen R., 2004; Valenzuela A. P., et al., 2005; Yuan H., et al., 2006].
В регуляции репаративной регенерации костной ткани после переломов и комбинированных травм существенное значение имеет соотношение нервных, эндокринных и иммунных механизмов регуляции остео-генеза, которые на тканевом уровне реализуются целым пакетом биологически активных медиаторов [Шапошников Ю. Г., 1997; Маланин Д. А., 2002; Корнилов Н. В., Грязнухина Э. Г., 2006; Lane J. М., et al., 1999; Ying Q. L., 2002]. Именно они регулируют рост и дифференцировку остеобла-стического, остеокластического, сосудистого и соединительнотканного ростков, в итоге формирующих функционирующую кость. При нарушениях регуляторных механизмов репаративного остеогенеза происходит пато-
логическое ремоделирование костной ткани и формирование структурно и функционально неполноценного регенерата [Ревелл П. А., 1993; Рожин-ская Л. Я., 2006; Petite Н., et al., 2000; Cancedda R., et al., 2003; Aghaloo Т., et al., 2006; Graziano A., et al., 2007; Meijer G.J., et al., 2007].
Одним из факторов, влияющих на регенерацию костной ткани, является воздействие различных токсических веществ, в том числе и эндогенных токсических соединений (ЭТС). Хронический эндотоксикоз (ЭТ) относится к многокомпонентным процессам и наблюдается при различных фоновых заболеваниях, конкурирующей патологии, развиваясь на фоне вегетативной и эндокринной дисрегуляции [Бондаренко В. М. с соавт., 2002; Мишнев О.Д. с соавт., 2001, 2003; Фролов В.И., 2004; Новочадов В. В., Писарев В. Б., 2005; Богомолова Н. В., 2005; Аниховская И. А. с соавт., 2006; Гринберг Л. М., Руднов В. А., 2006; Diomede L., et al., 2001; Bolger A. P., et al., 2002; Foster J. A., et al., 2002; Karayaylali I., et. al., 2003; Baron R.M. et al., 2006; RemickD. G., 2007].
В силу этого, представляет интерес разрешение актуальной задачи установления особенностей остеорегенерации на фоне хронического ЭТ. Данное решение на настоящем этапе знаний возможно только в эксперименте.
Цель работы — установить особенности репаративного остеогенеза при переломах нижней челюсти у крыс на фоне хронического эндотокси-коза.
Задачи исследования
Изучить влияние хронического эндотоксикоза на регенеративный потенциал клеток костной ткани нижней челюсти интактных крыс.
Выявить особенности репаративной регенерации костной ткани при переломе нижней челюсти на фоне хронического эндотоксикоза.
Сопоставить характер морфологических нарушений репаративного остеогенеза с длительностью и выраженностью хронического эндотоксикоза.
Разработать количественные критерии для оценки костного регенерата с целью прогнозирования нарушений репаративного остеогенеза при переломах нижней челюсти.
Научная новизна
В работе впервые показано влияние хронического ЭТ различной выраженности и продолжительности на процессы остеорегенерации. Выявлены наиболее информативные особенности репаративного остеогенеза при переломах нижней челюсти на фоне хронического ЭТ: длительное присутствие очагов соединительнотканного замещения, потеря или позднее формирование зональности костного регенерата, низкий уровень PCNA-позитивных клеток и высокое содержание остеобластов в костном регенерате, относительно малая васкуляризация регенерата.
Выявлены сильные корреляционные связи между основными количественными характеристиками костного регенерата и маркерами хронической эндогенной интоксикации.
Научно-практическая значимость
Полученные данные расширяют современные представления о характере и динамике заживления переломов костей при наличии хронической эндогенной интоксикации. Нестабильность клеточного состава и минерализации при переломах челюстей на фоне хронического ЭТ является основанием для коррекции не только процесса репаративного остеогенеза, но и уровня эндогенной интоксикации.
Наличие хронической эндогенной интоксикации у больных с переломами нижней челюсти и сопутствующей соматической патологией требует выявления структурно-функциональных изменений костной ткани с проведением дополнительных методов исследования (рентгеноденсито-метрии).
Предложенные автором количественные критерии для оценки костного регенерата позволят прогнозировать нарушения процессов репаративного остеогенеза и осуществлять их профилактику.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Хроническая эндогенная интоксикация приводит к нарушениям
репаративнои регенерации костной ткани челюстей, в результате чего формируется структурно и функционально неполноценный регенерат.
Регенерация костной ткани после перелома в существенной степени зависит от уровня хронической эндогенной интоксикации, на фоне которой формируется остеопороз и снижается регенераторный потенциал ткани.
Оценка регенераторного потенциала, васкуляризации и остеобла-стического представительства в регенерате позволяет прогнозировать его структурные и функциональные свойства как в условиях спонтанного заживления, так и на фоне хронической эндогенной интоксикации.
Апробация работы и публикации
Основные результаты исследования докладывались и обсуждались на VIII-X конференциях молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2004-2006), VI Общероссийской конференции «Гомеостаз и эндоэкология» (Хургада, 2006), научно-практической конференции, посвященной 75-летию со дня рождения В. Ю. Миликевича (Волгоград, 2007), научно-практической конференции «Современные проблемы пато-морфологии», посвященной 110-летию со дня рождения Л. Н. Попова (Тверь, 2007).
Апробация работы проведена на расширенном заседании кафедр терапевтической, хирургической, ортопедической стоматологии, стоматологии детского возраста, пропедевтики стоматологических заболеваний, стоматологии ФУВ, патологической анатомии с секционным курсом и курсом
10 патологии Волгоградского государственного медицинского университета
22 апреля 2008 года.
По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе одна — в журнале «Вестник Волгоградского государственного медицинского университета», включенном в действующий «Перечень .... ВАК».
Внедрение результатов исследования
Материалы диссертации внедрены в учебный процесс кафедр хирургической стоматологии, стоматологии детского возраста, патологической анатомии, судебной медицины Волгоградского государственного медицинского университета. Практические рекомендации используются в работе Волгоградского научного центра РАМН и Администрации Волгоградской области и Волгоградского областного патолого-анатомического бюро.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 130 странице машинописного текста, содержит 11 таблиц, иллюстрирована 31 рисунком. Она состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной материалам и методам исследования, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций. Список использованной литературы содержит 197 источников (108 на русском и 89 на иностранных языках).
Морфологические особенности костной ткани
В современном мире одной из значимых медико-социальных проблем является травматизм. Особенное значение имеют бытовые и производственные травмы. В структуре травм переломы челюстно-лицевой области составляют примерно 8% от всех переломов [Мэйгоун Г. И., 1992; Луцкая И. К., 2000; Робустова Т. Г., 2004; Ефимов Ю. В., 2004; Нарциссов А. Т., Занделов В. Л., 2001; Woelfel J. В., et al., 1997; Schliephake H., et al., 2001; Julien K. C, et al., 2004; Budai M., et al., 2003; Schimming R., Schmelzeisen R., 2004; Valenzuela A. P., et al., 2005; Yuan H., et al., 2006]. Важно, что с возрастанием количества переломов снижается трудоспособность, качество жизни и производительность труда. Помимо трудностей лечения и реабилитации переломов, существуют условия, препятствующие нормальной регенерации костной ткани [Волков М. В., Оганесян О. В., 1986; Корнилов Н. В., Грязнухина Э. Г., 2006; Moos К. F., 2002].
Костная ткань является биологическим композитом, главными компонентами которого являются костные клетки, волокнистые коллагеновые структуры, минерализованное основное вещество, система интерстициаль-ных каналов. Зрелая костная ткань может быть губчатой или компактной. К клеткам костной ткани относятся остеогенные клетки, остеобласты, остео-циты и остеокласты [Волков М. В., Оганесян О. В., 1986; Мэйгоун Г. И., 1992;WadaY.,etal., 1998].
Остеогенные клетки — остеобласты (малодифференцированные соединительнотканные клетки) являются камбиальными элементами костной ткани и происходят от клеток соединительной ткани или стромальных стволовых клеток. Такая точка зрения согласуется с общепринятой сегодня камбиальной теорией, указывающей на строгую специфичность и детерминированность источников костеобразования [Фрейдлин И. С, Шейкин Ю. А., 2001; Choi M.G.etal., 2005].
Более популярная ранее метапластическая теория усматривала источниками остеогенеза преобразованные специализированные элементы других тканей. Некоторые исследователи до сих пор признают отдельные положения камбиальной и метапластической теории. Остеогенные клетки находятся преимущественно в наиболее глубоком слое надкостницы, покрывающей наружную поверхность кости, эндосте, выстилающем костномозговую полость, в прослойках рыхлой волокнистой соединительной ткани в каналах остеонов и промежутках между балками грубоволокнистой костной ткани, то есть располагаются около костеобразующей и костной поверхности [Корнилов Н. В., Грязнухина Э. Г., 2006; Wada Y., et al., 1998].
Остеобласты — клетки, синтезирующие большую часть органического костного матрикса в период костеобразования. Это крупные отросчатые клетки округлой или овальной формы. Для них характерно хорошее развитие гранулярного эндоплазматического ретикулума, наличие большого количества свободных рибосом и митохондрий. Остеоциты — зрелые дифференцированные костные клетки, обеспечивающие целостность костного матрикса и участвующие в регуляции его гомеостаза. В цитоплазме остео-цитов гораздо меньше органелл, чем у остеобластов [Пальцев М. А., Аничков Н. М., 2001; Anderson J. М., Davies J. Е., 2000; Fink М. P., 2001; Choi M. G. et al., 2005; Franssen B. G. M., et al., 2008].
Остеокласты — клетки, осуществляющие резорбцию костной ткани. Характерным признаком остеокластов является их многоядерность и большой размер. В цитоплазме остеокластов имеется большое количество свободных рибосом, иногда встречаются кристаллы и остатки коллагено-вых фибрилл. Остеокласты происходят из циркулирующих мононуклеар-ных клеток (моноцитов) и в конечном итоге из кроветворных стволовых клеток (Лаврищева Г. И., Оноприенко Г. А., 1996; Cui W. et al., 2007; Teitelbaum S. L., 2007).
Волокнистые коллагеновые структуры представлены сложной иерархической системой, которая включает коллагеновые молекулы, микрофибриллы, волокна и волокнистые комплексы. Основа этих структур -коллагеновый белок - составляет около 95% органического матрикса кости. Коллагеновые волокна имеют плоскую, уплощенную или цилиндрическую форму.
Репаративный остеогснез и влияние на него различных факторов
Репаративная регенерация - восстановление клеток и тканей, разрушенных или утраченных в результате внешнего повреждения. Кость способна восстанавливать дефекты путем образования полноценной костной ткани. Морфофункциональные преобразования, происходящие в области травматического повреждения костной ткани — перелома — позволяют выделить 3 фазы в течении репаративного процесса [Корнилов Н. В., Грязну-хина Э. Г., 2006; Ying Q. L. et al., 2002].
По мнению А. М. Зайдмана с соавт. (2006), воспаление можно рассматривать как один из этапов (первый) репаративной регенерации кости. Оно носит стимулирующий характер, включая механизмы бактерицидного и цитотоксического действия, однако при неблагоприятных условиях воспалительный процесс может осложниться замедленной консолидацией, образованием ложных суставов [Бутюгов А. А., 1997; Шапошников Ю. Г., 1997; Курляндский Б. А., Филов В. А., 2002; Brade Н., et al., 1999; Zhang К., etal.,2006].
В первые несколько дней после перелома в костномозговом канале отломков и межотломковой щели определяются кровоизлияния, тканевые кисты, фибриновые нити, распадающиеся эритроциты, скопления лейкоцитов, макрофагов. В кортикальном диафизарном слое концов отломков значительная часть клеток-остеоцитов не проявляет признаков жизнеспособности. Надкостница отломков утолщена, пучки её коллагеновых волокон выглядят набухшими, часть клеток-фибробластов вблизи зоны повреждения, подобно остеоцитам, имеют неокрашивающиеся ядра. В окружающих мягких тканях отмечается вазодилятация, эксудация плазмы. Присутствующие в области повреждения некротизированные ткани поддерживают воспалительную реакцию. В зону перелома мигрируют полиморфноядерные лейкоциты, макрофаги. Выраженность фазы воспаления определяет развитие второй фазы регенерации костной ткани [Маланин Д. А., 2002; Снигур Г. Л., 2004; Dvorak Н. F. et al., 1987; Liu R. et al., 2006].
Вторая фаза - репарация - происходит путем организации гематомы с образованием фибринового сгустка. Характерная для воспаления и стимулирующая его развитие кислая среда в зоне повреждения сменяется на нейтральную или даже слабощелочную. Уже к 4-5-му дню в межотломковой щели выявляется рыхлая, волокнистая, богатая ретикулиновыми волокнами и сосудами ткань. Заживление перелома происходит при участии мезенхи-мальных плюрипотентных клеток [Roberts W. Е., 1988; Yano К., et al., 2006]. На этой стадии они равным образом могут дифференцироваться в предшественников фибробластов, хондробластов или остеобластов, синтезирующих, соответственно, элементы соединительной, хрящевой или костной ткани. Естественный резерв плюрипотентных клеток связан с камбиальным слоем надкостницы, эндостом, костным мозгом. Клетки-предшественники могут быть привнесены организмом в область повреждения из других отделов костной системы и, главным образом, костного мозга, где на протяжении жизни сохраняются стволовые и малодифференцированные клетки. Велика роль врастающих в область перелома сосудов (капилляров, артериол, венул), которые в своем эндотелии содержат плюрипотентные клетки, называемые перицитами [Клишов Ф. Ф., 1984; Оноприенко Г. А., 1993; Фрейд-лин И. С, Шейкин Ю. А., 2001; Снигур Г. Л., 2004; Yuan Н., et al., 2006].
Образующаяся в гематоме клеточная популяция начинает активно продуцировать ткань будущей костной мозоли: волокнистую, хрящевую, костную. Эта ткань, располагаясь вокруг кости, связывает между собой костные отломки, уменьшая подвижность между ними. На этом этапе в процессе регенерации активное участие принимает семейство высокоспецифических медиаторов — костных морфогенетических протеинов BMP [Hanada К., et al., 1997; Osyczka A. M., et al., 2004].
Преимущественное развитие того или иного вида ткани определяется характером обменных процессов, устанавливающихся в зоне перелома. Хорошее кровоснабжение или аэробный тип обмена благоприятствует развитию костной ткани — наоборот, низкий уровень оксигенации предполагает развитие соединительной или хрящевой ткани. В условиях хорошего кровоснабжения анатомично сопоставленных, прочно удерживаемых костных отломков может происходить образование костной мозоли непосредственно из элементов костной ткани, минуя процесс замещения соединительной и хрящевой ткани.
Моделирование повреждений костной ткани и хронической эндогенной интоксикации
Контрольные группы формировались для каждой серии экспериментов с учетом пола и возраста животных, во всех случаях определены границы биологической нормы для всех тестируемых показателей.
Перелом нижней челюсти проводили у крыс в типичном месте, общепринятом для экспериментальных исследований [Moos К. F., et al., 2002; Zhang X., Teng Y.. A., 2006]. Для этого под нембуталовым наркозом у крыс делали надсечение мягких тканей десны с буккальной и лин-гвальной сторон в проекции и несколько дистальнее правого резца нижней челюсти (рис. 2). ) под наркозом у крысы опытной группы
Затем заводили инструмент под мягкие ткани, прижимали к обнаженной надкостнице и надламыванием-скусыванием с качательными движениями (10-15 градусов) в сагиттальной плоскости) добивались визуального диастаза в 1 мм (рис. 3). После этого производили механическое восстановление анатомической конгруэнтости альвеолярного отростка и нижней челюсти. Операцию завершали микрошинированием резца и альвеолярного отростка к одноименным прилежащим структурам слева. Мягкие ткани не ушивали для контроля дренажа в первые часы после операции, в дальнейшем мягкие ткани закрывались спонтанно в течение суток, скобки снимали на 7-е сутки.
Поскольку по гистологическим препаратам определить точно зрелость (минерализацию) кости невозможно, то проводили рентгенографию образцов всех групп животных, а у части животных на нативных образцах кости, освобожденных механическим путем от эндоста и периоста, проводили рентгеноденситометрические измерения в двух точках каждого образца: в центре костного дефекта и на его крае. Рентгеноденситометрию проводили на аппарате «SIRONA SIDEXIS» (Франция) при полноте оцифровки изображения 600 dpi в реальном масштабе, в вертикальной и боковой проекциях (рис. 4).
Моделирование хронической эндогенной интоксикации проводили путем многократного введения доз тетрахлорметана (ТХМ) и бактериального липополисахарида (ЛПС). Эта модель разработана проф. В. В. Ново-чадовым (2000-2002) и с успехом используется на кафедре патологической анатомии Волгоградского государственного медицинского университета (Фролов В.И., 2004; Ахмед Итемезех, 2006; Новочадов В. В., Писарев В. Б., 2005; Калашникова С. А. с соавт., 2007). Данная модель рассматривается как хронический эндотоксикоз с преимущественным поражением печени. При введении только одного ТХМ токсический гепатит и гепатофиброз с печеночной недостаточностью убедительно воспроизводятся к 30-м сут. эксперимента, а к 90-м сут. удается воспроизводить более выраженные нарушения, связанные с формированием цирроза печени.
Поскольку в норме в портальный кровоток проникает довольно
значительное количество эндогенных токсических соединений, недостаточная детоксикация их в печени при ее хронической недостаточности способствует развитию эндотоксикоза [Богомолова Н. В., 1993, 2005; Яковлев М. Ю., 2000; Swank G. М., et al., 1996]. Бактериальный ЛПС вызывает повреждение энтероцитов, что приводит к резкому повышению проницаемости кишечного барьера и выходу из просвета эндогенных токсических соединений. Действие его на гепатоциты и Купферовские клетки приводит к выбросу большого количества медиаторов вазотроп-ного и цитотоксического действия, а детоксикационные процессы частично блокируются, что приводит к повышенному транзиту токсинов в системный кровоток. В работе использовались ЛПС S.Thyphi (Sigma, USA), обладающий хорошо известными токсикологическими характеристиками [Лиходед В. Г. с соавт. 1996; Evans S. М.3 et al., 2002; Bertok L., 2005; Mueller.M., et al., 2005].
Результаты спонтанной регенерации переломов нижней челюсти
Регенераты костной мозоли на 14-е сут. представляли собой легко кровоточащие при прикосновении мягкотканные образования розового цвета и эластической консистенции, расположенные между нормальной костной тканью. К 30-м сут. эксперимента место перелома было заполнено тканью бледно-розового цвета, которая несколько выступала над уровнем окружающего кости альвеолярного отростка и была полностью сращена с ней. По прошествии 60 сут. макроскопически у крыс группы сравнения место перелома было неотличимо от окружающей костной ткани нижней челюсти и регенерат уже не выступал над ее поверхностью.
Ткань регенерата на 14-е сут. эксперимента состояла из тонких пучков коллагеновых волокон и плотно прилежащих друг к другу широких пучков, имеющих продольную ориентацию, из многочисленных групп малодифференцированных клеток, большого количества сосудов капиллярного типа. Вокруг последних отмечалась выраженная пролиферация других клеток - перицитов. В промежутках между волокнистыми структурами наблюдались очаги свободно расположенных эритроцитов. Клеточную популяцию новообразованной ткани можно было условно разделить на два типа. Первый тип (до 20-30% от общего количества) составляли овальной формы клетки с гиперхромным ядром, которые находились в рыхлой аморфной эозипофильной массе. Второй тип (70-80%) представляли клетки вытянутой формы, имеющие менее интенсивно окрашенное ядро.
На 30-е сут. больший объем регенерата был представлен очагами энхондрального остеогенеза. Он заключался в образовании скелетоген-ных клеточных элементов - остеобластов и трабекул, направленных вдоль основных пучков коллагеновых волокон (рис. 6, 7).
Грубоволокнистая костная ткань встречалась очагами в виде первичных костных балок, ориентированных вдоль широких коллагеновых волокон и вертикальных сосудистых петель, и клеток остеобластического ряда с большим ядром и светлой цитоплазмой. Рис. б. Формирование костной ткани путем энхондрального остеогенеза в зоне перелома нижней челюсти, 30-е сутки. Окраска гематоксилином и эозином. Окуляр хЮ, объектив 10. Рис. 7. Энхондральный остеогенез в зоне перелома нижней челюсти, 30-е сутки. Формирование преимущественно хрящевой (центр) и соединительной ткани (справа внизу). Окраска гематоксилином и эозином.
Окуляр хЮ, объектив 40. Менее зрелые формы остеобластов находились в эозинофильно окрашенном основном веществе, имеющем нитевидную волокнистую структуру. Интересно было заметить, что в краевых отделах регенерата имело место значительное усиление пролиферативной и синтетической активности клеток хондрального ряда, которые формировали типичные изогенные группы и продуцировали межклеточный матрикс, выступающий за пределы границы суставной поверхности.
Остеобластокластическая резорбция отдельных костных балок (внизу) и формирование остеоидных балок (вверху). Зона перелома, 60-е сутки. Окраска гематоксилином и эозином. Окуляр х10, объектив 40.
На 60-е сут. регенерат был представлен преимущественно зрелой костной тканью (на 60-70% объема) и волокнистой хрящевой, которая располагалась по наружным краям бывшего перелома и мелкими очагами - в глубине регенерата (рис. 8).
При морфометрии было показано, что заживление переломов нижней челюсти проходит определенную стадийность, легко различимую при анализе объемных долей основных компонентов регенерата и плотности его клеточных элементов. На 14-е сут. в регенерате преобладает соединительная ткань, а количество остеобластов и остеоцитов невелико. К 30-м сут. уменьшается представительство соединительной ткани, значительно возрастает доля сосудов в объеме регенерата, появляются элементы костной ткани. К 60-м сут. в количественном отношении регенерат мало отличим от обычной костной ткани нижней челюсти (табл. 2).
