Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Полость рта как локальная экологическая система и методы изоляции операционного поля в стоматологической практике (обзор литературы) 9
1.1. Компоненты экосистемы полости рта 9
1.2. Микрофлора полости рта и ее изменения при кариесе и его осложнениях. Роль межклеточных взаимодействий 13
1.3. Изменение иммунных показателей полости рта при кариесе 19
1.4. Методы изоляции операционного поля в стоматологии 23
1.5. Преимущества и недостатки работы с коффердамом 28
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 32
2.1 Материалы исследования 32
2.1.1. Критерии включения, невключения и исключения пациентов из исследования 32
2.1.2. Стоматологическое обследование пациентов 37
2.1.3. Инструменты системы коффердам, использованные для эндодонтического лечения и реставрации зубов 44
2.1.4. Материалы, использованные для эндодонтического лечения и реставрации зубов 45
2.2. Лабораторные методы исследования 46
2.2.1. Анализ клеток зубодесневой борозды и клеток, снятых с завесы коффердама 46
2.2.2. Анализ популяций и субпопуляций клеток 49
2.2.3. Оценка фрагментации ДНК методом проточной цитометрии 51
2.2.4. Применение мультиплексного анализа для определения бактериальной контаминации полости рта 52
2.2.5. Модельные системы для определения биологической безопасности детрита зубов и эффективности защиты полости рта системой коффердам 53
2.3. Статистическая обработка данных 56
ГЛАВА 3. Клинико-лабораторное обоснование биобезопасности применения коффердама в стоматологии (собственные исследования) 58
3.1. Результаты анкетирования и клинических исследований 58
3.1.1. Результаты анкетирования врачей и пациентов 58
3.1.2. Отдаленные результаты лечения клиновидного дефекта 60
3.1.3. Отдаленные результаты лечения кариозных поражений 64
3.2. Результаты лабораторного и экспериментального исследования 67
3.2.1. Влияние коффердама на апоптоз клеток полости рта 67
3.2.2. Коффердам как средство защиты операционного поля в эндодонтии от бактериальной инфекции 78
3.2.3. Биологические эффекты детрита зубов в модельной системе на клетках животных in vivo 84
ГЛАВА 4.Обсуждение результатов и заключение 91
заключение 96
выводы 98
практические рекомендации 99
список литературы
- Компоненты экосистемы полости рта
- Микрофлора полости рта и ее изменения при кариесе и его осложнениях. Роль межклеточных взаимодействий
- Критерии включения, невключения и исключения пациентов из исследования
- Влияние коффердама на апоптоз клеток полости рта
Введение к работе
Актуальность темы
Высокий риск контаминации стоматологов вирусными и бактериальными инфекциями, в том числе особо опасными, возникающий при препарировании зуба, снятии зубного камня, эндодонтических и других манипуляциях определил развитие целого научного и практического направления в стоматологии (Discacciati J. et al., 1998). Основной целью этого направления является защита врача от инфекции при создании удобного доступа к операционному полю, комфортных условий для пациента, а также повышение эффективности самого лечения. Этим условиям удовлетворяет система изоляции операционного поля в стоматологии, которая называется коффердам (или раббердам - РД). Впервые этот метод изоляции был применен доктором S.C.Barnum в 1883 г. (Chawla Н., 1998). С тех пор изоляция операционного поля с помощью коффердама является распространенной процедурой, особенно в эндодонтии. За более чем 120 лет истории применения коффердама выполнено большое количество исследований, показавших высокую эффективность изоляции операционного поля при стоматологических вмешательствах, как для пациента, так и для врача. Коффердам снижает частоту аспирации эндодонтических инструментов при обработки корневого канала (Susini G. et al., 2007), исключает контакт корневого канала со слюной, медикаментами и микроорганизмами, защищает от случайного заглатывания мелких предметов и детрита (Minoodt I. et al., 2005), предотвращает ожоги от сильных кислот, гипохлорита натрия и др. (Whiteworth J. et al., 2000). Использование коффердама снижает вероятность контакта пломбировочного материала с жидкостями полости рта, что повышает степень его адгезии с оперативной поверхностью (Ganss С. et al., 1999). Применение системы коффердам обеспечивает оптимальную защиту операционного поля от попадания слюны и конденсации влаги во время дыхания. Коффердам создает надежную защиту пациента от попадания инородных тел в дыхательные пути и пищевод, а также от случайного повреждения инструментом; фокусирует внимание врача на операционном поле; защищает его от воздушно-капельной инфекции (Овсепян А.П., Раввинская А.А., 2006). Коффердам можно использовать для создания новых композитов завесы, содержащие фармакологические вещества, которые могли бы улучшить отдаленные результаты по профилактике кариеса (Маслов В. и соавт., 2006).
В настоящее время «Система коффердам» приобрела законченный вариант, который рекомендован Европейской и Американской ассоциациями стоматологов как основной метод изоляции операционного поля, обеспечивающий безопасность больного и врача. Составные части системы коффердам, контактирующие со слизистой полости рта, были исследованы на аллергенность и другие виды безопасности в соответствии с международными стандартами. Однако научный и технологический прогресс, наблюдаемый в последние годы в биологии и медицине, позволяет существенно расширить требования к биобезопасности материалов медицинского назначения. Оказалось, что, помино аллергенности, иммуногенности, эмбриотоксичности и канцерогенности, искусственные материалы в полости рта могут оказывать различное влияние на состояние микробиоценоза, свойства клеток слизистой оболочки, иммунную систему, в частности, изменять характер иммунного ответа на вещества антигенной природы. В патентной и научной литературе нет данных по применению современных научных технологий в комплексной оценке биологических эффектов коффердама в отношении слизистой оболочки полости рта и тканей зубов. Актуальность выбранной темы определяется широким использованием коффердама в стоматологии, в частности, в эндодонтии и реставрации и, одновременно, повышением риска возможных осложнений.
Актуальным вопросом является не только оценка биологической безопасности, но также эффективность применения коффердама при лечении кариеса, некариозных поражений и эндодонтическом лечении больных.
Для решения этих вопросов необходимо проведение лабораторных и модельных экспериментальных исследований с использованием современных клеточных и иммунологических научных технологий вместе с продолжительными клиническими наблюдениями.
Цель исследования. Повышение эффективности и качества лечения кариеса и его осложнений с использованием коффердама как оптимального метода изоляции операционного поля. Задачи
1 .Определить на основании анкетирования врачей и пациентов их отношение к применению системы коффердам для изоляции операционного поля в эндодонтии и при реставрации зубов.
2.Провести сравнительную оценку отдаленных результатов лечения кариеса и клиновидного дефекта с использованием для изоляции операционного поля системы коффердам и с альтернативными методами изоляции. 3.Оценить на основании лабораторных исследований биологическую безопасность для человека всех элементов системы коффердама по показателям гибели клеток слизистой полости рта и десневой борозды. 4.Провести исследование клеточных реакций и апоптоза клеток полости рта при контакте с завесой коффердама и при наложении кламмеров. 5.Изучить иммуногенное действие детрита препарированных зубов в модельной системе на животных и оценить защитную роль завесы коффердама при реставрации зуба и эндодонтическом вмешательстве. Научная новизна
Впервые проведена комплексная оценка биологического воздействия системы коффердам на основные компоненты экосистемы полости рта, включающие ткани зуба, клетки слизистой оболочки и установлена биологическая безопасность системы.
Впервые экспериментально исследован биологический материал пациентов, полученный в результате смывов с завесы коффердама после проведенного лечения. Методом проточной цитометрии проведена оценка
состояния клеток, снятых с завесы коффердама и установлена его биологическая безопасность для клеток слизистой оболочки полости рта.
Впервые выявлено, что апоптоз адгезированных на завесе клеток определяется выраженностью патологического процесса (пульпита, периодонтита и т.д.) и не зависит от материала завесы.
Впервые in vivo на животных проведена оценка биологических свойств детрита зубов и обнаружена его выраженная иммуногенность. Реакция клеток перитонеальной полости мышей на контакт с детритом зуба проявляется лимфоцитарной реакцией и повышением процента гибели клеток. Степень негативного воздействия детрита зубов зависит от выраженности патологического процесса в тканях зуба.
Впервые проведена оценка отдаленных результатов лечения кариеса и клиновидного дефекта зуба с применением системы коффердам и дана сравнительная оценка их с результатами лечения с использованием альтернативных методов изоляции и установлено отсутствие существенных различий между группами. Практическая значимость
На современном научном уровне обоснована биологическая безопасность. применения системы коффердам для изоляции операционного поля в эндодонтии и при реставрации зубов.
Доказано отсутствие негативного влияния материала завесы коффердама на твердые ткани зуба и слизистую оболочку полости рта.
Учитывая сложные анатомические особенности строения зубов и зубных рядов при невозможности наложения системы коффердам, обосновано использование альтернативных методов изоляции при лечении клиновидного дефекта или неосложненного кариеса, что не ухудшает отдаленные результаты лечения.
Наложение системы коффердам исключает контаминацию операционного поля бактериями, защищает от слюны и десневой жидкости, что оптимизирует эндодонтическое лечение. Положения, выносимые на защиту:
1. Система коффердам при контакте с компонентами полости рта, включая ткани зуба, клетки слизистой оболочки и бактериальное сообщество не оказывает на них неблагоприятного действия, является безопасной для пациента. Завеса коффердама защищает клетки слизистой оболочки от детрита зубов, образующегося при препарировании зуба.
2. Детрит зубов обладает иммуногенностью, выраженность которой зависит от патологического процесса. Иммуногенность детрита увеличивается при пульпите и периодонтите, что может способствовать развитию воспалительного процесса на слизистой оболочке при препарировании зубов. Коффердам изолирует ткани полости рта от детрита препарируемых зубов.
3. Использование системы коффердам для изоляции операционного поля-не ухудшает отдаленные результаты лечения кариеса и клиновидного дефекта по сравнению с альтернативными методами изоляции операционного поля. Внедрение результатов исследования
Полученные данные используются в учебном процессе и в дальнейшей научной работе на кафедре терапевтической стоматологии ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова Росздрава и в клинической практике терапевтического отделения поликлиники ГОУ ВПО ММА им. И:М. Сеченова Росздрава.
Апробация результатов диссертации. Результаты исследований представлены на Всероссийской эндодонтической научной конференции ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова Росздрава (2008, г. Москва), на итоговой научной конференции молодых ученых ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова Росздрава (2008, г.. Москва)- Работа была обсужденау на совместном заседании кафедр терапевтической стоматологии с курсом ортопедической стоматологии, факультетской хирургической стоматологии ГОУ ВПО ММА им. И..М: Сеченова Росздрава, отделений кариесологии и эндодонтии ФГУ ЦНИИ Стоматологии и ЧЛХ Росмедтехнологий.
Компоненты экосистемы полости рта
Полость рта может рассматриваться как комплексная экологическая система, в которой взаимодействуют внешние и внутренние факторы, которые влияют на микробные сообщества, колонизирующие различные отделы полости рта, на эпителиальные клетки слизистой, твердые ткани зубов, изменяют активность иммунной системы [12,.21, 63]. Все компоненты экосистемы находятся в динамическом равновесии, для оптимального взаимодействия между которыми необходимо согласованное функционирование каждой из составляющих. В полости рта- имеется многоуровневая система защиты от негативного влияния окружающей среды, первой линией которой является ротовая жидкость, слизистая оболочка полости рта, включая клетки эпителия и иммунной системы, разлиные цитокины, регулирующие межклеточные взаимодействия и клеточную» активность [2].
Эпителиальные клетки слизистой оболочки полости рта первыми реагируют на бактериальную колонизацию, участвуют в регуляции клеточного и гуморального иммунного ответа на бактериальные пептидогликаны [38]. Распознавание бактериальных структур эпителиоцитами контролируется рецепторами TLR-4, TLR-2, NOD-1, NOD-2, но не ограничено генами главного комплекса гистосовместимости, поэтому такой тип защиты относится к природному иммунитету [145]. Эпителиоциты регулируют миграцию клеток иммунной системы в полость рта, они синтезируют ряд цитокинов, в том числе антимикробные пептиды дефенсины, интерлейкины IL-8, IL-lp, трансформирующий ростовой фактор (TGF-P) и другие факторы. Микроорганизмы полости рта подавляют синтез эпителиоцитами провоспалительных цитокинов [152].
Бактерии регулируют динамику цитоскелета клеток, что позволяет им сформировать пиноцитозный карман и внедриться в клетку [51]. Ранее полагали, что клетки эпителия не отвечают на непатогенные бактерии, из-за низкого уровня экспрессии рецепторов TLR на апикальной поверхности клетки, тогда как патогенные бактерии активируют рецепторы, расположенные внутри клеток или базолатерально. Кератиноциты полости рта синтезируют цитокератины, инволюкрин, филлагрин, экспрессия которых повышается при воспалительных заболеваниях пародонта.
Слюна характеризуется определенными физико-химическими свойствами, такими, как рН, буферная ёмкость, скорость тока, вязкость. Слюна содержит ряд биологически активных веществ, ферментов и регуляторных пептидов. В слюне обнаружены интерлейкины IL-loc, IL-6, IL-8, факторы роста EGF, NGF, PDGF-AB, bFGF, KGF и другие цитокины, концентрация которых повышается при воспалительных заболеваниях полости рта и гиперпластической патологии [82]. Состав слюны складывается из секретов околоушных, подъязычных и субмандибулярных желез, которые различаются по содержанию белка, составу цитокинов и активности ферментов. Больше всего белка в секрете околоушных желез. При кариесе и его осложнениях в жидкости дентинных канальцев повышена активность щелочной фосфатазы, которая оказывает влияние на состав слюны [129]. Микрофлора полости рта, клетки эпителия и популяции клеток иммунной системы определяют жирнокислотный состав слюны [9]. Состав летучих жирных кислот в слюне отражает состояние и функциональную активность эпителия полости рта [1]. Макрофаги и моноциты полости рта синтезируют ацетилхолинэстеразы (АХЭ), псевдохолинэстеразы (ПХЭ) и холестеринэстеразы (ХЭ), которые при попадании в слюну и последующем контакте с синтетическими материалами пломбы вызывают образование в них дефектов. [65]. Эти данные имеют непосредственное отношение к качеству лечения в эндодонтии, так как позволяют оценить устойчивость пломбировочного материала в реактивной среде полости рта.
Протеолитическая система слюны регулирует лизис и рост бактерий полости рта. При гипосаливации вследствие приема медикаментов или другого генеза повышается содержание микроорганизмов рода Candida, Lactobacillus и Streptococcus в составе поддесневого зубного камня, снижается уровень контаминации языка бактериями рода Fusobacterum nucleata, повышается уровень загрязнения вестибулярного региона полости рта энтерококками [33].
Содержание цитокинов в слюне (факторы роста EGF, NGF, простагландины) определяется активностью макрофагов и моноцитов в слизистой оболочке или в десневой жидкости [82]. В слюне имеется базальный уровень простагландина Е и других простагландинов, которые играют роль в патогенезе воспалительных процессов . У здоровых лиц PgE2 связывается с рецепторами Е2 и Е4, что снижает синтез матриксных металлопротеиназ (ММР), в том числе ММР-3, в сигнальном пути которого принимает участие 11-1 р [128].
Цитокин МСР-1 (хемоатрактант моноцитов) регулирует приток клеток иммунной системы в очаг воспаления. У больных хроническим пародонтитом экспрессия МСР-1 повышается под действием TNF-a, выделяемого моноцитами, что усиливает воспалительный процесс. TNF-a активирует предшественников остеокластов, что приводит к резорбции кости при пародонтите [91].
Содержащийся в слюне кальций имеет отношение к минерализации эмали дентина. Существует сложная система регуляции секреции кальция в слюнных железах человека. Кальций поступает внутрь ацинарных клеток через эпителиальные кальциевые каналы в базолатеральной плазматической мембране, попадает в эндоплазматический ретикулум, где связывается белком кальмодулином-2. Секретируется кальций из клеток с помощью кальциевых АТФ-аз, расположенных на апикальной мембране и в секреторных канальцах между клетками [76].
Микрофлора полости рта и ее изменения при кариесе и его осложнениях. Роль межклеточных взаимодействий
Методами генетического анализа, включая полимеразную цепную реакцию (PCR), в том числе PCR-DGGE (ДНК выделяется из культуры и амплифицируется, с использованием консервативных праймеров 16S гРНК бактерий), а также ДНК-ДНК гибридизацией и RT-PCR техникой, определили число видов бактерий в полости рта, а также оценили процентное соотношение каждого вида в популяции [138]. Обнаружено более 1000 видов микробных сообществ, связанных с эпителием слизистой или находящихся на поверхности зуба. 417 видов бактерий выделено из зубного камня [55]. Несмотря на то, что плотность колоний бактерий достигает 1011 КОЕ/г, не более 20 видов могут культивироваться in vitro с использованием современных микробиологических методов.
Экспрессия многих генов бактерий определяется субстратом, имеющимся в полости рта. Изменения в бактериальном сообществе происходят в течение нескольких часов, что дает возможность бактериям максимально использовать питательные ресурсы [113].
В полость рта человека с пищей постоянно попадает значительное количество микроорганизмов. В продуктах питания обнаружено 22 вида дрожжей [134]. Генерализованные кандидозы приводят к кандидозам полости рта [109, 19]. Анаэробные бактерии способствуют развитию синусита и других воспалительных заболеваний головы и шеи [46]. Грамотрицательные анаэробные бактерии вызывают деструкцию пародонта, это Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Bacteroides forsythus, Campylobacter rectus, E.nodatum, Peptostreptococcus micros, S. intermedins и Treponema spp. [97]. При выраженном пародонтите P.gingivalis, P.intermedia и Credits высеваются в 77 — 86% случаев, в 62% эти виды высеваются одновременно [84]. Эпителий десен является средой для размножения A.actinomycetem-comitans, P.gingivalis и Tannerella forsythensis [127]. Эти виды находятся в клетке как компоненты внутриклеточного бактериального сообщества, причем каждый вид занимает определенное место в клетке и не пересекает ареал размножения другого вида. Содержание P.gingivalis и T.forsythensis в 4 раза меньше, чем A.actinomycetemcomitans, они не являются доминантными во внутриклеточной флоре эпителия щек, но их клиническое значение определяется участием в развитии пародонтита [73]. Сообщество A.actinomycetemcomitans, P.gingivalis и T.forsythensis обнаружено в слюне, бактериальной пленке, покрывающей десневую борозду, язык и слизистую щек. При лечении зубов наблюдается реколонизация бактерий и развитие пародонтита [99]. При повышении оксигенации полости рта происходит инвазия бактерий в клетки эпителия, что сохраняет их популяцию [74].
Бактерии P.gingivalis локализуются в цитоплазме в перинуклеарном регионе эпителиальных клеток, инфильтрируют внеклеточный матрикс пародонта [122]. Ключевым фактором вирулентности P. gingivalis являются цистеиновые протеазы (Arg-Lys-гиргипаин и др.), вызывающие деструкцию тканей пародонта [35]. Тиоловые протеазы, секретируемые P.gingivalis, обнаружены у всех больных хроническим пародонтитом [122] P.gingivalis находят только у 4% здоровых лиц, а при хроническом пародонтите обнаруживают постоянно [72]. Тяжелые формы пародонтита встречаются1 у 10—15% взрослого населения, а гингивиты и пародонтиты средней тяжести есть у большинства людей [115]. Лечение хронического пародонтита не приводит к полной элиминации P.gingivalis, так как сразу после вмешательства начинается их реколонизация, что поддерживает воспаление [67]. Через 24—48 ч после лечения число клеток эпителия; инфицированных P.gingivalis, возрастает в 20-45 раз [162]..
Достоверно известно, что бактерии различных классов обладают спонтанной биолюминесценцией [5]. Эффект спонтанной флюоресценции: бактерий широко используется в медицинских исследованиях, но редко применяется в стоматологии [5]. Эффект спонтанной флюоресценции дает возможности анализировать события в такой комплексной; системе, как смыв из полости рта. Многочисленные виды бактерий в полости рта способны продуцировать порфирины, флуоресцирующие в красной области спектра. Этот феномен показан для 31 вида бактерий, высеянных из полости рта человека [25, 58].
Критерии включения, невключения и исключения пациентов из исследования
Критерием включения пациента в исследование является: 1) письменное согласие пациента принять участие в исследовании; 2) отсутствие данных к его не включению или исключению из исследования; 3) возраст от 18 до 65 лет; 4) пациент любого пола. Критерием исключения пациентов из исследования является: 1) невозможность использования системы коффердам при аллергии, 2) наличие острых вирусных или бактериальных заболеваний. Критерием невключения пациентов в исследование является: 1) их полный или частичный отказ от участия во всех запланированных исследованиях; 2) наличие соматических заболеваний, 3) беременность.
Все пациенты подписывали форму информированного согласия на участие в работе.
С целью определения частоты использования системы коффердам в стоматологической практике в Москве, было проведено анкетирование 125 врачей-стоматологов, основанное на добровольном анонимном ответе в письменном виде на поставленные вопросы (табл. 1). Для уточнения отношения пациентов к применению системы коффердам было проведено анкетирование всех 270 первичных пациентов (табл. 2).
Компьютерная обработка анкет позволила установить процент больных, положительно относящихся к применению коффердама, причины, по которым больной не хотел бы вновь использовать этот метод, оценка больным качества реставрации зубов, проведенной диссертантом, а также отдаленные результаты лечения.
При всех эндодонтических процедурах коффердам был использован как метод изоляции операционного поля. Пролечено и реставрировано 805 зубов.
Показания и противопоказания для проведения реставрации были разработаны профессором И.М.Макеевой (1997) и использованы под её руководством в данной работе.
Показания для проведения реставрации зубов: 1) необходимость коррекции эстетических параметров зуба, включая цвет, размер, форму, положение зуба в зубном ряду; 2) лечение кариеса и его осложнений, включая восстановление зубов с кариозными полостями I-V классов, восстановлением цветовой гаммы и прозрачности; 3) лечение некариозных поражений и последствий травм с восстановлением эстетических и функциональных параметров зуба, включая восстановление зуба при частичном отколе коронки. Противопоказания для проведения реставрации зубов: Абсолютные: 1) наличие у пациента стимулятора сердечного ритма, когда фотополимеризатор может нарушить частоту импульсов аппарата, и возможна остановка сердца; 2) аллергическая реакция пациента на компоненты адгезивной системы или композитного материала. Относительные: 1) невозможность использования коффердама для изоляции операционного поля; 2) заведомое несоблюдение пациентом правил гигиены и ухода за полостью рта, когда образование налета способствует исчезновению блеска и краевому окрашиванию зуба. 3) сочетание патологической стираемости и прямого прикуса; 4) глубокое резцовое перекрытие, сочетающееся с плотным контактом между верхними и нижними резцами;
Для объективной оценки качества реставрации зубов, проведенной при изоляции операционного поля с помощью РД, были использованы критерии, разработанные профессором И.М.Макеевой (1997). Данные критерии использованы и для оценки отдаленных результатов. Были использованы визуальный анализ и инструментальные методы исследования, включая зонды, флоссы, рентгенологическое исследование, электрометрию. Сохранность цветовой гаммы зубов оценивали по наличию оттенков шейки, скатов контактных поверхностей и прозрачного режущего слоя.
Клинические показатели качества реставрации 1. Целостность (сохранность) реставрации. 2. Качество контактных пунктов, восстановленных композитным материалом (наличие плотного межзубного контакта, отсутствие нависающих краев). 3. Отсутствие видимого перехода на границе между тканью зуба и композитом, которая определяется визуально и инструментально. 4. Отсутствие участков краевой разгерметизации, выявляемых визуально или зондом. 5. Отсутствие признаков развития рецидива кариеса. 6. Отсутствие гингивита при локализации участка реставрации в придесневой области. 7. Отсутствие гиперестезии, быстропроходящая реакция на изменение температуры.
Влияние коффердама на апоптоз клеток полости рта
С точки зрения современной доказательной медицины для установления биологической безопасности системы, контактирующей с органами или тканями человека (в данном случае со слизистой полости рта и тканями зуба), следует провести исследование возможного цитотоксического и генотоксического эффекта компонентов данной системы. В проведенной диссертационной работе оценили влияние завесы коффердама на клетки слизистой полости рта, а также влияние контакта металлических предметов системы РД на десневую борозду.
На цитотоксическое действие вещества указывает изменение состава клеток и процент их выживаемости, а генотоксический эффект качественно и количественно можно оценить по фрагментации ДНК, что является основным маркером разрушения генома клетки. Для изучения обоих вышеуказанных эффектов применим один прибор — проточный цитометр, который позволяет одновременно исследовать несколько параметров всей популяции клеток.
Фрагментация ДНК является одним из основных маркеров программированной гибели клетки (апоптоза) — процесса, проходящего по определенным закономерностям, требующего затраты энергии и заканчивающегося формированием апоптозных телец — фрагментов клетки, окантованных плазматической мембраной. При использовании красителя, связывающегося с ДНК клетки (в данном случае — пропидиума йодида), высокий уровень флюоресценции указывает на нормальное содержание ДНК в клетке (G1 диплоидный пик), а снижение флюоресценции в несколько раз указывает на клетки, в которых происходит распад ДНК (апоптозные клетки). На рис. 10 приведены примеры анализа фрагментации ДНК клеток, адсорбированных и затем смытых с завесы коффердама после снятия системы. В среднем процент гибели клеток колеблется от 14 до 25%, что определяется не только влиянием самой ткани завесы коффердама, но и методом получения клеток с её поверхности. Большинство клеток, адсорбированных на завесе, представлены эпителиоцитами, моноцитами и лейкоцитами. Для эпителия необходимым условием выживания является адгезия и плотные контакты с поверхностью. При отрыве клеток от завесы часть из них неминуемо погибнет. Процент гибели клеток, снятых с завесы, не определялся заболеваниями зубов, что указывает на универсальное влияние материала завесы на степень адгезии клеток.
Далее приводятся примеры анализа популяций клеток отдельных пациентов, снятых с завесы коффердама, а также полученных путем смыва с десневой борозды до и после наложения системы коффердама. Состав завесы оказывает определенное влияние на число клеток, прикрепившихся к
При сравнении завес кофердама, которые были использованы при эндодонтическом лечении и реставрации в рамках данной работы, а именно: Blue Dam, Dental Dams, Hygenic Dam и OptiDam (см. табл. 5), было показано, что завесы не имели существенных отличий по картине распределения адгезированных на них клеток (рис. 12). Это является положительным моментом, так как позволяет сравнивать результаты, полученные с помощью завес разных фирм, между собой. Картина распределения клеток отличалась только в зависимости от нозологии и тяжести клинического проявления патологии.
При сравнении процента апоптоза клеток, снятых с завесы коффердама, обращает на себя внимание тот факт, что у больных с выраженной бактериальной инфекцией (см. далее раздел по бактериальной контаминации), процент гибели клеток был выше. Это указывает на влияние протеаз бактерий или действие цитокинов, а не влияние материала, из которого выполнена завеса коффердама, на клетки полости рта.
По литературным данным после стерилизации инструментов коффердама не обнаружено повышенной гибели клеток полости рта или снижения их способности к адгезии. Однако обработка РД химическими агентами токсична для фибробластов и вызывает их гибель путем апоптоза. С той точки зрения интересно проанализировать данные проточной цитометрии клеток, полученных путем смыва с десневой борозды до и после наложения системы коффердам.
По сравнению с кариесом, при клиновидном дефекте зуба процент гибели клеток был существенно ниже (рис. 13). Количество прикрепившихся клеток эпителия в обоих случаях статистически не различалось. Однако в популяции моноцитов у больного с кариесом процент апоптоза был несколько выше, и эта тенденция наблюдалась у всех больных. У одного больного с клиновидным дефектом, данные которого приводятся на рисунке выше, наблюдалось резкое повышение числа лейкоцитов в смыве с десневой борозды после снятия системы коффердама. У других больных реакция десны также была выражена, но не столь ярко. В данном методе исследования мы не проводили разделения клеток на субпопуляции, поэтому в гейте лейкоцитов могут находиться клетки, продуцирующие протеазы.
Оценка влияния системы коффердам на клетки полости рта должна включать анализ различных нозологических форм, наиболее часто встречающихся в эндодонтической практике. На рис. 14 приведены примеры цитометрии клеток, полученных у больных с пульпитом и периодонтитом.
