Введение к работе
Актуальность проблемы
Одной из самых актуальных проблем современной медицины является охрана здоровья, для решения которой разработаны и утверждены соответствующие концепции и программы, цель которых - сохранение и восстановление здоровья человека. Социальное значение восстановительной медицины состоит в ограничении формирования потока больных, поддержании оптимальной работоспособности и качества жизни. Разработка новейших корригирующих технологий, направленных на сохранение и восстановление функциональных резервов организма человека, восстановление его оптимальной работоспособности является основной стратегией современной восстановительной медицины (Разумов А.Н., Бобровницкий И.П. 2002, 2003; Косорлукова Т.В., 2005). Для дальнейшего развития клеточного направления восстановительной медицины чрезвычайно актуален вопрос подготовки достаточного количества эффективного и безопасного клеточного материала для повышения регуляторных, компенсаторных и адаптивных возможностей организма.
После появления первых публикаций об успешном проведении трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) пуповинной крови (ПК) в конце 80-х гг. XX века, начали свое развитие первые банки ПК (Gluckman E., 1989). ПК, представленная для использования криобанками, в настоящее время является альтернативным костному мозгу источником гемопоэтических стволовых клеток, применяемых для трансплантации у детей и взрослых при ряде злокачественных заболеваний, синдромах недостаточности костного мозга, гемоглобинопатиях и некоторых генетических метаболических расстройствах (Gluckman E., 2006, 2010; Rocha V., 2006). Мировая ассоциация доноров костного мозга (World Marrow Donor Association - WMDA) собирает информацию о числе заготовленных единиц банками ПК по всему миру начиная с 1999 года. На 2008 год WMDA сообщает о деятельности 112 банков, которыми заготовлено более 450 тыс. единиц ПК. В настоящее время в Европе существует 18 банков ПК, которые получили аккредитацию в NetCord-FACT и еще 40 находятся на стадии регистрации (Navarrete C., 2009). На настоящий момент в мире выполнено более 10000 трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток с использованием ПК (Majhail N.S., 2006). По данным Gluckman T., Rocha V. начиная с 2006 года около 20% трансплантаций стволовых клеток, проводимых в Европе пациентам в возрасте до 20 лет, являются трансплантациями ПК (http://www.worldmarrow.org/). Это свидетельствует о том, что ПК является ценным клеточным ресурсом для тех пациентов, которым не был найден совместимый донор костного мозга, особенно это важно для групп этнических меньшинств. Особенности ГСК ПК являются предпосылкой для увеличения количества трансплантаций с их применением. (Wagner J. E., 1992; Harris D. T., 1996; Kogler G., 1996; Ikuta К., 1998; Rubinstein P., 1999; Gluckman E., 2005, Querol S., 2009). Увеличение доступного пула единиц ПК улучшает вероятность обнаружения донорского материала с оптимальными характеристиками.
Успех трансплантации во многом зависит от достаточного количества ГСК, поэтому важным вопросом применения ПК в клинической практике является оценка качества трансплантата. (Bender J.G., 1994; Gonzalez B.E., 1997; Traineau R., 1998; Allan D.S., 2002; Cotta S.V. et al., 2002; Marino M.P. et al., 2002). Главной причиной клинических и иммунологических проблем после трансплантации и основным лимитирующим фактором выбора донора является HLA-несовместимость.
Популяционные исследования полиморфизма генов главного комплекса гистосовместимости, проведенные у больных гемобластозами, свидетельствуют об ассоциативной связи системы HLA с острым лейкозом, как у взрослых, так и у детей. (Dorak M.T. 1992, 1996, 1999; Tayler G.M. 2002, 2008, 2009; Тананов А.Т. 1982; Хамаганова Е.Г., 1989; Зарецкая Ю.М., 2000, Рий А.А., 2007). Современные данные изучения HLA системы при острых лейкозах у детей практически отсутствуют.
Изучение и разработка высокотехнологичных методов банкирования ПК и определение стратегии HLA- типирования представляются актуальной задачей, так как позволяют расширить возможности для восстановления функциональных резервов организма у большого количества пациентов, к которым неприменимы стандартные протоколы диагностики и лечения.
В связи с изложенным, целью настоящего исследования явилась разработка системного подхода и научно обоснованной технологии банкирования пуповинной крови с применением высокотехнологичных и молекулярно-генетических методов в восстановительной медицине.
Задачи исследования:
-
Исследовать совокупность анте- и интранатальных факторов, оказывающих влияние на состав и эффективность выделения ГСК ПК.
-
Проанализировать клеточный состав, иммунологическую характеристику, уровень спонтанного апоптоза лейкоцитов, общее количество, жизнеспособность и эффективность клонирования гемопоэтических колониеобразующих единиц ГСК ПК.
-
Оценить влияние технологий обработки ПК на качество и эффективность выделения мононуклеарной фракции.
-
Оптимизировать алгоритм использования различных молекулярно-генетических методов HLA-типирования при банкировании ПК и исследовать генетический полиморфизм антигенов гистосовместимости у здорового населения московского региона.
-
Исследовать характер распределения специфических генов HLA-системы при острых лейкозах у детей и глютенчувствительной целиакии, а также выявить HLA-маркеры предрасположенности / устойчивости к ним.
-
Разработать технологический алгоритм и научно обосновать системный подход к банкированию ПК для восстановления функциональных резервов организма и трансплантаций в восстановительной медицине.
Научная новизна
Впервые на большом фактическом материале ПК определена совокупность анте- и интранатальных факторов, оказывающих влияние на состав и эффективность выделения ГСК.
Впервые показано, что результаты автоматического гематологического анализатора и светооптической микроскопии независимы друг от друга и взаимно дополняют референтные значения клеточного состава ПК. Получены данные уровня спонтанного апоптоза лейкоцитов в ПК, общего количества, жизнеспособности и эффективности клонирования гемопоэтических колониеобразующих единиц в конечном клеточном продукте, которые характеризуют эффективность материала для неродственной трансплантации и восстановления функциональных резервов организма.
Впервые в России оптимизированы процессы проведения исследований и оценки результатов HLA-типирования большого количества образцов ПК здоровых новорожденных и периферической крови при различных заболеваниях, представленные двумя молекулярными высокотехнологическими методами, такими как SSO на автоматическом процессоре и SSP, позволяющие получать достоверную и однозначную информацию.
Впервые на большом фактическом материале изучен характер распределения HLA специфичностей класса I и II у здорового населения московского региона и установлен профиль генов HLA системы, соответствующий европеоидам.
Впервые получены данные об особенностях распределения специфических аллелей генов HLA системы, охарактеризованы дополнительные общие маркеры предрасположенности /устойчивости при лейкозах у детей и при глютенчувствительной целиакии.
Впервые разработан и внедрен системный подход и оптимизирован технологический алгоритм комплексного использования высокотехнологичных методов сбора, оценки, тестирования, криохранения ГСК ПК, что позволило получать качественный, эффективный и безопасный клеточный материал.
Практическая значимость работы
Практическое значение работы заключается в том, что
Установлена необходимость совместного использования методов автоматического подсчета клеток и светооптической микроскопии, взаимно дополняющих референтные значения клеточного состава ПК.
Совокупность показателей общего количества клеток, уровня спонтанного апоптоза лейкоцитов, клонирования гемопоэтических колониеобразующих единиц определяет жизнеспособность и эффективность клеточного материала ПК.
Использование системного подхода и технологического алгоритма в банкировании ПК позволяет получать эффективный и безопасный клеточный материал.
Предложена стратегия HLA типирования с применением технологий SSO и SSP, которая может быть применена в медицинских учреждениях. Профиль распределения генов главного комплекса гистосовместимости у здорового населения московского региона может быть использован в качестве группы сравнения в области изучения «HLA и болезни» и в популяционных исследованиях.
Основные положения, выносимые на защиту
Изучение совокупности анте- и интранатальных факторов, антропометрических данных и пола новорожденного, различных состояний острой и хронической гипоксии плода позволяет оценить их влияние на состав и эффективность выделения ГСК ПК для восстановления функциональных резервов организма.
Эффективность клеточного материала ПК для восстановления функциональных резервов организма характеризуют количественный и качественный клеточный состав ПК, определенный с применением автоматического гематологического анализатора и светооптической микроскопии; уровень спонтанного апоптоза лейкоцитов, общее количество, жизнеспособность, эффективность клонирования гемопоэтических колониеобразующих единиц.
Стратегия применения методов HLA-типирования образцов пуповинной крови, представленная двумя технологиями, такими как SSO и SSP, позволяет проводить быструю обработку большого количества биоматериала и получать достоверные и однозначные результаты.
Исследование полиморфизма генов HLA-системы позволяет изучить характер распределения аллельных специфичностей среди здорового населения московской популяции и обнаружить маркеры, определяющие риск или устойчивость к возникновению заболеваний, таких как лейкозы у детей и глютенчувствительная целиакия.
Комплекс усовершенствованных высокотехнологичных методов сбора, оценки, тестирования, хранения ГСК ПК, является оптимальным, позволяет получать однозначную и достоверную информацию и требует для исследования минимального количества биоматериала.
Обоснованый и внедренный системный подход в банкировании ПК позволяет получать эффективный клеточный материал для повышения регуляторных, компенсаторных и адаптивных механизмов организма и дальнейшего развития клеточного направления восстановительной медицины.
Внедрение результатов работы в практику
Результаты исследования внедрены в работу ГУЗ «Банк стволовых клеток Департамента здравоохранения г. Москвы».
Работа выполнена на базе ГУЗ «Банк стволовых клеток Департамента здравоохранения г. Москвы», ФГУ «Всероссийский научно-исследовательский и испытательный институт медицинской техники» Росздравнадзора, ЦПСиР ДЗ г. Москвы, родильном доме № 10 Управления здравоохранения ЮЗАО г. Москвы, родильном доме № 8 Управления здравоохранения ЮВАО г. Москвы, родильном доме № 17 Управления здравоохранения САО г. Москвы и городской больнице № 8 Управления здравоохранения САО г. Москвы, ФГУ «Федеральный научно-клинический центр деткой гематологии, онкологии и иммунологии», научно-исследовательном институте гастроэнтерологии Департамента здравоохранения города Москвы.
Апробация диссертации
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на конференциях и научных форумах республиканского и международного уровня, в том числе на Российском Съезде гематологов и трансфузиологов (Москва, 2006), Stem cell therapy meeting (Регенсбург, 2007), Всероссийском симпозиуме «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Москва, 2007), Российском медицинском форуме «Проблемы трансплантации пуповинной крови» (Москва, 2007), III Всероссийском симпозиуме «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Москва, 2007), 35 Международном симпозиуме Европейской группы EBMT (Гетеборг, 2010г.), V международном симпозиуме «Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний у детей» (Москва, 2009), XIV конгрессе педиатров России с международным участием «Актуальные проблемы педиатрии» (Москва, 2010г.), 5 иммуногенетической международной конференции «East-West Immunogenetics Conferece» (Пилсен, 2010г.), 36 Международном симпозиуме Европейской группы EBMT (Вена, 2010г.), III научно - практической конференции «Современные технологии и методы диагностики различных групп заболеваний, лабораторный анализ» (Москва, 2010), 24 Европейской конференции по иммуногенетике и гистосовместимости (European Immunogenetics and Histocompatibility Conference, EFI and 17 the Italian Society for Immunogenetics and Transplantation, AIBT) (Флоренция, 2010).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 44 научные работы в периодической печати, как в России, так и за рубежом, в том числе 10 статей в изданиях, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 298 страницах печатного текста и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3-х глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 159 таблицами и 48 рисунками. Библиографический указатель содержит 35 источников отечественной и 312 источников зарубежной литературы.
