Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 6
Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 17
Биологическая активность геропротекторных пептидных 17 биорегуляторов
Современные представления о механизмах свободнорадикального 28 окисления и его роли в процессах старения
1.2.1 .Основные источники образования свободных радикалов при 30
старении
Митохондриальные источники 31
Немитохондриальные источники 37 1.2.2. Состояние антиоксидантных систем организма при старении 39
Ферментативное звено антиоксидантной защиты 40
Неферментативное звено антиоксидантной защиты 45
Воздействие стрессорных факторов на процессы свободно- 53 радикального окисления и антиоксидантную систему организма
Использование природных и синтетических антиоксидантов для 63 профилактики преждевременного старения и продления жизни
Синтетические антиоксиданты 64
Биоантиоксиданты 69
Комплексное применение антиоксидантов 74 Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 80
Экспериментальные животные и исследуемые препараты 80
Экспериментальные модели стрессовых воздействий 80 (гипокинезия, острая гипобарическая гипоксия)
Физиологические методы исследования 81
Биофизические и биохимические методы исследования1 82 2.4'. 1. Определение интенсивности перекисного окисления липидов 82
Исследование окислительной модификации белков 83
Исследование системы антиоксидантной защиты 83
Исследование состояния мембран эритроцитов и лейкоцитов 86
Молекулярно-биологические методы исследования 87 2.5.Г. Культура клеток мозжечка крыс 87 2.5.2. Клетки нейробластомы человека 89
Статистическая обработка результатов* исследования 91 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 92 Глава 3. Возрастная динамика ряда показателей свободнорадикального 92 окисления и антиоксидантной системы
Глава 4. Влияние геропротекторных пептидных препаратов на 99
показатели свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы
Сравнительное исследование антиоксидантныххвойств эффекты 99 эпиталона и кортагена
Влияние эпиталона на свободнорадикальные процессы у крыс при 104 старении
4.3. Воздействие коротких пептидов и мелатонина на интенсивность 108
свободнорадикальных процессов у мышей линии СВА
Глава 5. Влияние геропротекторных пептидных препаратов 113
на показатели свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы в условиях действия экстремальных факторов
(гипокинезия, гипоксия)
Глава 6; Оценка антиоксидантной активности и мембрано- 122
протекторных свойств коротких пептидов в экспериментах in vitro
Исследование прямой антиоксидантной активности коротких 122 пептидов
Действие коротких пептидов на Fe -индуцированное окисление 125 липопротеинов крови
Влияние коротких пептидов на скорость кислотного и 127 осмотического гемолиза эритроцитов
Действие коротких пептидов на нейрональные клетки 132 мозжечка
Глава 7. Антигипоксические свойства коротких регуляторных 136
пептидов
7.1. Влияние коротких пептидов на устойчивость крыс к воздействию 136
гипобарической гипоксии
7.2. Влияние коротких пептидов на состояние потомства 140
7.2.1 Действие пинеалона на поведенческие реакции крысят, перенесших 142
пренатальную гипоксию
7.2.2. Действие пинеалона на нейрональные клетки мозжечка потомства 147
крыс, подвергнутых воздействию гипобарической гипоксии
Глава 8. Влияние коротких пептидов на клетки нейробластомы 150
человека при гипоксии
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 154
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 179
ВЫВОДЫ 182
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 185
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 186
СПИСОК СОКРАЩЕНИИ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ДИССЕРТАЦИИ
АОП - антиоксидантний потенциал системы
АФК - активные формы кислорода
ГП - глутатионпероксидаза
ДК - диеновые конъюгаты
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ДФПГ- ІЛ'-дифенил -2 - пикрилгидразил
ИДФ - инсулиндеградирующий фермент
МДА - малоновый диальдегид
мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота
НЕП - неприлизин
ОАА - общая антиокислительная активность
ОМБ - окислительная модификация белков
ОС - окислительный стресс
ОШ - основания Шиффа
ПОЛ - перекисное окисление липидов
СОД - супероксиддисмутаза
СПА - суммарная пероксидазная активность
СРО - свободнорадикальное окисление
ТБК - тиобарбитуровая кислота
ТБК-АП - ТБК-активные продукты, то есть реагирующие с ТБК
ХЛ - хемилюминесценция
ЭТЦ - электронтранспортная цепь
Н202 - перекись водорода
NAC - N-ацетилцистеин
NMDA - N-Memn-D-acnapTaT
Введение к работе
Актуальность проблемы
Свободнорадикальная теория старения, предложенная в 50-е г.г. прошлого столетия Д. Харманом [Harman D., 1956] и получившая дальнейшее развитие в многочисленных работах зарубежных и отечественных исследователей, к которым относятся в первую очередь Н.М. Эмануэль и его школа [Эмануэль Н.М. и соавт., 1958], до настоящего времени считается одной из самых перспективных теорий, объясняющих механизмы старения и связанных с ним патологических процессов.
Известно, что процессы старения организма и формирования возрастной патологии обусловлены ростом молекулярных повреждений, вызываемых свободными радикалами, а также нарушением функции системы- антиоксидантной защиты организма: При этом наблюдается* дисбаланс показателей антиоксидантной и прооксидантной систем, определяющий интенсивность патологических процессов. Оксидативные реакции приводят к нарушению > регуляции клеточного гомеостаза, что способствует развитию заболеваний или индуцирует процесс преждевременного старения [Зенков Н.К. и соавт.,2001; Хавинсон В.Х. и соавт., 2003; Дубинина Е.Е., 2006]. В основе этих нарушений лежат процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ), которые носят каскадный характер, окислительной модификации белков и ДНК.
Наряду с этим установлено, что одной из наиболее важных регуляторных функций эндогенных пептидов (глутатион, карнозин и его производные; некоторые нейропептиды) является ограничение чрезмерной активации свободнорадикальных процессов, прежде всего ПОЛ, и поддержание' способности системы антиоксидантной защиты противодействовать окислительному стрессу, развивающемуся в организме при патологических процессах, действии неблагоприятных факторов внешней среды и старении [Болдырев А.А., 1998; Хавинсон В.Х. и соавт.,
2003; Лысенко А.В. и соавт., 2005]. Принимая во внимание разнообразие физиологических эффектов регуляторних пептидов, легко представить, что уменьшение их продукции может привести к нарушению механизмов пептидной регуляции и постепенному угасанию функций в стареющем организме.
В Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН выделено г из тканей животных большое количество геропротекторных полипептидных препаратов, представляющих собой низкомолекулярные соединения пара- и аутокринной природы, выполняющие функции внутри- и межклеточных мессенджеров..Они,.как и многие синтезированные на основе изучения, их аминокислотного состава короткие пептиды, принимают участие в переносе информации между группами клеток,, регулируют их активность и обладают полифункциональным действием в организме. Широкий спектр фармакологической-активности этих соединений связан с их влиянием на ряд наиболее общих механизмов, лежащих в основе разнообразных патологических процессов. Установлено, что они способствуют увеличению продолжительности жизни, тормозят развитие опухолей, обладают иммуномодулирующим действием и т.д. [Анисимов В.Н., 2003, 2008]. Существует представление о том, что соединения пептидной природы могут осуществлять свои функции на уровне межклеточного взаимодействия между геномом и структурно-функциональными элементами нейроиммуно-эндокринной регуляции [Акмаев И.Г., 1996, 1997; Хавинсон В.Х. и соавт., 2003, Пальцев М.А., Кветной И.М., 2008]. По-видимому, пептиды, обладающие антиоксидантной активностью, способны корректировать нарушения подобного < взаимодействия в условиях окислительного стресса, возникающего при старении вследствие развития различных патологических процессов (сердечно-сосудистые заболевания, нарушение мозгового кровообращения, злокачественный рост, нейродегенеративные болезни).
Механизмы действия регуляторных пептидов до настоящего времени объясняют с позиций существования пептидного каскада, сформулированных в гипотезе о функциональном континууме пептидов, [Ашмарин И:П., 1984, 1986; 1997; Ашмарин И.П., Каменская М.А., 1988; Ашмарин И.П., Каразеева Е.П. 1996; Ашмарин И:П., Королева С.В, 2003]. Каждый пептид имеет спектр биологической активности, определяемый, во-первых, его непосредственным действием и, во-вторых, его способностью индуцировать выход эндогенных регуляторов, в том числе и других регуляторных пептидов. В свою очередь, каждые из них также могут служить индукторами выхода, следующей группы пептидов- и т.д., благодаря чему формируется сложный каскадный процесс. Гипотеза о существовании- такой системы регуляции позволяет преодолеть серьезные противоречия,, возникающие при попытках объяснения относительно длительных физиологических эффектов короткоживущих пептидов. Другим механизмом действия регуляторных пептидов считается' их процессинг, в результате которого становится возможным в короткие сроки путем активации определенных протеолитических ферментов- образовывать в нужном месте необходимое количество требуемых пептидов [Ашмарин И.П., 1988; Гомазков О. А., 1995, 2006]. Образующиеся короткие фрагменты из 3-4 аминокислотных остатков, полностью лишенные гормональной активности, могут оказаться значительно более эффективными, чем исходные соединения.
Известно, что любая клетка наделена системой защиты от АФК и продуктов перекисного окисления, которые способны нанести ей непоправимый вред. Значительная часть этой защитной системы локализована в митохондриях и микросомах и представлена такими ферментами, как супероксиддисмутаза, каталаза и глутатионпероксидаза. Ингибирование избыточного свободнорадикального окисления (СРО) играет особо важную роль в функционировании митохондрий, мембрана которых
несет на своей поверхности комплексы ферментов, осуществляющих транспорт электронов, цикл трикарбоновых кислот и процессы фосфорилирования.
Нормальная деятельность ферментных систем митохондрий выполняет важную роль в осуществлении физиологических функций клетки, работа которой во многом определяется состоянием проницаемости, пассивного и активного транспорта, а также стабильностью митохондриальных мембран [Скулачев В.П., 1997; 2007; Skulachev V.P., 2000; 2002; 2008]. Поэтому правомочно заключить, что даже незначительные структурные и функциональные сдвиги в митохондриальных мембранах, возникшие вследствие усиления процессов перекисного окисления, могут существенно нарушать функции клетки. Вместе с тем регуляторные пептиды, ингибируя кислородозависимые процессы, в мембране, способствуют сохранению > ее целостности и обеспечивают нормальное функционирование клетки. В этой связи перспективной представляется гипотеза о вызываемой пептидными регуляторами длительной* модификации характера экспрессии генов, кодирующих белки митохондриальных мембран [Khavinson V. Kh. et al., 2002, 2007].
Пептидный компонент регуляции проявляется на всех уровнях функционирования организма [Гомазков О.А., 1995; 2006; Шерстнев В.В. и соавт, 1999]. Одним из наиболее важных механизмов реализации разнообразных эффектов биологически активных пептидов является их нормализующее влияние на интенсивность свободнорадикального окисления в органах и тканях, что, как правило, сопровождается усилением клеточного и гуморального иммунитета, улучшением коагулогических показателей, повышением нейрональной активности, оптимизацией когнитивных функций и т.д. [Лысенко А.В. и соавт., 2005]. Особое значение приобретает пептидная регуляция при коррекции нарушений, вызванных воздействием на организм стрессорных факторов, способствующих ускоренному старению.
В* связи с этим можною рассматривать пептидные биорегуляторы как перспективные фармакологические средства, способствующие замедлению возрастных и стресс-индуцированных изменений в организме.
Исходя из вышеизложенного; весьма актуальным представляется проведение экспериментального изучения влияния коротких пептидов как антиоксидантов на интенсивность свободнорадикальных процессов на клеточном уровне, а также в различных органах при^ воздействии стресса и при старении. Это позволит выявить и оценить антиоксидантные эффекты коротких пептидов и возможные механизмы их реализации, что представляет значительный научно-практический интерес.
Цель и задачи исследования
Целью исследования являлось изучение влияния на свободнорадикальные процессы ряда геропротекторных препаратов, разработанных на основе коротких пептидов (эпиталон, вилон, пинеалон и др.), и возможных механизмов их антиоксидантного действия.
В рамках указанной целибыли поставлены следующие задачи:
Изучить возрастную динамику основных' показателей СРО и системы антиоксидантной защиты в крови, мозге и печени крыс.
Исследовать влияние геропротекторных пептидных препаратов на показатели свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы в сыворотке крови.и тканях крыс.
Изучить влияние геропротекторных пептидных препаратов на показатели свободнорадикального окисления и. антиоксидантной системы в условиях действия экстремальных факторов (гипоксия, гипокинезия).
Оценить антиоксидантную активность и мембранопротекторные свойства коротких пептидов в модельных экспериментах:
исследовать прямую антиоксидантную активность коротких пептидов;
исследовать влияние коротких пептидов на Ре2+-индуцированное окисление липопротеинов крови и скорость осмотического гемолиза эритроцитов;
изучить действие коротких пептидов на нейрональные клетки мозжечка.
5. Изучить механизмы защитного действия пептидных биорегуляторов при гипоксии:
исследовать влияние коротких пептидов на устойчивость крыс к воздействию гипобарической гипоксии;
исследовать влияние коротких пептидов (пинеалон) на состояние потомства крыс, подвергнутых воздействию гипобарической гипоксии;
исследовать влияние пинеалона на поведенческие реакции крысят, перенесших пренатальную гипоксию;
исследовать влияние пинеалона на нейрональные клетки мозжечка потомства крыс, подвергнутых воздействию гипобарической гипоксии;
исследовать влияние коротких пептидов на клетки нейробластомы человека при гипоксическом воздействии.
Научная новизна работы
Установлено, что в печени и сыворотке крови крыс при старении снижается уровень генерации активных форм кислорода, что сопровождается значительным подавлением активности системы антиоксидантной защиты. При этом выявлено заметное повышение уровня содержания в белках карбонилпроизодных аминокислот, что свидетельствует об использовании активных форм кислорода в реакциях окислительной модификации белков.
Возрастная динамика свободнорадикального окисления в гомогенатах мозга аналогичных изменений не претерпевает, однако впервые выявлена интенсификация свободнорадикальных процессов в митохондриях, выделенных из ткани коры больших полушарий и гипоталамуса старых крыс (24 мес.) по сравнению с молодыми животными (3 мес). Обобщены данные, полученные в отношении действия- коротких пептидов (эпиталон и его структурные аналоги, вилон и кортаген) на свободнорадикальные процессы и основные системы антиоксидантной защиты в крови, печени и мозге лабораторных животных (белые крысы линий ЛИО и Wistar, мыши линии СВА). Впервые'показано, что исследуемые пептидные препараты особенно-эффективны- как антиоксиданты при старении животных. Наиболее выраженные антиоксидантные свойства были выявлены у эпиталона. На примере эпиталона показано, что эффективность антиоксидантного действия пептидных биорегуляторов еще более возрастает при воздействии на организм экстремальных факторов (гипоксия, гипокинезия).
Впервые проведено изучение антиоксидантной активности и мембранопротекторных свойств эпиталона, вилона и других коротких пептидов (везуген, пинеалон) в модельных экспериментах in vitro. Установлено, что исследуемые пептиды не обладают прямой антиоксидантной активностью, но способны защищать липопротеиновые комплексы плазмы крови от Ре2+-индуцированного окисления и подавлять осмотический гидролиз эритроцитов.
Приоритетными являются исследования, проведенные в области изучения антигипоксических свойств коротких пептидов. Выявлена способность пинеалона, а также эпиталона и вилона защищать нейроны мозжечка потомства крыс, подвергнутых гипоксическому воздействию, от окислительного стресса, индуцируемого перекисью водорода или лигандом NMDA-рецепторов глутамата М-метил-Б-аспартатом. Неиропротекторное действие коротких пептидов показано также в экспериментах с
использованием клеток нейробластомы человека, культивируемых в условиях гипоксии. Установлено, что эпиталон и, отчасти, вилон проявляют антигипоксический эффект, препятствуя подавлению экспрессии металлопептидаз (неприлизина и инсулин-деградирущего фермента), участвующих в катаболизме р-амилоидного пептида, играющего исключительно важную роль в патогенезе весьма распространенной в пожилом и старческом возрасте болезни Альцгеймера.
Практическая ценность работы
Выявление антиоксидантной активности ряда коротких пептидов (эпиталон, вилон, кортаген, пинеалон и везуген) дает основание полагать, что она играет важную роль в механизмах геропротекторного действия этих биорегуляторов, поскольку ослабление мощности антиоксидантных систем организма является одной из ведущих причин развития возрастной патологии и преждевременного старения.
Показана возможность использования эпиталона и вилона в качестве стресспротекторных соединений при воздействии на организм таких сопутствующих старению неблагоприятных экологических факторов, как гипоксия и гипокинезия.
Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что ряд исследуемых коротких пептидов (пинеалон, везуген, эпиталон и вилон) обладают выраженными нейропротекторными свойствами, что проявляется в защите нервных клеток от окислительного стресса, развивающегося в результате гипоксического воздействия. Детальное изучение нейропротекторной роли указанных соединений создает предпосылки для разработки на их основе лекарственных средств для профилактики и терапии различных нейродегенеративных заболеваний, ассоциированных с возрастом. Особенно перспективны в этом отношении трипептиды пинеалон и везуген, которые могут быть использованы как биологические добавки к пище,
способствующие улучшению качества жизни и активного долголетия человека.
Основные положения, выносимые на защиту
Короткие пептиды (эпиталон, кортаген, вилон, пинеалон и везуген) обладают антиоксидантными свойствами в экспериментах in vivo и in vitro.
Антиоксидантные эффекты коротких пептидов (эпиталон, вилон) особенно наглядно проявляются при старении и в условиях действия на животных экстремальных факторов (гипокинезия, гипоксия).
Короткие пептиды (эпиталон, вилон, везуген и, особенно, пинеалон). обладают антигипоксическим действием, что выражается-в повышении' устойчивости животных к гипобарической гипоксии.
Пинеалон повышает активность антиоксидантных ферментов в мозгу и печени беременных самок крыс, подвергнутых воздействию гипобарической гипоксии, и обеспечивает защиту потомства» от ее последствий.
Короткие пептиды (пинеалон, эпиталон и вилон) при гипоксическом воздействии оказывают протекторное влияние на нейроны мозжечка крыс и клетки нейробластомы человека.
Апробация работы
Материалы исследования доложены и обсуждены на международной
конференции "Free radicals and antioxidants in the development and functions of
the central nervous system: from fetus to aging» (Saint-Petersburg, 2001),
международной научно-практической конференции «Медико-
психологическая реабилитация: современное состояние и перспективы развития» (Санкт-Петербург, 2004), международном симпозиуме «Молекулярные механизмы, регуляции функции клетки» (Тюмень, 2005), Всероссийской конференции «Перспективы фундаментальной геронтологии»
»
(Санкт-Петербург, 2005, 2006), IV национальном конгрессе геронтологов и гериатров Украины «Проблемы старения и долголетия» (Киев, 2005), 4-й, 5-й и 6-й национальных научно-практические конференциях с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота» (Смоленск, 2005, 2006, 2007), П и III Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург, 2005, 2006), I Съезде физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005), 4-й Российской конференции с международным участием «Гипоксия, механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2005), научной конференции с международным участием «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005), региональных научных конференциях «Геронтология: от кардиологии к социально-экономическим аспектам» (Сыктывкар, 2005, 2006), Всероссийской научной конференции «Перспективные направления^ использования лабораторных приматов в медико-биологических целях» (Сочи-Адлер, 2006), международной научной конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и старение» (Астрахань, 2006), VII Всероссийской конференции с международным участием «Биоантиоксидант» (Москва, 2006), VII Международном симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Харьков, Украина. 2006, 2007), научно-практической конференции, посвященной 20-летию первой в России кафедры гериатрии («Актуальные проблемы геронтологии и гериатрии», Санкт-Петербург, 2006), Ш и IV Всероссийских научно-практических конференциях "Общество, государство и медицина для пожилых и инвалидов" (Москва, 2006, 2007), Научно-практической конференции «Пожилой больной» (Москва, 2006), международной конференции 4th Bologna International Meeting "Affective, behavioral and cognitive disorders in the elderly-ABCDE"(Bologna, Italy, 2006), международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Ялта-Гурзуф, Крым, Украина, 2007), II Международном конгрессе "Социальная адаптация, поддержка и здоровье пожилых людей в современном
мире" (Санкт-Петербург, 2007), XIV Российском национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007), III, IV научно-практических геронтологических конференциях с международным участием, посвященной памяти Э.С. Пушковой, "Пушковские чтения" (Санкт-Петербург, 2007, 2008), XII Международном симпозиуме «Эколого-физиологические проблемы адаптации» (Москва, 2007), Межрегиональной научно-практической конференции «Медицинские проблемы пожилых» (Йошкар-Ола),' III Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пушино, 2007), II Международном конгрессе "Социальная адаптация; поддержка и здоровье пожилых людей в современном мире"' (Санкт-Петербург, 2007), П-м Санкт-Петербургском международном экологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008), конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург-Колтуши,2008), Конгрессе «Экотоксины и здоровье» (Санкт-Петербург, 2008), а также международных форумах: International conference "Free radicals andvantioxidants in the development and functions of the central nervous system: from fetus to aging» (Saint-Petersburg, 2001), 18th World Congress of Gerontology (Rio de Janeiro, Brazil, 2005), International Symposium «Interaction of the nervous and immune systems in health and disease» (Saint-Petersburg, 2007), 21st Biennial Meeting of International Society for Neurochemistry and the 38th Annual Meeting of the American Society for Neurochemistry (Cancun, Mexico, 2007), 4th International Peptide Symposium, 7th Australian Peptide Symposium, 2 Asia-Pacific International Peptide Symposium "Discovery to Drugs: The Peptide Pipeline" (Cairns, Queensland, Australia), VI European Congress International association of gerontology and geriatrics (Saint-Petersburg, 2007).
Похожие диссертации на Антиоксидантное действие геропротекторных пептидных биорегуляторов
![Организация службы скорой медицинской помощи сельского района в условиях дезорганизации здравоохранения вследствие боевых действий и проведения контртеррористических операций [Электронный ресурс]](/i/i/4288/213341.png "Организация службы скорой медицинской помощи сельского района в условиях дезорганизации здравоохранения вследствие боевых действий и проведения контртеррористических операций [Электронный ресурс] Байсултанов Идрис Хасаевич")
