Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Структурные и ферментативные характеристики миозина и его нитей
1.1. Состав молекулы миозина миокарда 8
1.2. Легкие цепи миозина миокарда 11
1.3. Функциональная роль легких цепей миозина миокарда 13
1.4. Изоформы легких и тяжелых цепей миозина миокарда 15
1.5. Состав миозина предсердий и желудочков в норме 16
1.6. Структура нитей миозина 16
1.6.1. Нативные нити сердечного миозина 16
1.6.2. Синтетические нити миозина 18
1.6.3. Роль легких цепей в проявлении структурных характеристик нитей миозина
1.7. Ферментативные характеристики миозина и его нитей 21
1.8. Роль легких цепей в актин-активируемой АТФ-азной активности миозина
ГЛАВА 2. Изменения в миозине миокарда при адаптации и патологии
2.1. Ремоделирование сократительного аппарата кардиомиоцитов при адаптационных процессах
2.2. Ремоделирование сократительного аппарата кардиомиоцитов при дилатационной кардиомиопатии
2.3. Ремоделирование сократительного аппарата кардиомиоцитов при гибернации
2.4. Внутрисердечная гемодинамика при клапанных патологиях 35
2.5. Патофизиология ишемических и реперфузионных повреждений миокарда
2.6. Биохимические маркеры повреждения миокарда 47
Резюме по обзору литературы 53
Цель исследования 54
Задачи исследования 54
Глава 3. Материалы и методы 55
3.1. Экспериментальный материал 55
3.2. Клинический материал 56
3.3. Выделение и очистка белковых препаратов 57
3.3.1. Выделение и очистка миозина из сердечной мышцы 57
3.3.2. Выделение и очистка легких цепей миозина из сердечной мышцы человека
3.3.3 Выделение и очистка актина скелетных мышц кролика 60
3.4. Определение АТФазной активности миозина суслика в присутствии актина
3.5. Определение концентрации белковых препаратов 62
3.6. Электрофорез в полиакриламидном геле 62
3.7. Иммуноблоттинг 63
3.8. Исследование концентрации тропонина-Т и аутоантител к ЛЦ миозина миокарда в венозной крови пациентов с помощью твердофазного иммуноферментного анализа 64
3.9. Методика искусственного кровообращения 65
3.10. Методика выполнения кардиоплегии 66
3.11. Методика статистической обработки материала 69
Результаты исследования и их обсуждения 70
ГЛАВА 4. Изучение поведения легких цепей миозина при адаптации и патологии
4.1. Изучение изменений в изоформном составе ЛЦ1 миозина миокарда в разных отделах сердца (предсердие, желудочек) при разных состояниях сусликов Spermophillus undulatus (зимняя спячка, пробуждение, активность)
4.2. Изучение изменений в изоформном составе ЛЦ1 миозина миокарда человека в желудочках сердца при развитии ДКМП
4.3. Изучение изменений в изоформном составе ЛЦ1 миозина миокарда левых отделов сердца человека при клапанной патологии
4.4. Изучение закономерности появления аутоантител к ЛЦ миозина миокарда в крови пациентов, оперированных по поводу клапанной патологии сердца
Заключение 94
Выводы 97
Практические рекомендации 98
Финансовая поддержка работы
- Функциональная роль легких цепей миозина миокарда
- Ремоделирование сократительного аппарата кардиомиоцитов при дилатационной кардиомиопатии
- Выделение и очистка легких цепей миозина из сердечной мышцы человека
- Изучение изменений в изоформном составе ЛЦ1 миозина миокарда человека в желудочках сердца при развитии ДКМП
Введение к работе
Актуальность темы: Сокращение продолжительности вегетационного периода любой сельскохозяйственной культуры является, наряду с повышением урожайности, улучшением качества урожая и устойчивостью к вредителям и болезням, одним из основных направлений селекции! Особенно актуальна данная проблема для нашей страны. Еще в 1932 году Н.И. Вавилов в своем докладе на конференции по планированию генетико-селекционных работ («Генетика на службе социалистического земледелия»), отмечал, что «...в условиях нашей северной страны, при континентальном климате, при наличии засух в летние месяцы, вопрос о вегетационном периоде является основным. Если для Германии и даже для Соединенных Штатов различия по вегетационному периоду сортов имеют ограниченное значение, то в наших условиях, с продвижением земледелия к северу и на восток, с необходимостью укорочения вегетационного периода на юге с целью ухода от засухи мы принуждены возделывать преимущественно сорта с коротким вегетационным периодом» (Вавилов, 1932). В. Пустовойт (1975) также отмечал чрезвычайную важность сортов с коротким вегетационным периодом, так как они дают возможность раньше проводить уборку урожая, что повышает значение подсолнечника как предшественника, в том числе и для южных районов, где сочетание раннеспелых сортов со среднеспелыми позволяет уменьшить напряженность в уборке, улучшить подготовку почвы под озимые культуры.
По мнению А. А. Жученко (1991), скороспелость, как таковая определяет ареал возделывания той или иной культуры.
Создание скороспелых сортов подсолнечника — одно из основных направлений селекции данной культуры с 1930-х годов. При этом основным селекционным методом, описанным в отечественной литературе, является метод индивидуального отбора из средне- и раннеспелых популяций, синтетических популяций и популяций межвидовых или межсортовых гибридов, который дает в большинстве случаев положительный результат. В зарубежной литературе сведения о создании скороспелых форм подсолнечника встречаются крайне редко.
В настоящее время производство подсолнечника в мире базируется в основном на возделывании гетерозисных гибридов, создание которых основано на получении инбредных линий и последующем их скрещивании. То есть, селекционный процесс при создании гибридов коренным образом отличается от процесса селекции сортов-популяций. На сегодняшний день создан ряд скороспелых линий и гибридов подсолнечника, однако в научной литературе недостаточно полно освещена методика их получения.
Селекция линий и гибридов подсолнечника на скороспелость требует знания корреляционных связей продолжительности отдельных фаз вегетационного периода между собой и с показателями продуктивности, а также анализа данных признаков. Изучение особенностей генетического контроля продолжительности межфазных периодов развития растений, как и других количественных признаков, определяющих продуктивность подсолнечника, оценка генетического потенциала линий, широко применяемых в селекционной программе, имеют большое значение для решения важной селекционной задачи - создания новых скороспелых гибридов и нового исходного материала для селекции скороспелых инбредных линий подсолнечника.
Цели и задачи исследования.
Цель работы. Создание скороспелых линий и гибридов подсолнечника в сочетании с селекцией на продуктивность.
Для достижения поставленной цели было предусмотрено решение следующих задач: - определить варьирование продолжительности вегетационного периода и его отдельных фаз у гибридов и инбредных линий подсолнечника рабочей коллекции ВНИИМК; - показать влияние продолжительности отдельных межфазных периодов на продуктивность гибридов подсолнечника; - изучить наследование продолжительности разных фаз вегетационного периода; выявить комбинационную способность инбредных линий подсолнечника по продолжительности отдельных межфазных периодов; - получить новый исходный материал для селекции инбредных линий подсолнечника с укороченным вегетационным периодом; - создать новые гибридные комбинации подсолнечника с укороченным вегетационным периодом; Научная новизна исследований.
Впервые проведен комплексный анализ продолжительности вегетационного периода и его отдельных элементов в связи с продуктивностью гибридов подсолнечника первого поколения; - на основании значений коэффициента детерминации установлено, что на 35-44% формирование урожая семян гибридов подсолнечника первого поколения зависит от продолжительности периода всходы — цветение и на 48-77% от продолжительности вегетационного периода. - установлено, что неаддитивные эффекты генов играют определяющую роль в наследовании продолжительности периодов всходы - «звездочка», «звездочка» - цветение, цветение - физиологическая спелость и всходы — физиологическая спелость; - аддитивные эффекты генов преобладают над неаддитивными в контроле продолжительности периода всходы - цветение.
Апробация работы и публикации результатов исследований: Основные результаты исследований доложены на 1ой и З е и всероссийских научных конференциях молодых ученых и студентов «Современное состояние и приоритеты развития фундаментальных работ в регионах» (Анапа, 2004, 2006 гг.), З е и и 4ой международных конференциях молодых ученых и специалистов «Актуальные вопросы селекции, технологии и переработки масличных культур» (Краснодар, 2005, 2007 гг.), 17ой международной конференции по подсолнечнику (Кордоба, Испания, 2008 г).
По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ общим объемом 1,05 печатного листа. * • > .
Работа выполнена в 2004-2008 гг. на центральной экспериментальной базе Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур имени В. Пустовойта (ЦЭБ ВНИИМК) (г. Краснодар).
Функциональная роль легких цепей миозина миокарда
Считается, что среди ЛЦ миозинов поперечно-полосатых мышц двухвалентные катионы связывает только первый N-концевой домен ЛЦ2, все остальные домены потеряли эту способность в результате делеций и неконсервативных аминокислотных замен (Strynadka & James, 1989). Этот 9-І участок ЛЦ2 способен связывать катионы Са и Mg. Са связывается с ЛЦ2 О Щ при концентрациях порядка 10" -10" М (Watterson et al., 1979), однако, при миллимолярных концентрациях Mg"+, в которых этот ион присутствует в у покоящейся мышце, константа связывания Са снижается до 10" М 9-і (Wikman-Coffelt, 1980) и поэтому участок занят ионами Mg . Связанный катион усиливает взаимодействие ЛЦ2 с а-спиралью тяжелой цепи миозина. В отличие от ЛЦ2, ЛЦ1 миозина миокарда у N-конца имеет дополнительный участок, состоящий приблизительно из 40 аминокислотных остатков. Особенность этого участка - высокое содержание пролина и аланина и их характерное повторение типа: про-ала-про-ала-про-ала и т.д. Был проведен тщательный анализ этой части ЛЦ1 (Timson & Trayer, 1997; Timson et al., 1998) и на его основании сделано заключение: этот участок представляет собой вытянутую стержневую структуру длиной около 4 нм; он обладает высокой устойчивостью в широком диапазоне условий среды; на его конце расположена последовательность, начинающаяся с ала-про-лиз-лиз, которая взаимодействует с актином.
Существует гипотеза, что N-конец ЛЦ1 может быть "якорем" между миозиновыми и актиновыми нитями и способствовать правильному пространственному расположению нитей миозина и актина относительно друг друга (Sweeney, 1995). Действительно, благодаря высокому содержанию аланина и пролина, N-конец ЛЦ1 представляет собой вытянутую структуру и его длина достаточна для перекрывания расстояния между миозинов ой нитью и актиновой нитями при сокращении (Rayment et al., 1993, Williamson, 1994).
Функциональная роль ЛЦ миозина миокарда остается не вполне ясной. АТФ-азный центр миозина локализован в тяжелой цепи. Однако, из атомной структуры миозиновой головки (Rayment et al., 1993) следует, что ЛЦ находятся в ее функционально важном районе (Рис. 1.2) и поэтому не могут не влиять на работу молекулярного мотора. Регуляторная легкая цепь миозина ЛЦ2, ассоциирована с тяжелой цепью миозина у основания миозиновой головки. Принято считать, что в поперечно-полосатой мышце основная роль ЛЦ2 заключается в стабилизации ассоциированных с ними участков тяжелой цепи регуляторного домена. В скелетных и сердечных 9-4 мышцах она фосфорилируется Са -кальмодулин-зависимой киназой легких цепей миозина (Sweeney et.al., 1993). Дефосфорилирование РЛЦ осуществляется фосфатазой 1 (Mumby et.al., 1987; Hartshome et.al., 2004).
Таким образом, функциональная роль ЛЦ2 может состоять в модулировании свойств миозина не только при связывании двухвалентных катионов, но при фосфорилировании (Левицкий, 1987).
Фосфорилирование ЛЦ2 в сердечных и скелетных мышцах увеличивает Са"+-чувствительность развития изометрической силы, что выражается в увеличении рСа5о и в сдвиге кривой зависимости сила/рСа влево (Sweeney et.al., 1993). На величину максимальной силы (Fmax) фосфорилирование ЛЦ2 влияет незначительно. Увеличение развития силы при субмаксимальных концентрациях Са + связывается с отходом миозиновых мостиков от ствола толстой нити. Отход мостиков увеличивает доступность миозиновых головок для взаимодействия с актином, и мышца быстрее реагирует на повышение концентрации Са (Sweeney et.al., 1993).
Есть основания полагать, что благодаря наличию у ЛЦ1 контактной области с ЛЦ2, она вносит вклад в регуляторные свойства ЛЦ2 (Lowey & Trybus, 1995; St pkowski et al., 1994; Stepkowski et al.,1997; Ho & Chisholm 1997). Поэтому даже удаление N-концевого участка ЛЦ1 может нарушать важные взаимодействия внутри моторного домена (Podlubnaya et al., 20006). ЛЦ1 может обеспечивать передачу информации о состоянии ЛЦ2 (т.е. о ее фосфорилировании или связывании Са ) моторному домену. Например, удаление небольшого участка аминокислотной последовательности от N-конца ЛЦ1 с помощью ограниченного протеолиза приводит к исчезновению Са2+-зависимых структурных переходов в синтетических нитях сердечных и скелетных мышц (Podlubnaya et al., 1999; 2002; Подлубная и др., 1996). Известно также, что мутации и потеря ЛЦ1 и ЛЦ2 часто связаны с серьезными патологиями сердечной мышцы. Таким образом, есть основания считать, что оба класса легких цепей оказывают влияние на сократительный процесс.
Ремоделирование сократительного аппарата кардиомиоцитов при дилатационной кардиомиопатии
При снижении ионной силы до 0.2-0.1 М in vitro, молекулы миозина агрегируют, формируя синтетические нити (Huxley, 1963). По своей структуре эти нити напоминают нативные за исключением того, что они гетерогенны по длине, тогда как нативные нити имеют одинаковую длину. Кроме того, в отсутствие ионов кальция большинство головок миозина на поверхности синтетических нитей плотно прижаты к стволу нити, формируя так называемые ряды с периодичностью 14.5 нм (Podlubnaya et al., 1999; 2002), тогда как в тех же условиях головки миозина поперечно-полосатых мышц позвоночных на поверхности нативных толстых нитей показывают спиральное расположение с субъединичным периодом 14.5 нм (Levine, 1997).
Ранее предполагалось, что миозин поперечно-полосатых мышц не обладает ферментативной Са -чувствительностью. Она была показана позднее на волокнах, миофибриллах, а также на нативных и синтетических миозиновых нитях (Lehman, 1978; Chin & Rowe, 1982; Pulliam et al., 1983; Freidina et al., 1986). Согласно данным, полученным в нашей лаборатории, 0-4 синтетические нити миозина обладают структурной Са" -чувствительностью, то есть способностью при изменении концентрации Са"+ в среде претерпевать структурные переходы типа "порядок-беспорядок" (Подлубная и др., 1996; Подлубная, 1999; Podlubnaya et al, 1999; 2000а; 2002). В присутствии Са" (рСа 4.6) головки миозина отходят от ствола нити и периодичность их расположения теряется. При этом субфрагменты-2 также отходят от ствола, и головки видны на расстоянии до 50 нм от поверхности нити (Подлубная и др., 1996; Подлубная, 1999; Podlubnaya et al., 2000а, б).
Таким образом, благодаря вышеуказанным особенностям, синтетические нити миозина являются удобным и широко используемым объектом для тестирования структурных характеристик миозина. В нашем исследовании использование системы синтетических нитей для контроля структурных и ферментативных характеристик миозина имеет такое преимущество над моделью толстых нитей, как однородность и постоянство состава вследствие отсутствия минорных белков. Кроме того, исследование структурных особенностей головок в нитях позволит оценить изменения в составе легких цепей миозина (Podlubnaya et.al., 20006). Роль легких цепей в проявлении структурных характеристик нитей миозина
В проявлении структурных характеристик миозина, также как и его нитей, важны оба класса легких цепей. Показано, что их фосфорилирование, мутации, протеолиз, а также снижение содержания в миозине могут влиять на структурные характеристики миозиновых нитей.
Фосфорилирование ЛЦ2 приводит к отходу головок миозина от ствола нативнои нити, вызывая в расположении миозиновых головок на поверхности нити структурный переход типа «порядок - беспорядок» (Sweeney et al., 1993; Levine et al., 1996). Функционально это проявляется в усиленной подвижности головок, увеличении скорости силы, развиваемой волокном, и его Са +-чувствительности. Предполагается, что отрицательные заряды фосфатных групп нейтрализуют положительные заряды N-конца ЛЦ2, которые, электростатически взаимодействуя со стволом нити, прижимают головки к стволу в отсутствие Са2+. Таким образом, структурный переход является результатом изменения взаимодействия ЛЦ2 (Levine et al., 1998) и субфрагмента-2 (Podlubnaya et al, 1999) со стволом нити. Это предположение подтверждается экспериментами по нейтрализации положительных зарядов остатков серина и треонина (которые являются мишенями при фосфорилировании), в которых наблюдался такой же эффект на структуру нитей, как и при фосфорилировании.
Удаление ЛЦ2 также имеет сильный эффект на структуру нативных толстых нитей — головки отходят от ствола на значительное расстояние и агрегируют друг с другом. В результате их расположение на поверхности нитей теряет осевую периодичность (Levine et al., 1998). Исследование синтетических нитей ЛЦ2-дефицитного миозина показало, что такой миозин формирует более короткие, чем нативные, нити с измененной формой головок и тенденцией к пучкованию (Lowey et al., 1993; Chowrashi et al., 1989; Podlubnaya, et al., 20006).
Некоторые мутации в ЛЦ2 также сопровождаются потерей упорядоченности расположения головок на поверхности нативных нитей. Это описано для нативных нитей миозина, выделенных из миокарда пациента с наследственной формой гипертрофической кардиомиопатии, при которой найдены мутации в ЛЦ2. Головки таких нитей оказались неспособными перейти в упорядоченное состояние даже при длительной инкубации миозина в релаксирующем растворе (Levine, 1998), что свидетельствует о потере миозином структурной Са2+-чувствительности (Подлубная и др., 1996).
Важность ЛЦ2 демонстрируют также эксперименты с их избирательным протеолизом протеазой мекратином, которая активируется, например, при дилатационной кардиомиопатии. В этом случае расщепление 40% - 70% ЛЦ2 приводит к потере периодичности в расположении головок и к изменению их грушевидной формы. Изолированные толстые нити и синтетические нити такого "патологического" миозина, как правило, имеют меньший диаметр и длину (Margossian et al., 1992; Levine et al., 1999).
Для нормальной структуры миозиновых нитей не менее важны и ЛЦ1. Они, как и ЛЦ2, придают жесткость глобулярной части тяжелой цепи молекулы миозина и, таким образом, регулируют подвижность миозиновой головки. Как отмечено выше, протеолитическое отщепление небольшого N-концевого фрагмента ЛЦ1 приводит к потере миозином структурной Са" -чувствительности, изменению формы головок от грушевидной до сферической и к агрегации миозиновых нитей друг с другом (Podlubnaya et al., 20006).
Выделение и очистка легких цепей миозина из сердечной мышцы человека
Увеличенное образование свободных радикалов кислорода в ишемизированном сердце и связанное с этим усиление процессов пероксидации липидов (оксидативный стресс), сопровождается рядом нарушений в свойствах биологических мембран и функционировании клеток: во-первых, перекисное окисление липидов сопровождается окислением тиоловых (сульфгидрильных) групп мембранных белков, в результате неферментативной реакции SH-групп со свободными радикалами липидов. Инактивация ион-транспортных ферментов Са +- АТФ-азы, в активный центр которых входят тиоловые группы вызывает замедление «откачивания» ионов кальция из клетки и, наоборот, вход кальция в клетку, увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция и повреждение клетки. Окисление тиоловых групп мембранных белков приводит к появлению дефектов в липидном слое мембран клеток и митохондрий. Под действием разности электрических потенциалов на мембранах через такие дефекты в клетку входят ионы натрия, а в митохондрии- ионы калия. В результате увеличивается осмотическое давление внутри клеток и митохондрий, что способствует еще большему повреждению мембран.
Вторая важная причина, приводящая к нарушению целостности липидного слоя мембран и потере ею барьерных свойств, - гидролиз мембранных фосфолипидов ферментами — фосфолипазами типа А. В мембранах они обычно находятся в малоактивном состоянии. Фосфолипазы активируются ионами кальция, концентрация которого в цитоплазме составляет (10 "7 моль/л и менее) в норме. Выключение кальциевых насосов за счет недостатка АТФ в клетке приводит к увеличению кальция в цитоплазме и активации фосфолипаз, в результате нарушаются барьерные свойства мембран (Рубин, 1987; Антонов, 1998; Адо, 2000; Владимиров, 2000). .
Еще очень важную роль в повреждении мембран играют процессы их механического растяжения в результате нарушения осмотического равновесия в клетках. Усиление процессов перекисного окисления липидов и активация мембранных фосфолипаз при гипоксии повышают осмотическую концентрацию ионов внутри клетки, и последние набухают. Это приводит к растяжению мембран и образованию «крупных» микропор (Рубин, 1987; Антонов, 1998; Адо, 2000; Владимиров, 2000).
В нормально функционирующей клетке, т.е. при нормально протекающей обменной диффузии (ионы калия и натрия, анионы хлора), микропоры не превышают 0,4-0,6 нм (Chang et.al., 1990; Адо., 2000; Melikov et.al., 2001); при ишемическом повреждении они могут достигать 9 нм (Антонов. 1998; Адо., 2000). Появление «крупных» микропор ведет к изоосмотическому «взрывному» набуханию клетки, к еще большему перерастяжению, а в дальнейшем и к разрыву клеточных мембран. Поврежденные участки мембран могут подвергаться лизису образуя «бреши» в плазмолемме (локальные разрушения мембраны), размеры которых могут достигать 1 мкм, что ведет к гибели клетки (Адо., 2000; Владимиров Ю.А., 2000).
Все выше перечисленные процессы: ПОЛ, действие мембранных фосфолипаз, механическое растяжение мембран — приводят к снижению электрической прочности липидного слоя мембран, и участок мембраны разрушается электрическим током, который возникает под влиянием разности потенциалов, существовавшей на мембране — явление «электрического пробоя» (Рубин, 1987; Антонов, 1998; Адо, 2000; Владимиров, 2000).
В основе электрического пробоя мембраны лежит самопроизвольное зарождение дефектов в липидном бислое вследствие теплового движения фосфолипидных молекул. Более того, под действием сил поверхностного натяжения спонтанно образовавшийся дефект (пора) сразу же затягивается, и мембрана остается целой (Рубин, 1987; Антонов, 1998; Адо, 2000; Владимиров, 2000).
Для патологии клетки является чрезвычайно важным то обстоятельство, что электрическая прочность мембран, мерой которой служит потенциал пробоя, снижается под действием повреждающих факторов.
Электрический пробой мембраны может наблюдаться под действием собственного мембранного потенциала, т.е. разности потенциалов, возникающей на мембране в результате диффузии ионов. Это не происходит в нормально функционирующих неповрежденных клетках, потому что потенциалы пробоя мембран U выше, чем разности потенциалов, существующие на клеточных и внутриклеточных мембранах (LP U).
При повреждении мембранных структур потенциал пробоя U снижается и может, сложиться ситуация LP U когда мембрана будет «пробиваться» собственным мембранным потенциалом.
Самопроизвольному росту пор, случайно зародившихся в липидном бислое, препятствуют силы поверхностного натяжения на границе раздела фаз липидный слой мембраны-окружающий водный раствор. Нужно приложить довольно большую разность потенциала к мембране, чтобы преодолеть эти силы и вызвать рост поры, поэтому вещества, снижающие поверхностное натяжение (детергенты), должны облегчать самопроизвольный рост пор и снижать величину критического потенциала, который нужно приложить к мембране, чтобы вызвать электрический пробой. Продукты ПОЛ, таюке как и продукты гидролиза фосфолипидов фосфолипазами (лизолецитины), и многие белки снижают поверхностное натяжение на границах раздела фаз. Именно поэтому они снижают потенциал пробоя мембран, т.е. уменьшают их электрическую прочность. Механическое растяжение мембраны действует сходно, так как противодействует силам поверхностного натяжения. Таким образом, электрический пробой мембран оказывается универсальным механизмом нарушения барьерной функции мембран в патологии. (Антонов. 1998; Адо., 2000; Владимиров Ю.А., 2000).
Изучение изменений в изоформном составе ЛЦ1 миозина миокарда человека в желудочках сердца при развитии ДКМП
Концентрацию миозина, легких цепей миозина, а также актина определяли спектрофотометрически, используя следующие значения коэффициентов экстинкции (Е28о1мгмл): 0.543 для доколоночного миозина, 0.52 для колоночного миозина (Kielley, Harrington, 1960; Godfrey, Harrington, 1970), 0.086 для ЛЦ1 и 0.6 для ЛЦ2 (Katoh, Lowey, 1989), 1.09 для актина (Rees, Young, 1967).
Изучение качественных и количественных изменений легких цепей миозина сердечной мышцы сусликов при зимней спячки, а также человека при ДКМП и клапанных патологиях проводили с помощью ДСН-гель-электрофореза в 13% полиакриламидном геле по методу (Laemmli, 1970). Использовали пластинки геля размером 8x10 см при толщине 0,75-1,0 мм. Концентрирующий гель содержал 2,92% акриламида, 0.08% метиленбисакриламида и 0.125 М трис-HCl, рН 6.8. Разделяющий гель содержал 14,6%о акриламида, 0.4% метиленбисакриламида и 0.375 М трис-НС1, рН 8.9. Гели полимеризовали добавлением 0.05% (по объему) тетраметилэтилендиамина и персульфата аммония. Раствор для заполнения электродной камеры содержал 0.192 М глицина, 0.025 М триса и 0,1% ДСН, рН 8.3. К раствору, находящемуся в верхней электродной камере, добавляли Р-меркаптоэтанол до концентрации 0,01%.
Образцы сердечных мышц инкубировались в солюбилизирующем растворе, содержащем 10 мМ трис-НС1, 1% ДСН, 10% глицерина, 6 мМ ЭДТА, 80 мМ ДТТ, 8 мкг/мл леупептина, рН 6.8—7.0. Денатурацию белковых препаратов миозина и актина проводили в течение 2-3 минут при 95-100С в солюбилизирующем растворе, содержащем 12 мМ трис-HCl, 0.5%) ДСН, 5% глицерина, 16 мМ ДТТ, рН 6.8-7.0. Для визуального наблюдения за ходом электрофореза к образцам добавляли небольшое количество бромфенолового синего. В каждый карман геля наносили по 5-10 мкг белка или 20-25 мкг мышечного экстракта после их инкубации в солюбилизирующем растворе.
Электрофорез проводился в течение 2 часов при постоянном напряжении 120 В. По окончании электрофореза гели фиксировали 30-40 мин в растворе, содержащем 45%) этанола и 10% уксусной кислоты, и окрашивали в течение 30 мин в 0.125% Кумасси ярко-голубом в том же растворе. Отмывка окрашенных гелей проводилась в 7% уксусной кислоте.
Денситометрия белковых полос в геле проводилась с помощью компьютерной программы Total Lab 1.11. Для расчета соотношений легких цепей использовали следующие значения молекулярных весов: ЛЦ1п - 28 кДа, ЛЦ1ж - 25 кДа, ЛЦ2п - 19 кДа, ЛЦ2ж - 18 кДа (Могапо, 1999).
Иммуноблоттинг легких цепей миозина проводили по методу (Towbin et al., 1970). Перенос белка из полиакриламидных гелей на нитроцеллюлозные мембраны (диаметр пор 0.45 мкм) после электрофореза проводили в трис-глицин/метанольном буфере с добавлением ДСН при напряженности поля 0.8 мА/см2 в течение 1,5-2,0 часов при постоянном охлаждении. Неспецифическую сорбцию белков мембранами блокировали 5% раствором обезжиренного молока в течение 1 часа при комнатной температуре в фосфатном солевом буфере (ФСБ), содержащем 7 мМ Na2HP04x12 Н20, 2,5 мМ NaH2P04x2 Н20, 154 мМ NaCl, рН 7,2. Инкубацию как с первичными, так и вторичными антителами проводили в течение 1 часа в ФСБ с 0.05% Твин-20. Использовали поликлональные антитела к ЛЦ миозина. В качестве вторичных антител использовали кроличьи антитела против IgG мышей, конъюгированные с пероксидазой хрена. Белковые полосы выявляли с помощью З.З -диаминобензидина. Время экспозиции иммуноблотов варьировали от 1 до 5 минут в зависимости от интенсивности окраски.
Для оценки концентрации аутоантител к ЛЦ миозина в венозной крови 50-ти пациентов. Легкие цепи миозина, полученные из миокарда левого желудочка «здоровых» пациентов, использовали в качестве антигена для дальнейшего выявления аутоантител в крови у пациентов. Забор крови для исследований осуществляли интраоперационно до искусственного кровообращения (исходные данные) и после восстановления коронарного кровотока по схеме через 3, 6, 9, 12, 18, 24, 36 часов. Для получения плазмы кровь была отцентрифугирована при 500 g. Измерение концентрации аутоантител к ранее выделенным ЛЦ миозина миокарда осуществлялось с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА) (Практикум по иммунологии, 2004).
Этапы эксперимента были следующие:
В лунки планшета вносили по 100 мкл антигена в солевом растворе 1М ЫаНСОз- Инкубировали ночь в холодильнике при 4С. После инкубации, каждую лунку промывали 200 мкл ФСБ с 0,05% твин 20 с целью удаления не связавшихся компонентов. Затем проводили блокировку свободной твердой фазы, внося 1%-ый БСА, растворенный в ФСБ-твин, во все лунки планшета по 150 мкл. Инкубировали 1ч в термостате при 37С. После этого, в лунки планшета вносили по 100 мкл исследуемой сыворотки. Инкубировали 1ч в термостате при 37С. Затем в лунки планшета вносили конъюгат в рабочем разведении по 100 мкл. Инкубировали 1ч в термостате при 37С. После инкубации во все лунки вносили по 100 мкл субстрактной смеси, накрывали планшет черной бумагой и выдерживали при комнатной температуре 10-30 мин. Измеряли оптическую плотность растворов на ИФА-ридере при длине волны 492 нм.
Для оценки результатов строили калибровочный график зависимости оптической плотности от разведения - антител. Для этого готовили последовательное разведение первичных и вторичных антител: 1:128000; 1:64000; 1:32000; 1:16000; 1:80000; 1:6400; 1:4000; 1:3200; 1:2000; 1:1600; 1:1000; 1:800; 1:400; 1:200; 1:100.
Измерения проводили, предусмотрев необходимые для этого метода контроли: - Отсутствие антигена на твердой фазе, т.е. «фундамента», на котором последовательно будет строиться иммунный комплекс; для этого лунки не сенсибилизируют, т.е. вместо раствора антигена в лунки вносят ФСБ-твин; - контроль субстрата - в сенсибилизированные лунки вносят только субстратную смесь, а на промежуточных этапах вместо сыворотки и конъюгата вносят ФСБ-твин; - контроль конъюгата - в сенсибилизированные лунки вместо сыворотки вносят ФСБ-твин; контроль выявляет неспецифическое связывание конъюгата с антигеном; - отрицательный контроль - нормальная сыворотка крови в ФСБ-твин.
