Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Влияние различных факторов на устойчивость семени животных к замораживанию 9
1.2. Методы улучшения биологической полноценности спермы быков, подвергнутой глубокому замораживанию 15
1.3. Приемы искусственного регулирования соотношения полов в потомстве животных 23
1.4. Разделение сперматозоидов животных по полу с помощью высокоскоростной проточной цитометрии 32
2. Методика исследований 43
3. Результаты исследований 55
3.1. Изучение криозащитного влияния на сперму быков сукцината хитозана 55
3.1.1. Анализ криозащитного влияния сукцината хитозана при глубоком замораживании семени быков 55
3.1.2. Результативность искусственного осеменения коров спермой, замороженной с сукцинатом хитозана 58
3.2. Выяснение защитного влияния различных эфиров глицерина при замораживании семени быков 59
3.2.1. Влияние моноэтилового эфира на подвижность и живучесть оттаянных сперматозоидов 59
3.2.2. Изучение криозащитного влияния на сперму быков монометилового эфира глицерина 61
3.2.3. Результативность искусственного осеменения коров спермой, замороженной с монометиловым эфиром глицерина 63
3.3. Выяснение результативности искусственного осеменения коров спермой, замороженной в усовершенствованной трис-фруктозо-лимоннокислой среде в сравнении с лактозо-глицерино-желточной средой 64
3.4. Изучение криопротективного влияния на сперму быков бычьего и человеческого сывороточного альбумина 67
3.5. Изучение эффективности использования разделенной по полу спермы для искусственного осеменения крупного рогатого скота 70
3.5.1. Определение биологических и микробиологических показателей сексированной спермы быков, полученной из разных фирм 70
3.5.2. Анализ подвижности и живучести сперматозоидов быков с помощью автоматической системы контроля качества спермы «Sperm Vision» 74
3.5.3. Изучение уровня АТФ и концентрации антиокислительных ферментов в сексированных сперматозоидах быков 78
3.5.4. Результативность искусственного осеменения коров и телок сексированным семенем 81
Обсуждение результатов 84
Выводы 92
Практические предложения 94
Список литературы 95
- Методы улучшения биологической полноценности спермы быков, подвергнутой глубокому замораживанию
- Разделение сперматозоидов животных по полу с помощью высокоскоростной проточной цитометрии
- Выяснение защитного влияния различных эфиров глицерина при замораживании семени быков
- Выяснение результативности искусственного осеменения коров спермой, замороженной в усовершенствованной трис-фруктозо-лимоннокислой среде в сравнении с лактозо-глицерино-желточной средой
Введение к работе
Актуальность работы. В связи с широкомасштабным использованием для искусственного осеменения крупного рогатого скота криоконсервированной спермы, необходимо дальнейшее совершенствование технологии её глубокого замораживания. В технологии криоконсервации спермы быков имеется целый ряд проблем, решение которых позволило бы улучшить результативность осеменения животных.
В частности, при глубоком замораживании семени быков в процессе технологической обработки погибает более половины половых клеток.
Кроме того, оплодотворяемость самок при использовании криоконсервированной спермы все еще остается не достаточно высокой, а в последние годы отмечается снижение результативности искусственного осеменения коров в высокопродуктивных стадах во многих странах мира.
Поэтому требуются дальнейшие углубленные исследования в области совершенствования синтетических разбавителей, предназначенных для глубокого замораживания спермы быков, с целью улучшения сохранности биологической полноценности сперматозоидов в процессе их технологической обработки. При этом значительный интерес представляет поиск новых, более эффективных криопротекторов и других биологически активных веществ, способных увеличить выживаемость сперматозоидов в процессе криоконсервации и их фертильность.
Не менее важное научное значение имеет задача целенаправленного регулирования соотношения полов потомства у крупного рогатого скота.
Как известно, во многих отраслях животноводства, продуктивность особей разного пола значительно отличается. Например, для молочного скотоводства было бы выгоднее, чтобы в потомстве у коров рождалось больше телочек. Эта проблема особенно актуальна для нынешнего состояния в молочном скотоводстве, так как в связи с интенсификацией данной отрасли и снижением продуктивного долголетия коров, отмечается недостаточное получение в хозяйствах телочек, необходимое для расширенного воспроизводства стада.
И наоборот, получение большего количества потомков мужского пола могло бы повысить рентабельность мясного скотоводства.
Кроме того, использование спермы быков, содержащей фракции сперматозоидов с Х- или Y- половой хромосомой, может найти широкое применение в программах оплодотворения ооцитов in vitro и дальнейшей трансплантации сексированных эмбрионов, с целью значительного ускорения селекционно-генетического прогресса в разводимых стадах КРС.
В последние годы американскими исследователями разработана технология разделения сперматозоидов животных по полу с помощью высокоскоростной проточной цитометрии и во многих странах проходит производственная проверка эффективности данного метода при искусственном осеменении коров и телок.
В этой связи необходимы исследования биологической полноценности криоконсервированной сексированной спермы быков и эффективности ее использования для искусственного осеменения коров и телок и в нашей стране.
Цель її задачи исследований. Целью данной работы является изучение результативности искусственного осеменения коров и телок спермой быков, замороженной в усовершенствованных синтетических разбавителях, а также выяснение эффективности использования разделенной по полу спермы.
Для достижения этой цели в диссертации были поставлены следующие задачи: - изучить криозащитное влияние на сперму быков сукцината хитозана; - выяснить защитное влияние различных эфиров глицерина при глубоком замораживании семени быков; проанализировать результативность осеменения коров спермой, замороженной в усовершенствованной трис-фруктозо-лимоннокислой среде в сравнении с лактозо-глицерино-желточной средой; исследовать криопротективное влияние на сперму быков бычьего и человеческого сывороточного альбумина; изучить биологические и микробиологические показатели сексированной спермы быков, полученной из разных зарубежных фирм; выяснить эффективность использования разделенной по полу спермы быков для искусственного осеменения коров и телок.
Научная новизна исследований. Изучено криозащитное влияние на сперму быков сукцината хитозана. Выяснено влияние моноэтилового и монометилового эфиров глицерина на устойчивость семени быков к глубокому замораживанию.
Проанализировано протективное действие бычьего и человеческого сывороточного альбумина при криоконсервации спермы быков.
Проведены сравнительные испытания результативности осеменения коров спермой, замороженной в усовершенствованной трис-фруктозо-лимоннокислой и лактозо-глицерино-желточной среде.
Исследованы биологические и микробиологические показатели сексированной спермы быков, полученной из разных зарубежных фирм.
Изучены показатели подвижности и живучести оттаянной сексированной спермы быков с помощью автоматической системы анализа спермы - «Sperm Vision» и определенны её некоторые биохимические показатели.
Исследована результативность искусственного осеменения коров и телок криоконсервированной разделенной по полу спермой.
Практическая значимость. Подтверждено, что применение усовершенствованной трис-фруктозо-лимоннокисло-желточной среды для замораживания спермы быков способствует повышению живучести и оплодотворяющей способности сперматозоидов быков в сравнении с лактозо-глицерино-желточной средой.
Установлено, что при осеменении телок разделенной по полу спермой, возможно получать удовлетворительные для практики результаты оплодотворяемости самок. В потомстве телок, осемененных сексированной спермой, значительно повышен процент самок, в сравнении с использованием обычной спермы.
Использование сексированной спермы для искусственного осеменения коров приводит к значительному снижению оплодотворяемости, в сравнении с применением обычной криоконсервированной спермы, и является экономически нецелесообразным.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:
Ученых Советах ВНИИплем, 2009-2010 г.г.;
Научно-производственной конференции на ВВЦ, 2010 г.;
Научной конференции Российского Университета Дружбы Народов, 2010 г.;
Расширенной межотдельской конференции ВНИИплем, 2010 г.;
14-й Европейской конференции по размножению сельскохозяйственных животных, г. Эгер, Венгрия, 2010 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 2 в рекомендуемых ВАК журналах.
Основные положения, выносимые на защиту: - Добавление сукцината хитозана в состав замораживающей среды для спермы быков повышает живучесть оттаянных сперматозоидов, но не увеличивает их фертильность.
Осеменение коров спермой, замороженной с низкой концентацией монометилового эфира, не снижает результативности осеменения коров по сравнению с использованием глицерина.
Осеменение коров спермой, замороженной в усовершенствованной трис-фруктозо-лимоннокислой среде повышает оплодотворяемость в сравнении с применением лактозо-глицерино-желточной среды. - Использование сексированной спермы для осеменения телок, позволяет получать приемлемую для практики оплодотворяемость и увеличивает получение в потомстве особей женского пола до 90 %.
Объем работы. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методики исследований, результатов исследований, выводов и практических предложений. Диссертация включает 21 таблицу. Список литературы содержит 232 источника, в том числе - 162 на иностранном языке.
Методы улучшения биологической полноценности спермы быков, подвергнутой глубокому замораживанию
Как известно, в настоящее время в практике скотоводства большинства стран мира широкое применение получило искусственное осеменение крупного рогатого скота с использованием замороженной спермы быков.
Одним из главных событий в области криоконсервации семени сельскохозяйственных животных явилось обнаружение защитного действия глицерина при замораживании спермы животных и птиц (Polge С. е. а., 1949; Polge С, Rowson L.E., 1952).
Но до сих пор механизм защитного действия глицерина при замораживании семени животных не выяснен окончательно.
Установлено, что введение глицерина в состав раствора, способствует снижению точки его замерзания (Пушкарь Н.С. и др., 1984). Проникая внутрь клетки, глицерин замещает определенный объем свободной воды, выполняет функцию противосолевого буфера и способствует переохлаждению системы.
Впервые защитное действие глицерина при замораживании спермы животных обнаружили отечественные исследователи еще в 1937 году (Бернштейн А.Д., Петропавловский В.В., 1937).
Но затем эти исследования были прекращены и только после повторного открытия защитного действия глицерина английскими исследователями в 1949 году, он стал применяться для практики криоконсервации семени животных и птиц (Polge С. е. а., 1949).
Экспериментальным путем было выяснено, что продолжительность эквилибрации спермы с глицерином перед замораживанием должна составлять 4-6 часов (Платов Е.М., 1963; Осташко Ф.И., 1978; Nagase Н., NiwaT., 1964).
При замораживании спермы быков глицерин вводят в состав разбавителя обычно в концентрации 4-7% (Пакенас П.И., 1972; Наук В.А., 1982; Nagase Н., Niwa Т., 1964).
Но в дальнейшем было выяснено, что несмотря на положительное криозащитное влияние, глицерин может оказывать и негативное влияние на сперматозоиды при замораживании (Варнавский А.Н., 1970; Watson P.F., Martin J.C., 1975). Например, он вызывает повреждения акросом и плазматических мембран сперматозоидов. Кроме того,, он может ингибировать дыхательную активность в сперматозоидах.
Имеются данные, что глицерин стимулирует акросомную реакцию в половых клетках (Slavik Т., 1987).
Но многочисленные эксперименты показали, что замораживание спермы быков без глицерина вызывало резкое снижение оплодотворяемости самок (Лопатко М.И., Тюпина К.Ф., 1971; Gibson CD., Graham E.F., 1969).
Проведено много исследований по изучению возможности замены глицерина в составе разбавителей для спермы быков на другие соединения.
В частности, было установлено криозащитное действие на сперму быков диметилсульфоксида (Lovelock J.E., Bishop M.W., 1959), этиленгликоля и диэтиленгликоля (Платов Е.М., 1973), диметилформамида (Бугров А.Д. и др., 1972) и полиэтиленоксида (Осташко Ф.И., 1978).
Однако, данные соединения не проявили каких-либо преимуществ по сравнению с глицерином при глубоком замораживании спермы быков, а некоторые оказались даже токсичными для половых клеток (Watson P.F., 1979; FahyG.M., 1986).
Дальнейшим важным открытием в области криоконсервации семени быков было установление защитного действия желтка куриных яиц от холодового удара сперматозоидов (Phillips Р.Н., Lardy Н.А., 1940).
Более высоким криозащитным действием на сперматозоиды животных обладают липопротеиды желтка куриных яиц (Семенова В.А., 1987; Campachmidt R.F. е.а., 1953).
Механизм криозащитного действия желтка куриных яиц на сперматозоиды животных также выяснен не полностью.
Так, Милованов В.К. и Соколовская И.И. (1959) криозащитное влияние желтка связывают со способностью лецитина проникать -, внутрь сперматозоидов и понижать точку плавления липидов.
Согласно Осташко Ф.И. (1978), защитное действие желтка обусловлено его связыванием с поверхностью клеток и образованием с липопротеидами гидрофобной фазы, в результате чего замедляется осмотический обмен между клеткой и инкубационной средой.
Английские исследователи с помощью флуоресцентных зондов доказали, что яичный желток способен связываться с плазматической мембраной сперматозоидов (Watson P.F., 1975).
По данным Кононова В.П. (1984), защитное действие желтка на сперматозоиды при замораживании обусловлено его способностью разупорядочивать липиды в плазматических мембранах.
Аналогичные выводы по поводу защитного действия желтка были получены и в исследованиях Ерохина А.С. с сотрудниками (1989).
Разделение сперматозоидов животных по полу с помощью высокоскоростной проточной цитометрии
В последние годы во многих странах мира для разделения спермы по полу используют метод проточной цитометрии, основанный на различном содержании ДНК в сперматозоидах (Garner D.I. е.а., 1983; Welch G.R., Johnson L.A., 1999; Seidel G. е.а., 2002). В 1979 году было установлено, что X-хромосома млекопитающих содержит большее количество ДНК по сравнению с Y-хромосомой (Moruzzi J.F., 1979). Так, у быков это различие составляет 3,8 %, у хряков — 3,6 %, у баранов — 4,2 %, у жеребцов — 3,7 % (Gamer D. е.а., 1983; Johnson L., Welch G., 1999). При разделении сперматозоидов было предложено использовать специальный краситель для ДНК и аналитическую проточно-цитометрическую систему, которую дополнили приспособлением для направленной ориентации клеток в потоке, что способствует более четкому выявлению различий в их светоизлучении (Pinkel D. е.а., 1982).
На основании результатов исследований, проведенных американскими учеными, была усовершенствована обычная аналитическая проточно-цитометрическая система и разработана Белтсвилская технология разделения спермы, которая состоит из нескольких операций (Johnson L.A. е.а., 1989, 1999). В состав разбавленной спермы добавляют флуоресцентный витальный краситель Hoechst 33342 и инкубируют ее при 35 С в течение 1 часа, для лучшего проникновения красителя через мембранные структуры половых клеток. Затем сперма под давлением поступает в высокоскоростной проточный цитометр, где создаются условия ориентации головки сперматозоидов при пересечении лазерного луча. Лазерное излучение инициирует флуоресценцию красителя, которая улавливается мощным световым детектором и анализируется компьютером. После идентификации сперматозоидов, содержащих X или Y-хромосому, специальный вибратор образует в растворе микрокапельки, куда попадают половые клетки. Каждая микрокапелька содержит один сперматозоид и заряжается положительно или отрицательно в зависимости от величины светоизлучения, обусловленной содержанием в половой клетке Х- или Y-хромосомы. Капельки с поврежденными или не идентифицированными сперматозоидами не заряжаются. В современных установках образуется 70-80 тыс. микрокапелек в секунду (Seidel G.E. е.а., 2007). После этого сперматозоиды проходят через электростатическое поле и разделяются на положительно, отрицательно или нейтрально заряженные частицы, которые поступают в разные емкости. Затем сперматозоиды центрифугируют для увеличения их концентрации и разбавляют специальной средой (Johnson L.A. е.а., 1987; Rens W. е.а., 1998; Seidel Jr. G.E., 2003).
В первое время после разработки описанной технологии, использовали стандартную скоростную систему с рабочим давлением в пределах 0,84 кг/см2. При этом скорость разделения клеток составляла 350 тыс. сперматозоидов в час (Johnson L.A. е.а., 1989). Позднее, когда технология была усовершенствована за счет повышения давления в системе до 4,22 кг/см , стало возможным сортировать до 11 млн сперматозоидов в час и получать образцы, содержащие 90 % клеток с Х- или Y-хромосомой (Johnson L.A., Welch G., 1999).
Были проведены углубленные исследования в области улучшения ориентации головки сперматозоидов относительно лазерного луча и оптического детектора (Welch G.R., Johnson L.A., 1999; Rens W. е.а., 1998; Johnson L.A. е.а., 1987). Вследствие плоской формы головки, только 30 % клеток имеют правильную пространственную ориентацию при прохождении через лазерный луч, причем только половина из них содержит Х- или Y-половую хромосому. Из общего объема эякулята удается получить не более 15 % сперматозоидов с определенной половой хромосомой, что обусловливает высокую стоимость разделенного по полу семени. В настоящее время разделенная сперма быков может быть экономически выгодной производителю при пониженном содержании сперматозоидов в дозе ( 2 млн клеток по сравнению с 10-15 млн сперматозоидов, применяемых при обычном осеменении крупного рогатого скота криоконсервированной спермой).
Во время разделения с помощью высокоскоростной проточной цитометрии сперматозоиды подвергаются действию таких неблагоприятных факторов, как: окрашивание, высокая степень разбавления семени, воздействие лазерного излучения и давления, электромагнитное влияние, центрифугирование (Cran D.G., 1999; Maxwell W.M., Johnson L., 1999). Поэтому важна разработка условий для сохранения биологической полноценности половых клеток. В частности, для предохранения их от агглютинации, в состав буферного раствора вводят 0,1 % бычьего сывороточного альбумина, а после разделения сперматозоиды попадают в
TEST-желточный буфер (Johnson L.A., 1991). Показано, что лучшая; подвижность сперматозоидов после оттаивания; сохраняется: в случае центрифугирования,половых клеток сразу после разделительного процесса, и добавления глицерина в состав охлажденного, до 4 G семени незадолго до замораживания (Sieg В; е.а., 2003).. Для проверки чистоты разделения. образцов? спермы на Х- и Y- фракции применяют полимеразную цепную реакцию (Welch G.R. е.а., 1997), а также метод флуоресцентной; гибридизации (Kawarasaki Т. е.а., 1998).
В 1988? году установили, что разделенные с: помощью проточной цитометрии сперматозоиды способны к, образованию пронуклеуса при введении в ооциты хомячков (Johnson:L.A., Clarke R.N., 1988). Втом-же году английскими исследователями , былш проведены первые опыты. по использованию разделенной спермы для? искусственного осеменения телок и крольчих (MorrelL J.M. е.а., 1988); Две группы телок осеменяли; с помощью цервикального введения фракции сперматозоидов с Х- или; Y-хромосомот В: дозе содержалось 5 млн клеток. Оплодотворяемость. животных оказалась очень низкой; и телки в основном абортировали между 4-м.и 5-м: месяцем; беременности. Изучение половых органов у абортированных плодов показало;, что в случае осеменения Х-фракцией; 8 из 11 плодов были самками, а при использовании Y-фракции, все 20" плодов, — самцами. Низкие результаты оплодотворяемости были получены .№.у крольчих, однако в этом случае удалось получить живых крольчат, которые нормально: развивались и в дальнейшем принесли: здоровое ПОТОМСТВО;
Выяснение защитного влияния различных эфиров глицерина при замораживании семени быков
Как известно, при замораживании семени быков в качестве основного криопротектора применяется глицерин. Однако, наряду с положительным защитным эффектом, глицерин может проявлять и отрицательное влияние на биологическую полноценность сперматозоидов при криоконсервации (Варнавский А.Н., 1970; Slavic Т., 1987). Поэтому необходим дальнейший поиск более эффективных криопротекторов по сравнению с глицерином. В литературе имеются данные о высоком криозащитном влиянии монометилового и моноэтилового эфиров глицерина при глубоком замораживании клеток костного мозга крыс и тромбоцитов человека (Паращук Ю.С. и др., 1989). В этой связи мы решили выяснить защитное влияние данных препаратов глицерина при замораживании спермы быков в усовершенствованной трис-фруктозо-лимоннокислой среде. В первом опыте изучали криозащитное влияние при замораживании спермы быков различных дозировок моноэтилового эфира. Данные этих исследований показаны в таблице 4. Результаты изучения криозащитного влияния моноэтилового эфира показали, что более высокая подвижность сперматозоидов сразу после оттаивания наблюдалась в группах с 1 и 2% данного препарата. Однако, подвижность сперматозоидов во всех группах, при использовании этого эфира, была достоверно ниже, чем в группах с глицерином. Более того, данный препарат во всех дозировках приводил к значительному снижению живучести оттаянных сперматозоидов, что свидетельствует о низкой криопротективной эффективности моноэтилового эфира глицерина на сперматозоиды быков.
В следующем эксперименте мы изучали криозащитное влияние другого эфира глицерина - монометилового эфира, в сравнении с различными дозировками глицерина. Полученные результаты этого опыта представлены в таблице 5. Как видно из данных таблицы 5, монометиловый эфир глицерина в концентрациях 1-2% оказал заметный защитный эффект на подвижность и абсолютный показатель живучести оттаянных сперматозоидов быков в сравнении с оптимальной концентрацией глицерина в среде (6%). При этом абсолютный показатель живучести оттаянных сперматозоидов в этих группах был выше, чем в группе с 6% глицерина на 25 и 21%, соответственно.
Кроме того, мы решили выяснить криозащитное влияние данного эфира в зависимости от срока экспозиции препарата со спермой перед ее замораживанием. При этом монометиловый эфир глицерина вводили в состав разбавленной и охлажденной спермы в оптимальной (1%) концентрации за определенные промежутки времени перед замораживанием. Результаты этого опыта представлены в таблице 6. Анализ данных таблицы свидетельствует о том, что время экспозиции изучаемого эфира глицерина со спермой быков перед замораживанием не оказало влияния на подвижность и живучесть оттаянных сперматозоидов. Для выяснения вопроса о влиянии монометилового эфира глицерина на биологическую полноценность криоконсервированной спермы быков нами были проведены опыты по искусственному осеменению коров спермой, замороженной в усовершенствованной трис-фруктозо-лимоннокислой среде с добавлением в нее 1% изучаемого препарата. Контрольную группу коров осеменяли спермой, замороженной в аналогичной среде, но содержащей в качестве криопротектора 6% глицерина. Результаты этих экспериментов суммированы в таблице 7. Результаты опытов свидетельствуют, что использование монометилового эфира глицерина в концентрации 1% позволило получить такую же стельность у коров, как и при использовании 6% глицерина. Это свидетельствует о высоких криозащитных свойствах изучаемого эфира глицерина. Возможно, использование более высоких дозировок данного препарата позволит получить лучшую оплодотворяемость животных по сравнению с использованием глицерина. Исследования в данном направлении необходимо продолжить в дальнейшем. Как известно, в практике искусственного осеменения в нашей стране до сих пор применяется для замораживания семени быков лактозо-глицерино-желточная среда, предложенная еще в 1964 году японскими исследователями (Nagase Н., Niwa N., 1964). Однако данная среда уже давно не используется для криоконсервации семени быков в других странах, т.к. появились более современные разбавители, позволяющие повысить биологическую полноценность и фертильность криоконсервированной спермы быков (Vishwanath R., Shannon P., 2000).
Ранее было показано, что применение усовершенствованной трис-фруктозо-лимоннокислой среды .с 20 % желтка для замораживания спермы быков, способствовало повышению оплодотворяемости коров по сравнению с использованием ЛГЖ-среды. В этой связи, в задачу наших исследований входило дальнейшее изучение эффективности использования усовершенствованной в отделе биологии воспроизведения животных ВНИИплем трис-фруктозо-лимоннокислой среды для замораживания семени быков, при её хранении в виде готового концентрированного (1:4) в сравнении с применением лактозо-глицерино-желточной среды. В первом эксперименте мы выясняли влияние замораживания спермы быков в усовершенствованной трис-фруктозо-лимоннокислой среде с 20% желтка и в лактозо (11,5%)-глицерино (5%)-желточной (20%) среде на подвижность и живучесть заморожено-оттаянных сперматозоидов, а также содержание в них АТФ (таблица 8). Из результатов таблицы 8 видно, что замораживание спермы быков в трис-фруктозо-лимоннокислой среде способствует улучшению подвижности оттаянных сперматозоидов и повышению уровня АТФ, по сравнению с использованием лактозо-глицерино-желточной среды.
Так, подвижность сперматозоидов замороженных в трис-фруктозо-лимоннокислой среде через 5; 60; 120 и 180 минут после оттаивания была выше, чем в лактозо-глицерино-желточной среде, соответственно, на 7,3%; 26,6%; 28% и 47%, а концентрация АТФ - на 7,5%; 21,3%; 18,9% и 31,2% (Р 0,05). Следовательно, трис-фруктозо-лимоннокислая среда обладает более высокими защитными свойствами при замораживании спермы быков по сравнению с лактозо-глицерино-желточной средой. Улучшение криозащитных свойств усовершенствованной среды может быть обусловлено содержанием в ее составе оптимального соотношения трис-(оксиметил)-аминометана и лимонной кислоты, обладающих буферными свойствами. Положительное действие буферных соединений при криоконсервации семени животных объясняется их способностью стабилизировать значение рН в сперме в процессе глубокого замораживания. Затем нами были проведены сравнительные эксперименты по искусственному осеменению коров спермой, замороженной в этих двух средах (таблица 9).
Выяснение результативности искусственного осеменения коров спермой, замороженной в усовершенствованной трис-фруктозо-лимоннокислой среде в сравнении с лактозо-глицерино-желточной средой
Известно, что для повышения биологической полноценности спермы разных видов животных, сохраняемой в охлажденном состоянии, в состав синтетических сред вводят бычий сывороточный альбумин (Kreider J.C., е.а., 1985; Upreti G. е.а., 1995; Ерохин А.С. и др., 2007).
Механизм защитного действия бычьего сывороточного альбумина окончательно не выяснен. Имеются сведения, что он способствует разупорядочиванию липидов в мембранах сперматозоидов и адсорбируясь на мембране, ингибирует процесс перекисного окисления липидов (Alvares J., Storey В., 1993). Кроме того, он замедляет акросомную реакцию (Thompson J.G., Cummins J.M., 1985).
В связи с тем, что мы не обнаружили в доступной нам литературе сведений о применении бычьего или человеческого сывороточногоальбумина для улучшения биологической полноценности сперматозоидов быков при глубоком замораживании, в задачу наших исследований входило выяснение защитной эффективности данных препаратов при криоконсервации семени этого вида животных.
В первом опыте мы анализировали защитный эффект при замораживании спермы быков различных дозировок бычьего сывороточного альбумина.
Данные этого эксперимента показаны в таблице 10. , Результаты таблицы 10 свидетельствуют, что все изученные дозировки бычьего сывороточного альбумина не оказали положительного защитного эффекта на биологические показатели криоконсервированной спермы быков.
Затем мы проанализировали криозащитное влияние на сперматозоиды быков человеческого сывороточного альбумина (таблица 11).
Как известно, в последние годы в практике скотоводства применяется разделенная по полу сперма быков-производителей. При этом возможно получать 85-92% потомков желаемого пола. Метод разделения спермы животных по полу с помощью высокоскоростной проточной цитометрии основан на различном содержании ДНК в сперматозоидах с Х- и Y- половой хромосомой. Во время цитометрического разделения сперматозоидов по полу они подвергаются воздействию ряда неблагоприятных факторов: окраска красителем, высокая степень разбавления семени, воздействие лазерного излучения и определенного давления, электромагнитное влияние, центрифугирование.
В этой связи мы решили изучить некоторые биологические показатели спермы быков, подвергнутой разделению по полу и дальнейшему глубокому замораживанию, полученной от фирмы «ABS Global»(CIIIA) и фирмы «Alta Genetic», (Канада).
В задачу наших исследований входило изучение следующих показателей: подвижность сперматозоидов сразу после оттаивания и через 3 часа инкубации при 30С; число половых клеток с интактной акросомой сразу после оттаивания и через три часа инкубации при той же температуре; концентрация сперматозоидов в дозе и микробная контаминация семени.
Результаты наших лабораторных исследований сексированной спермы фирмы «ABS Global», США представлены в таблице 12.
Как видно из таблицы 12, подвижность сексированных сперматозоидов сразу после оттаивания у всех быков достигала 40-45%, то есть находилась на том же уровне, что и у обычной не разделенной криоконсервированной спермы. Через 3 часа после инкубации половых клеток при 30С, их подвижность оставалась также на достаточно высоком уровне и составляла 30-35%.
Анализ сохранности акросом у сексированных сперматозоидов показал, что процесс разделения сперматозоидов не оказал значительного отрицательного влияния на этот показатель. Инкубация спермы в течение трех часов привела к незначительному снижению половых клеток с неповрежденной акросомой. Аналогичный процент снижения количества интактных акросом наблюдается и при изучении этого показателя у обычной криоконсервированной спермы быков.
Микробиологический анализ оттаянных образцов спермы подтвердил их стерильность в 8 сериях из 10. И только в одной серии (107330) у быка Рефлектора выявили наличие 230 не патогенных микробных тел в дозе, при норме не более 25 микробных тел. Данная серия была выбракована и утилизирована по микробиологическим показателям. К сексированной сперме быков предъявляются более строгие санитарные требования в связи с пониженной концентрацией половых клеток в дозе для осеменения, а также вследствие внутриматочного введения семени.
Изучение концентрации сперматозоидов показало, что во всех сериях содержалось более 2 млн. половых клеток, что соответствует нормативам, предъявляемым к сексированной криоконсервированной сперме быков. Согласно этим нормам, в дозе должно быть не меньше 2 млн. сперматозоидов.
Таким образом, проведенные нами исследования показали, что практически все серии исследованной сексированной спермы соответствовали предъявляемым к ней требованиям.
