Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Воздействие повреждающих факторов при криоконсервации семени сельскохозяйственных животных 8
1.2. Приемы повышения устойчивости спермы быков к замораживанию... 16
1.3. Основные синтетические среды для криоконсервации семени быков ... 26
1.4. Способы прогнозирования устойчивости спермы быков к глубокому замораживанию 32
2. Методика исследований 36
3. Результаты исследований 50
3.1 Изучение защитного влияния сухого соевого лецитина на устойчивость семени быков к глубокому замораживанию 50
3.1.1. Анализ криозащитного влияния на сперму быков различных видов сухого соевого лецитина 50
3.1.2. Влияние срока хранения спермы быков, замороженной с лецитином, на биологическую полноценность сперматозоидов
3.1.3. Результативность искусственного осеменения коров спермой, замороженной в усовершенствованной среде с сухим соевым лецитином... 59
3.1.4. Эффективность осеменения коров спермой, замороженной в усовершенствованной трис-фруктозо-лимоннокислой среде с желтком з
3.2. Изучение воздействия низкоинтенсивного лазерного излучения на криоустойчивость семени быков 64
3.2.1. Влияние лазерного излучения на устойчивость сперматозоидов быков к холодовому шоку 65
3.2.2. Влияние лазерного излучения на устойчивость сперматозоидов быков к глубокому замораживанию 69
3.3. Исследование возможности прогнозирования криоустойчивости спермы быков 72
3.3.1. Содержание уровня АТФ в сперме быков с различной фертильностью 72
3.3.2. Уровень пероксидации липидов в сперматозоидах быков с различной устойчивостью к замораживанию 76
3.3.3. Активность антиоксидантных ферментов в сперматозоидах быков с различной устойчивостью семени к замораживанию 78
3.3.4. Анализ фосфолипидного состава сперматозоидов с различной криоустойчивостью 80
4. Обсуждение результатов 82
5. Выводы 93
6. Практические предложения 95
7. Список литературы
- Основные синтетические среды для криоконсервации семени быков
- Способы прогнозирования устойчивости спермы быков к глубокому замораживанию
- Анализ криозащитного влияния на сперму быков различных видов сухого соевого лецитина
- Влияние лазерного излучения на устойчивость сперматозоидов быков к глубокому замораживанию
Введение к работе
Актуальность работы. В настоящее время для искусственного осеменения крупного рогатого скота во многих странах в основном применяется криоконсервированная сперма. Но несмотря на широкое применение, результативность осеменения коров всё ещё остается не достаточно высокой. При этом имеется целый ряд недостаточно изученных вопросов, которые смогли бы повысить эффективность осеменения коров и тёлок замороженной спермой. Например, в процессе замораживания спермы быков погибает более половины сперматозоидов. Изучение причин данного явления и разработка более совершенных синтетических разбавителей для спермы быков позволило бы повысить выживаемость сперматозоидов в процессе замораживания - оттаивания и их оплодотворяющую способность.
Слабо изучен также вопрос прогнозирования криоустойчивости спермы быков. Решение данной проблемы могло бы помочь в подборе производителей для племпредприятий с высокой устойчивостью спермы к замораживанию.
Как известно, имеются производители с высокой и пониженной устойчивостью половых клеток к процессу замораживания, что проявляется в различной подвижности и живучести сперматозоидов после процесса замораживания-оттаивания, а также в их оплодотворяющей способности.
В этой связи необходимы дальнейшие углубленные исследования в области совершенствования синтетических сред для замораживания спермы быков и изучения причин неодинаковой устойчивости половых клеток к криообработке.
Цель и задачи исследований. Целью данной работы является изучение эффективности осеменения коров спермой, замороженной в различных средах и выяснение возможности прогнозирования криоустойчивости сперматозоидов у быков.
Для достижения этой цели в диссертации бьши поставлены следующие задачи:
изучить криозащитное влияние на сперму быков различных видов сухого соевого лецитина;
выяснить влияние срока хранения спермы быков, замороженной в среде с соевым лецитином, на биологическую полноценность половых клеток;
изучить эффективность искусственного осеменения коров спермой, замороженной в усовершенствованной трис-фруктозо-лимоннокислой среде с сухим соевым лецитином и нативным желтком куриного яйца;
проанализировать воздействие низкоинтенсивного лазерного излучения на криоустойчивость сперматозоидов быков;
исследовать возможность прогнозирования криоустойчивости сперматозоидов быков с помощью различных биологических методов.
Научная новизна исследований. Впервые изучено криозащитное
влияние на сперму быков различных видов сухого соевого лецитина.
Выяснено влияние разных сроков хранения спермы быков, замороженной с
сухим соевым лецитином, на биологическую полноценность половых клеток.
Проведены научно-производственные испытания эффективности
искусственного осеменения коров спермой, замороженной в
усовершенствованной трис - фруктозо - глицериновой среде с соевым
лецитином и желтком куриного яйца. Проанализировано криопротективное
влияние на сперму быков низкоинтенсивного лазерного излучения. Изучена
взаимосвязь между уровнем АТФ в сперматозоидах быков и их
оплодотворяющей способностью. Исследована возможность
прогнозирования криоустойчивости сперматозоидов быков по содержанию в них продуктов перекисного окисления липидов и антиокислительных ферментов.
Практическая значимость. Усовершенствованная трис - фруктозо -лимоннокислая кислота способствует повышению фертильности спермы быков, замороженной как с сухим соевым лецитином, так и с нативным желтком куриного яйца в сравнении с использованием лактозо - желточно -глицериновой среды. Изучение уровня антиокислительных ферментов в сперме быков может быть полезно с целью прогнозирования её криоустойчивости.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:
Ученом Совете ВНИИплем, 2007 -2008 гг;
Научно- производственной конференции на ВВЦ, 2007 г;
Расширенной межотдельской конференции ВНИИплем, 2009 г.
Основные положения, выносимые на защиту:
- Сухой соевый лецитин обладает высокими криопротективными свойствами при замораживании семени быков.
Осеменение коров спермой, замороженной с сухим соевым лецитином, не снижает результативности искусственного осеменения.
Замораживание семени быков в усовершенствованной трис-фруктозо- лимоннокислой среде с желтком куриного яйца способствует повышению результативности искусственного осеменения коров по сравнению с ЛГЖ средой.
Изучение активности антиокислительных ферментов в сперме быков может быть полезным для отбора производителей с высокой устойчивостью семени к глубокому осеменению.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 1 в рецензируемом журнале.
Объем работы. Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методики исследований, результатов исследований, выводов и практических предложений. Диссертация включает 23 таблицы. Список литературы содержит 192 источника, в том числе 105 на иностранном языке.
Основные синтетические среды для криоконсервации семени быков
По мнению исследователей, наиболее устойчивыми структурами сперматозоидов животных при криовоздеиствии являются ядро и фибриллярный аппарат (Nath J., 1972; Jones R. е.a., 1979). Хотя позднее было установлено, что криогенным повреждениям могут подвергаться и эти структуры сперматозоидов (Royere D. е.а., 1988).
В результате нарушения проницаемости мембран сперматозоидов при криоконсервации происходит утечка внутриклеточных ферментов из сперматозоидов баранов и быков (Jones R., 1969). Более заметным изменениям при криообработке подвержены ферменты гиалуронидаза, акрозин, сукцинатдегидрогеназа, кислая и щелочная фосфатаза (Бугров А.Л., 1976; Курбатов А.Д. и др., 1988; Зверева Г.В. и др., 1989; Mann Т., 1964).
Утечка ферментов из сперматозоидов может приводить к снижению оплодотворяющей способности сперматозоидов (Антонюк B.C., 1980).
Показано снижение активности лактатдегидрогеназы, гексокиназы, глюкозофосфатизомеразы и альдолазы в сперме быков, баранов и хряков под влиянием глубокого замораживания ( Семаков В.Г., 1984; Курбатов А.Д., 1988).
При охлаждении и замораживании в сперме хряков и баранов наблюдается более заметная потеря активности кислых и щелочных фосфатаз по сравнению со сперматозоидами быков (Mahmoud M.F. е.а., 1986; Pangawkar G.R. е.а., 1988).
В последние годы установлено, что в процессе криоконсервации спермы быков, баранов и хряков происходит утечка из сперматозоидов интрацеллюлярных антиоксидантных ферментов - супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы (Ерохин А.С, 1994; Ерохин А.С. и др., 1995; Нарижный А.Г., Ерохин А.С., 1995). При этом снижается устойчивость сперматозоидов к окислительному стрессу.
Замораживание сперматозоидов быков вызывает нарушение синтеза циклических пуклеотидов и после оттаивания заметно снижается в клетках активность цАМФ и цГМФ (Семаков В.Г., 1984).
В результате криодеструктивных изменений в проницаемости плазматических мембран сперматозоидов, происходит перераспределение некоторых ионов между клетками и инкубационной средой (Robertson L., Watson P., 1986). При этом ионы калия и магния выходят из сперматозоидов, а ионы натрия и кальция диффундируют в клетки (Plammer J.M. е.а., 1985).
А в процессе замораживания - оттаивания в сперматозоидах быков, баранов и хряков резко снижается концентрация и синтез АТФ ( Платов Е.М., 1973; Ерохин А.С., Лехмус И.А., 1996; Ерохин А.С., Лехмус И.А., 1997; Soderquist L. е.а., 1991).
Как известно, уровень АТФ в криоконсервированных сперматозоидах быков положительно коррелирует с их подвижностью и фертильностью (Aalbers J.G. е.а., 1985).
В опытах на сперме быков и баранов было установлено, , что разрушение плазматических мембран половых клеток в процессе замораживания - оттаивания сопровождается изменением соотношения липидов и белков (Наук В.А., 1982). При этом в сперматозоидах быков белково - липидное соотношение снижалось, а у баранов - повышалось.
По мнению Наук В.А. и Гуськова A.M. (1983), прочность белково -липидного взаимодействия обусловливает устойчивость мембранных структур сперматозоидов к замораживанию.
Экспериментально установлено, что большую роль в криоустойчивости клеток к замораживанию играет уровень холестерина в мембранах, а также содержание насыщенных и ненасыщенных жирных кислот в фосфолипидах (Белоус А.Н., Бондаренко В.А., 1982).
Соотношение полиненасыщенных жирных кислот и холестерина в мембранах клеток определяет температуру фазовых переходов липидов (Пушкарь Н.С. и др., 1984). Холестерин, взаимодействуя с жирнокислотными цепями, влияет на текучесть мембран. При меньшем содержании холестерина в мембране, криоустойчивость клеток снижается. Проведенные эксперименты установили, что в сперматозоидах быков содержание холестерина выше, чем в сперматозоидах баранов: 345 мкг/109 сперматозоидов против 280 мкг/109 клеток (Маринов П.И. и др., 1983).
Доказано, что на устойчивость сперматозоидов разных видов животных к глубокому замораживанию определенное влияние оказывает уровень микровязкости плазматических мембран (Кононов В.П., 1984; Ерохин А.С. и др., 1989).
В последние годы установлено, что криоконсервация способствует активации в сперме животных процессов перекисного окисления липидов (Кононов В.П., 1982; Наук В.А., Гуськов A.M., 1983; Нарижный А.Г. и др., 1993; Ерохин А.С, 1994; Jones R., Mann Т., 1973; 1976). Процесс ПОЛ имеет свободнорадикальный характер и способствует снижению уровня фосфолипидов и ненасыщенных жирных кислот в мембранах сперматозоидов, нарушает проницаемость мембран и оказывает повреждающее влияние на ДНК клеток.
Способы прогнозирования устойчивости спермы быков к глубокому замораживанию
В задачу наших исследований входило проведение сравнительных исследований по искусственному осеменению коров спермой, замороженной в двух средах: усовершенствованной трис - фруктозо - лимоннокислой среде с добавлением 20 % желтка и в обычной лактозо - глицерино - желточной среде, содержащей 20% желтка. Эксперименты были проведены в хозяйствах Московской и Омской областей. Сперму быков голштинской и черно-пестрой пород разбавляли двумя сравниваемыми средами в такой пропорции, чтобы в дозе для осеменения содержалось 15 млн подвижных сперматозоидов.
В состав усовершенствованной трис — фруктозо - лимоннокислой среды входили следующие компоненты: вода дистиллированная - 100 мл; трис-(оксиметил) - аминометан - 2,75 г; фруктоза — 0,8 г; лимонная кислота -1,4 г; глицерин - 6 мл; желток куриного яйца - 20 мл; полиген - 30 мг.
В состав лактозо-глицерино-желточной среды входили: вода дистиллированная - 100 мл; лактоза - 11,5 г; желток куриного яйца- 20 мл; полиген - 30 мг. Разбавленные образцы семени эквилибрировали в холодильнике при- 4 Св течение 3-х часов. После эквилибриции замораживали сперму быков на фторопластовой пластине в виде гранул объемом 0,2 мл и переносили их в жидкий азот. Оттаивали гранулы семени в 3% растворе цитрата натрия. Осеменяли коров двукратно в течение половой охоты. Результативность осеменения учитывали по данным ректального исследования через 3 месяца после осеменения. Анализ влияния лазерного излучения на устойчивость сперматозоидов быков к холодовому шоку Целью данных экспериментов было изучение влияния оптических квантовых генераторов на устойчивость сперматозоидов быков к холодовому шоку.
Облучение спермы проводили на лазерной установке, собранной в МГТУ им. Н.Э. Баумана. Источниками излучения служили гелий - неоновый (Не - Ne, длина волны 0,63 мкм) и арсенид — галлиевый ( Ars — Ga, длина волны 0,89 мкм) лазеры. Эксперименты проводили в 4-х различных режимах. Для каждого режима соответствовали определенные значения мощности и частоты (таблица 1). Таблица 1 Экспериментальные режимы работы Ars - Ga и Не — Ne лазеров Режим работы R2 R4 R8 Rie F, частота, кГц 0,6 1,25 2,5 5 Средняя мощность, мВт Ars - Ga 2 2 2 He-Ne 0,15 0,3 0,6 1,2 Расстояние от световода до облучаемой поверхности семени составляло 7 см, что позволяло получить пятно излучения диаметром 25 мм.
Для изучения защитного влияния лазеров при холодовом шоке сперматозоидов, свежеполученную сперму быков разбавляли 3% раствором цитрата натрия в 10 раз. Затем наливали по 1 мл разбавленного семени и облучали их лазерами в течение 20-120 секунд. Облученную сперму инкубировали при 30 С в термобоксе в течение 15 минут, а затем помещали пробирки на 15 минут в тающий лед при 0 С. После этого анализировали подвижность сперматозоидов до и после холодового шока.
Изучение влияния лазерного излучения на устойчивость сперматозоидов быков к глубокому замораживанию
В этих экспериментах выясняли влияние облучения спермы быков перед замораживанием на подвижность и живучесть половых клеток после оттаивания.
Для этого смешанные эякуляты быков разбавляли 1 : 9 лактозо — глицерино - желточной средой и облучали изучаемыми лазерами перед эквилибрацией семени в течение определенных интервалов времени. Контрольная группа разбавленного семени не подвергалась лазерному облучению. Длительность времени экспозиции излучения опытных групп семени составляла 30, 60, 90, 120 и 300 секунд.
После облучения разбавленное семя помещали в холодильник для эквилибрации при 4 С в течение трех часов. Затем сперму замораживали в гранулах на фторопластовой пластине и хранили гранулы в жидком азоте. Оттаивание гранул семени проводили в 3% растворе цитрата натрия при 37С. Образцы оттаянного семени помещали в термобокс и инкубировали при 37 С до полной гибели. При этом через каждый час хранения оттаянной спермы, определяли подвижность сперматозоидов и затем вычисляли абсолютный показатель их выживаемости во всех группах по методу Милованова В.К. (1962).
Определение концентрации АТФ в сперме быков с различной оплодотворяющей способность Целью этой работы было изучение содержания АТФ в нативных и криоконсервированных половых клетках у быков и взаимосвязь данного показателя с оплодотворяющей способностью семени. Было подобрано три группы быков: с низкой, средней и высокой оплодотворяющей способностью семени. Сперму от данных производителей замораживали в лактозо - желточно - глицериновой среде до -196 С в виде гранул объемом 0,2 мл.
Оттаивали гранулы семени в элетрооттаивателе при 37 С, затем оттаянную сперму инкубировали при 37С в течение двух часов. Через определенные промежутки времени после оттаивания определяли подвижность сперматозоидов и содержание в них АТФ.
Содержание АТФ определяли биолюминисцентным методом. Так как в семенной плазме животных АТФ практически отсутствует, это позволило проводить анализ без отделения семенной плазмы от сперматозоидов. Экстрагирование АТФ из сперматозоидов осуществляли по методу Угаровой с сотр. (1991). Для этого из каждого образца семени отбирали пробу объемом 0,05 мл и добавляли к ней 0,45 мл диметилсульфоксида. После 20 минутной экстракции при комнатной температур, проводили анализ на содержание АТФ в образце с помощью портативного люминометра EMILITE 100 ЗА.
Выяснение уровня пероксидации липидов в сперматозоидах быков с различной устойчивостью к замораживанию
Для экспериментов на п л ем предприятии «Омское по племенной работе» было отобрано две группы быков черно - пестрой породы. Животные первой группы характеризовались более высокой подвижностью и живучестью сперматозоидов после оттаивания (средняя подвижность сразу после оттаивания составляла 49 %). У быков второй группы была более низкая подвижность и живучесть половых клеток после замораживания -оттаивания (средняя подвижность сразу после оттаивания составляла 38 %).
Анализ криозащитного влияния на сперму быков различных видов сухого соевого лецитина
В следующих экспериментах мы изучали влияние облучения семени быков перед замораживанием на устойчивость половых клеток к замораживанию.
Для этого смешанные эякуляты быков голштинской породы разбавляли 1:9 лактозо - глицерино - желточной средой и облучали изучаемыми лазерами перед эквилибрацией семени в течение определенного периода времени. Контрольную группу не подвергали облучению. После замораживания и оттаивания спермы, мы изучали подвижность сперматозоидов и абсолютный показатель их выживаемости при 37С.
Результаты влияния гелий - неонового лазерного излучения на подвижность сперматозоидов быков сразу после оттаивания представлены в таблице 14.
Из данных таблицы 14 видно, что облучение сперматозоидов быков перед замораживанием с помощью гелий - неонового лазера в течение 30-120 секунд не оказало положительного влияния на подвижность оттаянных сперматозоидов при всех режимах облучения. Более длительное облучение семени перед замораживанием (300 сек) оказало отрицательное влияние на подвижность оттаянных сперматозоидов, особенно при режиме облучения R32- При этом подвижность половых клеток в опытной группе снизилась на 19% по сравнению с контролем.
Результаты изучения подвижности оттаянных сперматозоидов после облучения семени арсенид - галлиевым лазером суммированы в таблице 15.
Как видно из результатов этого опыта, обработка семени с использованием арсенид—галлиевого излучения также не привела к повышению подвижности сперматозоидов быка после оттаивания. В случае применения режима R32 подвижность была ниже в группах, где время экспозиции составляло 120 и 300 секунд. В этих группах подвижность отгаянных сперматозоидов была ниже, чем в контроле, соответственно, на 7,2 % и 21,5 %. Следовательно, более высокая мощность излучения обоих видов лазеров способствовала снижению криоустойчивости половых клеток быков, возможно, путем отрицательного влияния на мембранные структуры сперматозоидов.
Изучение живучести оттаянных сперматозоидов быков после воздействия различных лазеров при температуре 37С показало, что облучение семени перед замораживанием Не - Ne лазером в течение 120 секунд при режимах Ri6 и R32 способствовало увеличению абсолютного показателя живучести сперматозоидов на 11,0 и 13,4%, соответственно, в сравнении с контролем (таблица 16).
Экспозиция семени перед замораживанием с использованием этого излучения в течение 300 секунд оказала отрицательное влияние на живучесть сперматозоидов при всех пяти режимах облучения. Анализ живучести оттаянного семени в группах, которые подвергались облучению с помощью Ars — Ga лазера (таблица 17) показал, что некоторое увеличение абсолютного показателя живучести отмечалось при всех режимах облучения при времени экспозиции 120 секунд. При использовании режимов R2, R4, Rs, Ri6 и R32 живучесть семени в опытных группах была выше, чем в контроле, соответственно, на 11,0 % ; 12,6% ; 11.4% ; 10,4% и 8,0 %. Облучение опытных образцов при этих же режимах в течение 300 секунд привело к снижению живучести сперматозоидов соответственно на 7,5 % ; 10,7 % ; 11,9 % ; 9,6 % и 11,8
Также не было отмечено заметного положительного влияние данной обработки на абсолютный показатель живучести сперматозоидов после оттаивания.
Полученные нами результаты отличаются от данных, полученных ранее при использовании семени баранов, где отмечался положительный эффект по подвижности и живучести оттаянных сперматозоидов баранов после их облучения арсенид-галлиевым лазером. Вероятно, данные различия можно объяснить межвидовыми особенностями структурно-функционального состояния плазматических мембран половых клеток у данных видов животных, что оказывает влияние на восприимчивость к воздействию лазерного излучения.
Широкое использование криоконсервированной спермы быков в практике искусственного осеменения КРС требует разработки более надежных методов оценки её биологической полноценности.
С целью совершенствования методов замораживания спермы быков необходимы более углубленные знания причин неодинаковой устойчивости семени различных производителей к глубокому замораживанию.
Как известно, имеются быки с высокой и пониженной устойчивостью половых клеток к процессу замораживания, что проявляется в различной подвижности и живучести сперматозоидов после процесса замораживания - оттаивания (Наук В.А., 1982; Ерохин А.С., 1994). По данным ряда исследователей, на подвижность
сперматозоидов быков оказывает влияние концентрация АТФ в сперме (Aalbers J.G. e.a., 1985). Однако, оплодотворяющая способность спермы при этом не анализировалась.
Поэтому мы решили изучить содержание АТФ в нативных и криоконсервированных сперматозоидах быков, и взаимосвязь данного показателя с оплодотворяющей способностью спермы. Для опытов было отобрано 3 группы быков: с низкой, средней и высокой оплодотворяющей способностью спермы.
Влияние лазерного излучения на устойчивость сперматозоидов быков к глубокому замораживанию
В этой связи мы уделили особое внимание исследованию некоторых биологических особенностей сперматозоидов у быков, характеризующихся высокой или низкой устойчивостью семени к замораживанию.
По данным ряда исследований, на подвижность и живучесть сперматозоидов животных большое влияние оказывает уровень содержания в них АТФ (Aalbers J.G. е.а., 1985; Wishart G., 1982; Comhair F. е.а., 1984).
В задачу наших исследований входило изучение содержание АТФ в сперматозоидах быков с высокой и низкой оплодотворяющей способностью.
Анализ полученных результатов показал, что у быков с высокой оплодотворяющей способностью спермы, концентрация АТФ в нативных сперматозоидах была выше на 5 и 11% по сравнению с быками с низкой и средней фертильностью.
При определении уровня АТФ в сперматозоидах через 5 и 60 минут после оттаивания, не было выявлено достоверных различий по этому показателю во всех группах. Через 2 часа после оттаивания концентрация АТФ в половых клетках с высокой фертильностью была на 9% выше, по сравнению с животными двух других групп. В этой же группе сохранялась и более высокая подвижность сперматозоидов.
Изучение коэффициента корреляции между содержанием АТФ в нативных сперматозоидах и оплодотворяющей способностью криоконсервированной спермы быков разных групп выявило незначительную положительную корреляцию между этими признаками. Коэффициент корреляции возрастал у быков всех групп по мере увеличения времени инкубации оттаянной спермы при 37С, но при статистически недостоверной разнице.
Результаты этих опытов свидетельствуют о том, что по содержанию АТФ в свежеполученных и криоконсервированных сперматозоидах нельзя надежно прогнозировать оплодотворяющую способность семени быков.
В литературе имеются данные, что при криоконсервации семени сельскохозяйственных животных могут активироваться процессы перекисного окисления липидов в мембранных структурах половых клеток (Кононов В.П., 1982; Наук В.А., Гуськов A.M., 1983; Ерохин А.С. и др., 1992; Jones R., Mann Т., 1976).
Данный процесс носит цепной свободнорадикальный характер и приводит к снижению содержания фосфолипидов и ненасыщенных жирных кислот в мембранах сперматозоидов, изменяет микровязкозть и проницаемость мембран, оказывает повреждающее действие на ДНК и т.д.
Поэтому одной из задач наших исследований было изучение уровня содержания продуктов перекисного окисления липидов в оттаянной сперме у быков с высокой и низкой устойчивостью к замораживанию.
Проведенные исследования показали, что через 5 минут после оттаивания концентрация липидных гидроперекисей в сперме быков с различной криоустойчивостью была практически одинаковой: 0,56 и 0,54 отн. ед/мл. Через 30 минут после инкубации спермы при 37С, концентрация липидных гидроперекисей увеличилась в группе с высокой криоустойчивостью половых клеток в 2,2 раза, а в группе с пониженной устойчивостью- в 2,3 раза (Р 0,05). Затем концентрация снижалась практически в одинаковой степени. Уровень содержания малонового диальдегида в оттаянных образцах семени был одинаков в изучаемые интервалы времени у быков обеих групп. Следовательно, различия в устойчивости сперматозоидов разных быков к глубокому замораживанию не связаны с уровнем перекисного окисления липидов в оттаянной сперме.
В связи с изучением причин неодинаковой устойчивости половых клеток различных быков к глубокому замораживанию, мы решили провести сравнительное изучение активности в сперме быков этих групп таких антиокислительных ферментов, как глутатионпероксидаза и глутатионредуктаза.
Известно , что от активности этих ферментов в значительной степени зависит устойчивость различных видов клеток к свободнорадикальному окислительному процессу (Афанасьев И.Б., 1988; Журавлев А.И., Пантюшенко В.Т., 1989; Владимиров Ю.А. и др., 1991).
Результаты наших опытов показали, что в группе быков с низкой криоустойчивостью спермы, подвижность половых клеток в процессе инкубации при 37С снижалась в гораздо более высокой степени, по сравнению с группой с высокой криоустойчивостью спермы. При этом подвижность оттаянных сперматозоидов в группе с пониженной криоустойчивостью была ниже через 5, 60, 120, 180, 240 и 300 минут после оттаивания, соответственно, на 34, 7 % ; 35.8 %; 50 %; 54.1 %; 62.9 % и 65.7 %, в сравнении со второй группой.
