Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1 Эволюционная теория и некоторые факторы породообразовательных процессов 10
1.2 Оценка количественных признаков свиней с использованием индексной селекции 25
1.3 Теоретическое обоснование промышленного скрещивания и гибридизации в свиноводстве 31
1.4 Влияние лучших мировых пород на свиноводство России 39
1.4.1 Порода йоркшир 39
1.4.2 Порода ландрас 44
1.4.3 Порода дюрок 46
1.5 Биологические особенности свиней
1.5.1 Адаптационная способность свиней к условиям содержания 48
1.5.2 Интеръерные особенности свиней 58
1.5.3 Методы ДНК-технологии в селекции свиней
1.5.3.1 Влияние гена эстрагенового (ESR) рецептора на воспроизводительную способность свиней 62
1.5.3.2 Влияние гена пролактинового (PRLR) рецептора на воспроизводительную способность свиней 68
1.5.3.3 RYR1 —ген и стрессчувствителъностъ свиней 73
2. Материал и методика исследований
2.1. Фенотипическая оценка воспроизводительной способности свиноматок 82
2.2. Фенотипическая оценка откормочных и мясных качеств свиней 82
2.3. Фенотипическая оценка адаптационной способности свиней 84
2.4. Методы количественной и качественной оценки свиней 85
2.4.1. Метод индексной селекции и разработка целевых стандартов отбора. 86
2.5. Методы ДНК-технологии в оценке генотипа свиней 86
2.5.1. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) 87
2.5.2. Метод полиморфизма длин рестрикции фрагментов 91
2.5.3. Метод горизонтального электрофореза 92
3. Результаты исследований и их обсуждение
3.1 Создание региональной системы чистопородного разведения и гибридизации в свиноводстве Владимирской области 94
3.1.1. Задачи селекционно-генетических центров в региональной системе чистопородного разведения и гибридизации 95
3.1.2. Методы внутрипопуляционной селекции при наличии 4-х неродственных ветвей, для формирования линий свиней методом разведения «в себе» 98
3.2. Технология кормления и содержания как способ реализации генетического потенциала свиней 102
3.3. Порода йоркшир
3.3.1. Ретроспектива создания популяции свиней линии Олимпа породы йоркшир 109
3.3.2. Генеалогическая характеристика популяции свиней линии Олимпа. 110
3.3.3. Планирование количественных показателей «материнской» линии Олимпа в III поколениях 111
3.3.3.1. Воспроизводительные показатели свиноматок исходного поколения, моделирование эффекта селекции и целевых стандартов отбора «материнской» линии Олимпа 112
3.3.3.2. Анализ воспроизводительных качеств свиноматок в линии Олимпа 114
3.3.3.3 Прогнозирование откормочных и мясных качеств хряков-производителей оцененных по продуктивности потомства 118
3.3.3.4. Оценка откормочных и мясных качеств хряков-производителей по потомству 120
3.3.3.5. Прогнозирование собственной продуктивности ремонтного молодняка линии Олимпа в III поколениях 122
3.3.3.5.1.Выращивание и оценка ремонтного молодняка по собственной продуктивности 125
3.3.4. Полиморфизм свиней линии Олимпа по генам ESR, PRLR, RYR1.
3.3.4.1. Генетическая структура по генам ESR, PRLR, RYR1 популяции свиноматок и хряков-производителей линии Олимпа 130
3.3.4.2. Влияние генов ESR, PRLR, на репродуктивные признаки свиноматок и воспроизводительную функцию хряков-производителей линии Олимпа 135
3.4. Порода ландрас
3.4.1. Ретроспектива создания популяции свиней линии Символа породы ландрас 140
3.4.2. Генеалогическая характеристика популяции свиней линии Символа 141
3.4.3. Планирование количественных показателей «материнской» специализированной линии Символа в III поколениях 142
3.4.3.1. Воспроизводительные показатели свиноматок исходного поколения, моделирование эффекта селекции и целевых стандартов отбора «материнской» линии Символа 143
3.4.3.2. Анализ воспроизводительных качеств свиноматок в линии Символа 145
3.4.3.3. Прогнозирование откормочных и мясных качеств хряков-производителей оцененных по продуктивности потомства 148
3.4.3.4. Оценка откормочных и мясных качеств хряков-производителей по потомству 150
3.4.3.5 .Прогнозирование собственной продуктивности ремонтного молодняка линии Символа в III поколениях 152
3.4.3.5.1. Выращивание и оценка ремонтного молодняка по собственной продуктивности 155
3.4.4. Полиморфизм свиней линии Символа по генам ESR, PRLR, RYR1.
3.4.4.1. Генетическая структура по генам ESR, PRLR, RYR1 популяции свиноматок и хряков-производителей линии Символа 159
3.4.4.2. Влияние генов ESR, PRLR, и RYR1 на репродуктивные признаки свиноматок и воспроизводительную функцию хряков-производителей линии Символа 164
3.5. Порода дюрок
3.5.1. Ретроспектива создания популяции свиней линии Дубка породы дюрок 169
3.5.2. Генеалогическая характеристика популяции свиней линии Дубка-породы дюрок 170
3.5.3. Планирование количественных показателей «отцовской» линии Дубка в III поколениях 171
3.5.3.1. Воспроизводительные показатели свиноматок исходного поколения, моделирование эффекта селекции и целевых стандартов отбора «отцовской» линии Дубка 172
3.5.3.2. Анализ воспроизводительных качеств свиноматок в линии Дубка 172
3.5.3.3 Прогнозирование откормочных и мясных качеств хряков-производителей оцененных по продуктивности потомства 175
3.5.3.4. Оценка откормочных и мясных качеств хряков-производителей по потомству 177
3.5.3.5. Прогнозирование собственной продуктивности ремонтного молодняка линии Дубка в III поколениях 179
3.5.3.5.1. Выращивание и оценка ремонтного молодняка по собственной продуктивности 179
3.5.4. Полиморфизм свиней линии Дубка по генам ESR, PRLR, RYR1.
3.5.4.1. Генетическая структура по генам ESR, PRLR, RYR1 популяции свиноматок и хряков-производителей линии Дубка 187
3.5.4.2. Влияние генов ESR, PRLR, и RYR1 на репродуктивные признаки свиноматок и воспроизводительную функцию хряков-производителей линии Дубка 191
3.6. Биологические особенности разводимых линий свиней.
3.6.1. Адаптационная способность свиней к условиям содержания 194
3.6.1.1. Динамика адатационных качеств свиноматок линии Олимпа по поколениям 196
3.6.1.2. Динамика адаптационных качеств свиноматок линии Символа по поколениям 198
3.6.1.3. Динамика адаптационных качеств свиноматок линии Дубка по поколениям 200
3.6.2. Биохимические показатели крови 201
3.7. Эффективность использования «материнских» и «отцовской» линий свиней в системе гибридизации 205
3.7.1. Оценка воспроизводительных качеств свиноматок «материнских» и «отцовской» линий при скрещивании 205
3.7.2. Оценка откормочных и мясных качеств двухлинейного и трехлинейного гибридного молодняка 207
3.7.3. Оценка эффекта гетерозиса при скрещивании «материнских» и «отцовских» линий свиней для получения двухлинейных и трехлинейных гибридов 209
4. Экономическая эффективность разведения свиней 212
Заключение 213
Выводы 227
Предложения производству 231
Список литературы 232
Приложения 269
- Адаптационная способность свиней к условиям содержания
- Метод полимеразной цепной реакции
- Генетическая структура по генам ESR, PRLR, RYR1 популяции свиноматок и хряков-производителей линии Символа
- Выращивание и оценка ремонтного молодняка по собственной продуктивности
Введение к работе
Актуальность темы. Как известно, современное производство свинины требует эффективных методов выращивания животных, сокращения расхода кормов, высокого выхода мяса и качества туши, устойчивости к заболеваниям и сохранности поросят, улучшения условий содержания и сокращения неблагоприятного влияния окружающей среды, а так же максимального использования полноценной энергии кормов.
Многолетняя племенная работа с животными в чистопородных стадах привела к значительному увеличению продуктивности. Однако темпы роста производства свинины, улучшение ее качества, уровень затрат кормов и средств на единицу продукции не отвечают современным требованиям. Так, по данным контрольного откорма свиней, за девять лет удалось увеличить среднесуточные приросты на откорме на 22-50 г, массу задней трети полутуши на 0,3-0,5 кг, «площадь мышечного глазка» на 1,2-2,2 см2, а толщину шпика снизить у животных белорусской мясной породы на 1 мм. (Епишко Т.И. 2006)
По данным Ю.В. Лебедева (1982), селекция в чистопородных стадах, при отборе не менее 50% оцененных животных и даже при существующей практике смены поколений через 2,5-3 года, т. е. в течение четырех поколений, позволит повысить за 10 лет среднесуточный прирост только на 28 г, снизить расход корма на 1 кг прироста на 0,16 к. ед. и толщину шпика – на 3 мм.
Очевидно, что ситуация в свиноводстве не позволяет ожидать результатов такой временной промежуток, поэтому в последние несколько лет в Россию осуществляется завоз импортных свиней для разведения, тем самым проводится интенсивное воздействие на отечественный генофонд.
Классической схемой гибридизации в мировом свиноводстве является терминальная схема, где в качестве «материнских» форм используются свиноматки йоркширской породы и ландрас, в качестве отцовской породы хряки – дюрок, гемпшир или пьетрен ( А.М. Хохлов, 2004; А.М. Хохлов, Д.И. Барановский и др, 2010; М.П. Ухтверов, А.М. Ухтверов, 2010; Даутов, С.Ф., Нефедьев А.Е, 2010; Казанцева Н.П. и др.2010; Тимошенко Т.Н., Шиман Т.Л, 2010;)
По определению гибрид – это продукт скрещивания специализированных пород и линий, отселекционированных на комбинационную способность с гарантированным проявлением эффекта гетерозиса. То, что в настоящее время называется гибридом, то это простейший вариант промышленного скрещивания, что еще не является залогом получения генетически регулируемого эффекта гетерозиса. Скрещивать необходимо не столько породы, сколько специализированные линии пород, сочетающиеся на эффект комбинационной способности.
Поэтому на наш взгляд является актуальным изучение эффективности использования пород свиней канадской селекции, в региональной системе гибридизации.
Цель и задачи исследований. Целью исследований являлось формирование и совершенствование «материнских» и «отцовской» линий свиней для использования их в системе гибридизации.
В соответствии с поставленной целью решали следующие задачи:
сформировать в регионе племенную базу в свиноводстве, на основе завезенных из Канады свиней пород йоркшир, ландрас и дюрок;
сформировать генеалогическую структуру «материнской» линии Олимпа в породе йоркшир, «материнской» линии Символа в породе ландрас, «отцовской» линии Дубка в породе дюрок, для разведения в себе по 4 м неродственным группам-ветвям;
оценить воспроизводительные качества свиноматок исходного поколения пород йоркшир, ландрас, отобранных для формирования «материнских» линий и разработать целевые стандарты отбора для последующих генераций;
оценить откормочные и мясные качества хрячков и свинок исходного поколения пород йоркшир, ландрас, дюрок и разработать целевые стандарты отбора для комплектования линий в последующих поколениях при их выращивании;
изучить воспроизводительные, откормочные и мясные качества потомства свиней в ряду 3-х поколений (F1, F2, F3) и оценить степень их соответствия целевым стандартам отбора;
изучить методом ДНК – тестирования генетическую структуру свиней «материнских» и «отцовской» линий, определить полиморфизм RYR1-гена, гена эстрагенового (ESR) и пролактинового рецепторов (PRLR);
установить влияние генов ESR, PRLR, RYR1 на репродуктивные признаки свиноматок и воспроизводительную функцию хряков-производителей;
определить желательные комплексные генотипы генов ESR/PRLR/RYR1 при дальнейшем использовании в селекционной работе;
изучить адаптационные качества свиноматок селекционируемых стад в динамике четырех поколений (P,F1,F2F3) по воспроизводительной способности;
изучить изменения биохимического состава сыворотки крови свиноматок в ряду четырех поколений (P,F1,F2F3).
оценить эффект гетерозиса двух- и трехлинейного гибридного молодняка полученного от скрещивания сформированных «материнских» и «отцовской» линий свиней второго поколения;
провести расчет экономической эффективности разведения свиней полученных генотипов;
Научная новизна. Проведены комплексные исследования эффективности использования пород свиней йоркшир, ландрас, дюрок Канадской селекции, а так же сформированы «материнские» и «отцовская» линии свиней, позволяющие прогнозировать продуктивность потомства путем моделирования эффективности племенного отбора на основе методов популяционной генетики и оценки прогноза эффекта гетерозиса.
Практическая значимость. В условиях Владимирской области сформирована трехступенчатая «Региональная система чистопородного разведения и гибридизации свиней», которая позволяет обеспечить товарное производство высокопродуктивным чистопородным и гибридным молодняком.
Основные положения, выносимые на защиту:
- обоснование разработки «Региональной системы чистопородного разведения и гибридизации свиней», формирование племенной базы чистопородного разведения и гибридизации в свиноводстве Владимирской области;
формирование генеалогической структуры линий свиней: «материнская» линия Олимпа породы йоркшир, «материнская» линия Символа породы ландрас, «отцовская» линия Дубка породы дюрок с использованием системы селекции;
оценка воспроизводительных, откормочных и мясных качеств исходных родительских форм и разработка целевых стандартов отбора при формировании последующих генераций;
анализ результатов выращивания, оценки и отбора ремонтных хрячков для комплектования линий в последующих поколениях;
оценка «материнских» линий пород йоркшир (Олимп) и ландрас (Символ), «отцовской» линии (Дубок) породы дюрок по воспроизводительным, откормочным и мясным качествам в четырех генерациях (Р, F1, F2, F3) и их соответствия теоретически разработанным целевым стандартам;
оценка эффекта гетерозиса гибридного молодняка полученного от скрещивания сформированных «материнских» и «отцовской» линий свиней второго поколения;
эффективность двух- и трехлинейного скрещивания «материнских» и «отцовской» линий свиней в системе гибридизации.
Апробация работы. Основные положения доложены и получили положительную оценку на научно-практических конференциях всех уровней, в частности на VI международной научно-практической конференции «Ресурсосберегающие экологически безопасные технологии получения сельскохозяйственной продукции» (г. Саранск, 2010г); на ежегодной региональной выставке «Владимирские зори» (г. Владимир, 2009, 2010г.); на Российской агропромышленной неделе «Золотая осень» (Москва, 2008, 2009, 2010), где автор в составе коллектива СГЦ «Мортадель» награжден золотой медалью «За достижение высоких показателей в развитии племенного и товарного животноводства (свиноводства)»; на Международном агропромышленном форуме «Развитие свиноводства в Украине» (г. Киев, 2010); на Всероссийском научно-практическом семинаре «Современные принципы разведения племенных свиней» (г. Москва, 2011); на Всероссийской научно-практической конференции «Научное обеспечение АПК Евро-Северо-Востока России» (г. Саранск, 2010г); на Всероссийской научно-практической конференции «Роль повышения квалификации кадров в инновационном развитии агропромышленного комплекса Мордовии» (г. Саранск, 2011г); на Всероссийской научно-практической конференции «Аграрная наука – сельскому хозяйству» (г. Чебоксары, 2011г).
Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликована 31 работа, в том числе 15 статей в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ, а так же 1 монография.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения общей характеристики работы, литературного обзора, основной части, заключения, выводов, предложений производству, списка литературы и приложений. Полный объем дисертации составляет 293 страницы компьютерного текста, в том числе 88 таблиц, 21 рисунок, 22 диаграммы и 20 приложений. Список использованых источников включает 349 наименований, в том числе 99 на иностранных языках.
Адаптационная способность свиней к условиям содержания
Анализом мирового опыта установлено, что закономерным процессом для всех цивилизованных стран является развитие свиноводства на индустриальной основе при разумной, в экологическом и энергетическом отношениях, концентрации производства (Рыбалко В.П., 2002). Максимальная экономическая эффективность достигается при производстве свинины в крупных специализированных предприятиях промышленного типа с применением всех возможностей механизации и автоматизации технологического процесса, организованного как непрерывный поток (Макарцев Н.Г., и др 1998.; Гегамян Н.С., и др., 2003). По оценке В.Базонова и И. Вазонова (2005), позволяет эффективно использовать генетический потенциал животных, производственных площадей, рабочей силы.
Однако в условиях промышленных комплексов животные, подвергаясь интенсивной эксплуатации, содержатся в условиях, неадекватных своим физиологическим потребностям. Специализация и концентрация производства, безвыгульное содержание в закрытых помещениях привели к тому, что многие звенья технологии выращивания и содержания животных пришли в противоречие с физиологическими особенностями, возникшими и закрепившимися в процессе эволюции (Хусаинова Н.В., 2004; Гриднев П., Гриднева Т., 2006; Подобед Л., 2007).
Увеличение продуктивности организма на фоне повышения его адаптационной способности- важнейшая теоретическая и практическая задача, решение которой будет в значительной степени содействовать развитию сельского хозяйства. Адаптационная способность и продуктивность коррелируют отрицательно тем больше, чем больше становится продуктивность организма. Повышение продуктивности организма, не сочетающееся с параллельным повышением его адаптационной способности, может подвергаться его все большему стрессу (Рубан Д.Ю., 1996).
На современном промышленном комплексе животное находится под воздействием во много раз больших стрессовых факторов, чем его предки. К числу таких отрицательных факторов относят - ограниченное движение, твердое покрытие полов в помещениях и на выгульных площадках, отсутствие солнечной инсоляции и натуральных зеленых кормов, укороченный период лактации, частые перегруппировки (Бекошвили Б.Г., 1989; Ядринский Ю.Д., 1987; Костенко С, 2006; Комлацкий В., Комлацкий Г., 2006). На этом фоне сказывается любое отклонение в кормлении, может снижаться потребность в одних элементах питания и повышаться в других (Федорчук Е., Походня Г., 2005).
В результате адаптационная система животных постоянно испытывает большую функциональную нагрузку, которая сказывается на деятельности всего организма (Куклева Н.Ю., 2001; Близнецов А., 2002; Кузнецов А., Горбунов Е., 2003; Danzer R., 1988). Для стрессовой реакции характерно развитие изменений в эндокринной и кровеносной системах. Отмечают многочисленные кровоизлияния и язвы желудочно-кишечного тракта. Животные теряют воспроизводительные способности, ослабляется иммунная система (Игнатова В., 2003; Михо Н., 2004; Аноприенко Л., 2004). По данным И.П. Шейко, А. Хоченкова и Д. Ходо-совского (2004), негативное влияние промышленной технологии проявляется на уровне клеточной и гуморальной реактивности свиней (лизоцимная и бактерицидная активность сыворотки крови, фагоцитарная активность лейкоцитов, титрнормальных агглютининов).
Первые дни после отъема - критический период в жизни поросят. Они подвергаются воздействию таких мощных стрессовых факторов, как лишение материнского молока, новое место обитания, иерархическая борьба в новой группе (Мушкетело И., Николаев В., Авсянникова И., 2002). Все это значительно повышает их чувствительность к инфекциям желудочно-кишечного тракта и другим заболеваниям ( Algers В., 1984; Jensen P., Recen В., 1989; Вое К., 1991; Шуляк Б., 2005). Как отмечают В.Степанов и А. Уткин (2003), молодняк наиболее болезненно реагирует на стрессы. По их данным, отход поросят из-за неблагоприятных условий содержания и кормления в свиноводческих хозяйствах доходит до 20%. G Hutschtnreuther, М. Zausch, W. Holzschuh (1961) сообщают, что из общего количества родившихся поросят только 70% достигают окончательной откормочной живой массы.
Неблагоприятные условия внешней среды, в условиях которых содержатся супоросные свиноматки на промышленном комплексе, негативно воздействуют не только на обменные процессы, в следствиеи чего у значительной части животных происходят аборты (Ануфриев А.И., Волков СВ., Ануфриев П.А., 2007). С. Околышев (2005) сообщает, что 40% зародышей погибает еще в первый месяц эмбрионального развития. Неблагоприятные условия содержания определяют так же нарушения в структурообразовании ряда органов и тканей эмбрионов у маток с сохранившейся супоросностью. Как отмечает В.Н. Ситько (1988), при патоло-гоанатомическом исследовании трупов новорожденных одно- и двухдневных поросят выявляют общие застойные явления, острый катаральный гастроэнтерит, серозный лимфаденит, дистрофия печени, почек, миокарда.
По сообщению Н. Sommer (1986), в Германии свиноматки, содержащиеся в условиях интенсивного производства, достигают лишь трети их возможного срока использования. L. Gallina (1963) отмечает, что 60% маток выбраковывают из-за бесплодия и только 15%- по старости. Однако ранняя выбраковка животных крайне не желательна, так как при продолжительном использовании животных сокращаются расходы на их выращивание, ускоряются темпы воспроизводства стада, увеличивается производство продукции и снижается ее себестоимость. По оценке Ю.Г. Исаева (2004), экономически выгоднее дольше содержать продуцирующее животное, чем производить затраты на выращивание ремонтного молодняка до перевода его в продуктивное стадо. Поэтому, к свиньям должны предъявляться повышенные требования, предусматривающие крепость конституции, высокой продуктивности, резистентности к стрессам и заболеваниям, хорошей адаптации к условиям обитания и хозяйственного использования (Jonson В., 1970; Wiliams W., 1959; Бабеев А.А., Казачок Г.Е., Ефимов В.И., 1992; Околышев С, 2006).
Не только условия содержания повлияли на повышение чувствительности свиней к стрессам. Селекция свиней на мясную продуктивность привела к снижению стрессоустойчивости потомства (Хернинг Б., Раскопф С, Зимантке К., 1997). По исследованиям СВ. Щербины (1988), свиньи мясного направления продуктивности характеризуются самой низкой резистентностью к стресс-факторам свиноводческого комплекса. При быстром росте мускулатуры отстает рост костей и внутренних органов. Этим вызваны такие повреждения конечностей, как артрозы, а так же широко распространенные нарушения сердечной деятельности и болезней кровеносной системы. У животных, полученных методом односторонней селекции, формируется иммунный ответ после вакцинаций к инфекционным заболеваниям, он менее напряженный и длительный (Шейко И.П., Хоченков А., Ходосовский Д., 2004).
По данным Н.В. Хусаинова (2004), в условиях промышленной технологии число поросят с высокой стрессовой чувствительностью достигает 40% от общего количества животных, выращиваемых на откорм. Н. Meier, Н. Brandt, Р. Glodek (1988) сообщают, что причиной выбраковки молодняка свиней в 50% случаев является низкая стрессустойчивость.
Повышенная чувствительность свиней мясного направления продуктивности к стрессам и снижение естественной резистентности получило название синдрома плохой адаптации, или стрессового синдрома свиней (PSS). Распространение синдрома PSS на промышленных фермах становится все более острой проблемой для свиноводов многих стран мира, так как сопровождается большими убытками от падежа свиней при транспортировке и проведении обычных зоотехнических мероприятий ( Gradin Т., 1982; Gradin Т., 1988; Stephens D.B., Репу GC., 1990; Mickwitz G, Heuking L., 1990; Troeger K.,Woltersdorf W.,1989).
Стрессустойчивость является важным биологическим признаком организма. Под стрессустойчивостью понимают способность животных адаптироваться к новым условиям без заметной потери продуктивности (Плященко СИ., Сидоров В.Т., 1987). Многие авторы (Willeke Н., Amler R., Fischer К., 1984; Никитченко Н.И., 1987) отмечают, что стрессустойчивые свиньи значительно уступают стрессустойчивым по естественной резистентности и воспроизводительной функции.
Метод полимеразной цепной реакции
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод амплификации ДНК in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определённую последовательность ДНК в миллиарды раз. Возможность получения огромного количества копий одного строго определённого участка генома значительно упрощает исследование имеющегося образца ДНК.
Для проведения реакции амплификации необходимо приготовить реакционную смесь и внести в нее анализируемый образец ДНК. В реакционной смеси должны присутствовать следующие компоненты:
- праймеры - пара искусственно синтезированных олигонуклеотидов, имеющих, как правило, размер от 15 до 30 п.н., идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени. Они играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы;
- Taq-полимераза - термостабильный фермент, обеспечивающий достраивание 3 -конца второй цепи ДНК согласно принципу комплементарности;
- смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP) - дезоксиаденозинтри-фосфат (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфат (дГТФ), дезоксицитозинтрифос-фат (дЦТФ) и дезокситимидинтрифосфат (дТТФ) - «строительный материал», используемый Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК;
- буфер - смесь катионов и анионов в определенной концентрации, обеспечивающих оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение рН;
- анализируемый образец - подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, который содержит (или может содержать) искомую ДНК, служащую мишенью для последующего многократного копирования. При отсутствии ДНК-мишени специфический продукт амплификации не образуется.
Процесс полимеразной цепной реакции включает в себя три температурных цикла, повторяющихся несколько раз:
1. Денатурация. На первом этапе необходимо денатурировать ДНК, находящуюся в образце. Для этого реакционную смесь нагревают до 92-95 С, в результате чего двухцепочечные молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул.
2. Отжиг. На втором этапе праймеры присоединяются к одноцепочечной ДНК-мишени. Этот процесс носит название «отжиг», которое происходит от английского металлургического термина «annealing», означающего отжиг - охлаждение сплавов в определенном режиме.
Праймеры выбирают так, что они ограничивают искомый фрагмент и комплементарны противоположным цепям ДНК.
Отжиг происходит в соответствии с правилом комплементарности Чар-гаффа, означающим, что в двухцепочечной молекуле ДНК напротив аденина всегда находится тимин, а напротив гуанина - цитозин. Если это условие не соблюдено, то отжига праймеров не происходит.
После отжига праймеров Taq-полимераза начинает достраивание второй цепи ДНК, начиная с 3 -конца праймера.
3. Элонгация (синтез). На третьем этапе температуру в реакционной смеси доводят до оптимума работы Taq-полимеразы, и синтез второй цепи продолжается с максимальной эффективностью.
В дальнейшем этапы денатурации, отжига и элонгации многократно повторяются (30 и более раз). На каждом цикле количество синтезированных копий фрагмента ДНК удваивается.
При амплификации фрагмента ESR-гена в качестве основы использовали методику Short с соавторами (1997). Для ПЦР синтезировали два олиго-нуклеотидных праймера следующего состава:
ESR : 5 - ССТ GTT ТТТ АСА GTG ACT ТТТ АСА GAG ; ESR : 57-САС ТТС GAG GGT CAG ТСС ААТ TAG-37.
При амплификацию фрагмента PRLR-гена в качестве основы использовали методику Linville R.C. (2001). Для ПЦР синтезировали два олигонуклео-тидных праймера следующего состава:
PRLR1: 5; - CGG CCG CAG ААТ ССТ GCT TGC - З7 PRLR2: 5; - АСС ССА ССТ TGT ААС ССА ТС А ТСС - Ъ1
Для проведения ПЦР фрагмента генов ESR и PRLR в объеме 25 мкл с 200 нг - 1 мкг геномной ДНК в каждом отдельном случае смешивали с 2,5 мкл Юхбуфера (670 мМ трис- НС1, рН=8,8 ; 160мМ бисульфата натрия, 0,1% Tween 20, 25 мМ хлористого магния), 2 мМ дезоксирибо-нуклеотидтрифосфатов (0,5 мМ каждого), 15 пМ праймеров, 2,5 ед. активности термостабильной Tag-полимеразы (Fermentas, Вильнюс). Объем доводили до 25 мкл дистиллированной водой. Препарат Taq-полимеразы находился в растворе, содержащем 10 мМ калийфосфатного буфера, рН= 7,5; 100 мМ КС1; 0,5% NP-40; 0,5% Tween 20; 0,5 мМ дитиотрейтола; 50% глицерина. Пробирки объемом 0,5 мл с 25 мкл. реакционной смеси помещали в термоцикл ер для проведения 30 циклов амплификации.
Для амплификации фрагмента гена ESR использовали режим: "горячий старт"- 94С - 5 мин; денатурация - 94С -1 мин, отжиг - 55С - 1 мин., элонгация - 72С- 1 мин.; достройка матрично-праймерных комплексов проходила при 72 С - 8 мин.
Для амплификации фрагмента гена PRLR использовали режим: "горячий старт"- 94С - 5 мин; денатурация - 94С -1 мин, отжиг - 55С - 1 мин., элонгация - 72С- 1 мин.; достройка матрично-праймерных комплексов проходила при 72 С - 5 мин.
При амплификациию фрагмента RYRl-гена в качестве основы использовали методику Брэма Г. и Бренинга Б. (1993). Для ПЦР синтезировали два олигонуклеотидных праймера следующего состава:
RYR56.1 : 5; - GTGCTGGATGTCCTGTGTTCCCT , RYR 56.2 : 5у - CTGGTGACATAGTTGATGAGGTTTG ,
Для проведения ПЦР в объеме 25 мкл 200 нг - 1 мкг геномной ДНК в каждом отдельном случае смешивали с 2,5 мкл Юхбуфера (670 мМ трис-НС1, рН=8,8 ; 160мМ бисульфата натрия либо 166 мМ сульфата аммония, 0,1% Tween 20, 25 мМ хлористого магния), 2 мМ дезоксирибо-нуклеотидтрифосфатов (0,5 мМ каждого), 15 пМ праймеров, 2,5 ед. активности термостабильной Tag ДНК-полимеразы (Fermentas, Вильнюс). Объем доводили до 25 мкл дистиллированной водой. Препарат Taq-полимеразы находился в растворе, содержащем 10 мМ калийфосфатного буфера, рН= 7,5; 100 мМ КС1; 0,5% NP-40; 0,5%) Tween 20; 0,5 мМ дитиотрейтола; 50% глицерина. Пробирки объемом 0,5 мл с 25 мкл. реакционной смеси помещали в термоцикл ер для проведения 30 циклов амплификации.
Для амплификации использовали режим: "горячий старт"- 94С - 6 ч мин; денатурация - 94С -1 мин, отжиг - 60С - 1 мин., элонгация - 72С- 1 мин.; достройка матрично-праймерных комплексов проходила при 72С - 5 мин.
Генетическая структура по генам ESR, PRLR, RYR1 популяции свиноматок и хряков-производителей линии Символа
Методом полимеразной цепной реакции амплифицирован фрагмент гена ESR длиной 120 пар нуклеотидов (п.н.). Полученные пробы разрезаны эн-донуклеазой Pvu II и разделены в агарозном геле. При помощи маркера определены длины фрагментов рестрикции: одна полоса 120 п.н. представляет гомозиготный генотип АА, три полосы в 120 п.н., 65 и 55 п.н. соответствуют гетерозиготному генотипу АВ (рис. 13).
Так же определены генотипы у животных специализированной материнской линии Символа, методом ПЦР амплифицирован фрагмент гена PRLR длиной 170 пар нуклеотидов. Полученные фрагменты разрезаны эндо-нуклеазой Alul и разделены в агарозном геле (рис.14).
Определены генотипы у свиноматок линии Символа ведущей производственной группы. Методом ПЦР амплифицирован фрагмент гена RYR1 длиной 134 п.н. Полученные амплификаты были разрезаны эндонуклеазои. При помощи маркера были определены длины фрагментов рестрикции: две полосы 84 и 50 п.н. представляют генотип RYR1 , три полосы в 134 п.н., 84 и 50 п.н. соответствуют гетерозиготному reHOTHnyRYRlNn (рис. 15). Ни одного животного с рецессивным гомозиготным генотипом nn не было обнаружено. Таким образом, в популяции свиноматок линии Символа первого поколения ведущей производственной группы, были выявлены животные с гетерозиготным генотипом RYRlNn.
В динамике двух поколений, определены генотипы у хряков-производителей основного стада линии Символа (рис. 16). Методом ПЦР ам-плифицирован фрагмент гена RYR1 длиной 134 п.н. Полученные амплификаты были разрезаны эндонуклеазои Ніпбі. При помощи маркера были определены длины фрагментов рестрикции: две полосы 84 и 50 п.н. представляют генотип NN. Ни одного животного с гетерозиготным генотипом RYRlNn и гомозиготным генотипом RYRlnn не было выявленно. Проведенные исследования хряков-производителей линии Символа свидетельствуют, что для данной популяции характерен гомозиготный стрессустоичивыи генотип RYR1.
Проведенные исследования генетической структуры свиноматок линии Символа первого поколения ведущей производственной группы по гену эст-рагенового рецептора (ESR) показали, что частота встречаемости генотипов составила: АА - 94%, АВ - 6%, генотип ВВ выявлен не был. Частота аллеля А - 0,97; В -0,03. Во втором поколении по данному гену частота встречаемости аллелей не изменилась и так же составила по аллелю А - 0,97, по аллелю В - 0,03. Так же во втором поколении не изменилась частота генеотипов: АА - 94%, АВ - 6%, генотип ESRBB так же не выявлен (диаграмма 9).
Генетическая структура популяции свиноматок линии Символа в первом поколений по гену пролактинового рецептора (PRLR) представленная в диаграмме 10 распределилась следующим образом: АА - 9%, АВ - 73%, ВВ -18%, с частотой встречаемости аллеля А- 0,45; аллеля В -0,55.
Во втором поколении произошло изменение генетической структуры популяции свиноматок ведущей производственной группы, так частота встречаемости генотипа АА увеличилось на 11%) и составила 20% , генотип АВ в структуре стал занимать 65%, ВВ генотип снизился с 18% до 14%, с частотой аллеля А-0,53; аллеля В- 0,47.
Проведенные исследования на наличие гена стрессчувствительности RYR1 у свиноматок ведущей производственной группы в динамике двух поколений (диаграмма 11) показали, что в популяции свиноматок первого поколения выявлено наличие гена стрессчувствительности.
Генетическая структура свиноматок первого поколения сложилась следующим образом: стрессустойчивый генотип RYRl1- 94% , гетерозиготный стрессчувствительный генотип RYRlNn - 6%, гомозиготного стрессчувстви-тельного генотипа RYRlnn выявлено не было. Частота встречаемости аллелей составила: N- 0,97: п- 0,03.
Во втором поколении, в результате селекционно-племенной работы, увеличилась гомозиготность свиноматок по гену RYR1, в связи с чем, изменилась частота генотипов и стала иметь стрессустойчивый генотип RYRl1-100%, с частотой встречаемости аллелей во втором поколении N-1.
Исследования генетической структуры стада хряков-производителей линии Символа по гену ESR показали, что в первом поколении частота встречаемости генотипа АА имела значение 61%, генотипа АВ - 39%. Животных носителей генотипа ВВ не было выявлено. Частота встречаемости аллелей в первом поколении распределилась следующим образом: аллель А-0,81; аллель В-0,19.
Исследования второго поколения, указывают на изменения генетической структуры популяции хряков-производителей, так частота встречаемости генотипа АА в сравнении с I поколением увеличилась на 1,5% и составила 62,5%, при том что частота генотипа АВ снизилась до 37,5%. Во втором поколении генотипа ВВ так же не было выявлено (диаграмма 12). Частота встречаемости аллелей во втором поколении так же не изменилась и составила: аллель А- 0,81; аллель В- 0,19.
Генетическая структура данной популяции хряков-производителей по гену PRLR в первом поколении распределилась следующим образом: гомозиготный генотип АА - 30%, гетерозиготный АВ - 53%, гомозиготный ВВ -17% (диаграмма 13). Частота встречаемости аллелей в первом поколении: аллель А-0,58; аллель В-0,42.
Во втором поколении произошли изменения частоты встречаемости генотипов, так встречаемость генотипа АА составила 44% , АВ- 37%, генотипа ВВ - 19%. Частота встречаемости аллелей во втором поколении составила: аллель А -0,62; аллель В- 0,38.
В результате исследований генетической структуры хряков-производителей линии Олимпа по гену стрессчувствительности RYR1, в двух смежных поколениях установлено (диаграмма 14), что популяция хряков-производителей является мономорфной по аллелям RYR1N.
Выращивание и оценка ремонтного молодняка по собственной продуктивности
Одним из важнейших факторов, в деле совершенствования продуктивных качеств свиней, является выращивание и оценка ремонтного молодняка по собственной продуктивности. По собственной продуктивности ремонтных хрячков коэффициенты наследуемости составляли: по скороспелости - 0,360; затратам корма на 1 кг прироста - 0,205, толщине шпика над 6-7 грудными позвонками - 0,324. (диаграмма 16).
В таблице 60 представлены средние значения по оцененным животным и ведущей группе, селекционный дифференциал, эффект селекции за поколение и целевой стандарт при отборе ремонтных хрячков для комплектования основного стада.
Средние значения по стаду составляли по скороспелости - 160 дн.; затратам корма на 1 кг прироста - 2,67 кг; толщине шпика над 6-7 грудными позвонками - 13,1 мм.
Ремонтные хрячки отнесенные к ведущей группе имели средние зна чения по скороспелости - 149 дней; затратам корма на 1 кг прироста - 2,42 кг; толщине шпика над 6-7 грудными позвонками - 12,6 мм.
Селекционный дифференциал: по скороспелости —11 дн.; затратам корма на 1 кг прироста - -0,25 кг; толщине шпика над 6-7 грудными позвонками - -0,5 мм.
Селекционно-генетический прогресс за поколение по скороспелости составит - -4,0 дн.; затратам корма на 1 кг прироста - -0,05 кг; толщине шпика над 6-7 грудными позвонками - -0,16 мм.
Целевой стандарт отбора: по скороспелости - 156 дн.; затратам корма на 1 кг прироста - 2,62 кг; толщине шпика над 6-7 грудными позвонками -12,94 мм.
На основании средних показателей и эффекта селекции составлен прогноз показателей оценки собственной продуктивности ремонтных хрячков в последующих генерациях (табл. 61).
Таким образом, генетически обусловленные показатели собственной продуктивности ремонтных хрячков должны составлять по поколениям (I, II, III) по скороспелости: 156, 152, 148 дн.; затратам корма на 1 кг прироста 2,62; 2,57; 2,52 кг; толщине шпика над 6-7 грудными позвонками 12,94; 12,78; 12,62 мм соответственно.
В таблице 62 представлены средние значения по оцененным животным и ведущей группе, селекционный дифференциал, коэффициент наследуемости, эффект селекции за поколение, целевой стандарт при отборе ремонтных свинок для комплектования стада линии Дубка.
В исходном поколении было оценено 114 ремонтных свинок, из которых 22 гол., отнесены в ведущую группу, что позволило спрогнозировать продуктивность на последующие генерации.
Средние значения по оцененной группе составляли по скороспелости 165 дн., затратам корма на 1 кг прироста - 2,74 кг; толщине шпика над 6-7 грудными позвонками - 16,8 мм.
Среднее значение по скороспелости свинок, отнесенных в группу ве дущих составило 159 дн., затратам корма на единицу продукции - 2,66 кг при толщине шпика над 6-7 грудными позвонками — 13,3 мм.
Селекционный дифференциал: по скороспелости - -6 дн.; затратам корма на 1 кг прироста —0,08 кг; толщине шпика над 6-7 грудными позвонками - -2,5 мм.
Эффект селекции за поколение по скороспелости составит —2 дн.; затратам корма на 1 кг прироста —0,02 кг; толщине шпика над 6-7 грудными позвонками - -0,8 мм.
На основании средних показателей и эффекта селекции составлен прогноз отбора ремонтных свинок оцененных по собственной продуктивности для комплектования последующих поколений (табл. 63).
Таким образом, планируемые показатели собственной продуктивности ремонтных свинок будут составлять в последующих поколениях (I, II, III) по скороспелости - 163; 161; 159 дн.; затратам корма на 1 кг прироста - 2,72; 2,70; 2,68 кг, толщине шпика над 6-7 грудными позвонками: 16,0; 15,2; 14,4 мм соответственно.
