Содержание к диссертации
Введение
1.Обзор литературы 7
1.1. Генетическая характеристика микросателлитных локусов генома 7
1.2. Методы исследования микросателлитов 11
1.3. Использование полиморфизма микросателлитных локусов генома для оценки генетической гетерогенности крупного рогатого скота 17
1.4. Использование микросателлитных локусов для оценки продуктивных признаков крупного рогатого скота 22
2.Материалы и методы исследований 31
3.Результаты исследования 38
3.1. Оптимизация ДНК-технологии оценки полиморфизма микросателлитных локусов ДНК крупного рогатого скота 38
3.2. Полиморфизм микросателлитных локусов генома крупного рогатого скота 56
3.2.1. Полиморфизм микросателлитного локуса RM388 57
3.2.2. Полиморфизм микросателлитного локуса ЕТНІ0 61
3.2.3. Полиморфизм микросателлитного локуса ЕТН225 65
3.2.4. Полиморфизм микросателлитного локуса DIK083 70
3.3. Оценка возможности использования полиморфизма микросателлитных локусов RM388, ЕТН10, ЕТН225, DIK083 для оценки генетической дифференциации красно - пестрой породы скота. 73
Выводы 84
Предложения производству 85
Список использованной литературы 86
- Использование полиморфизма микросателлитных локусов генома для оценки генетической гетерогенности крупного рогатого скота
- Использование микросателлитных локусов для оценки продуктивных признаков крупного рогатого скота
- Оптимизация ДНК-технологии оценки полиморфизма микросателлитных локусов ДНК крупного рогатого скота
- Полиморфизм микросателлитного локуса DIK083
Введение к работе
Актуальность работы. Для совершенствования селекционно-племенной работы требуются новые критерии отбора, помогающие выявить животных с высокими племенными характеристиками. Достижения молекулярной биологии дают возможность оценки животных не только по фенотипическим признакам, но и непосредственно по генотипу, что обеспечит селекционерам возможность точной и быстрой идентификации животных с высоким генетическим потенциалом по определенным признакам продуктивности.
Генетическая оценка животных стала значительно более эффективной в результате открытия семейств повторяющихся последовательностей, дислоцированных по всему геному (минисателлитов и микросателлитов). Микросателлитные последовательности ДНК в последнее время играют доминирующую роль в качестве неисчерпаемого источника генетических маркеров. В настоящее время выделено и описано более 2000 микросателлитов в геноме крупного рогатого скота (база данных INRA, Франция) и их количество увеличивается с каждым днем.
Микросателлиты имеют ряд преимуществ перед другими маркирующими системами: они множественны, высокополиморфны, широко распространены по всем хромосомам, легко выявляются и идентифицируются.
С открытием микросателлитов появилась возможность точно определить достоверность происхождения животных, а так же осуществить маркировку некоторых генетических локусов, связанных с продуктивностью (George М. et al., 1993; Ron М. et al.,1994; Charlier С. et al., 1995; Georges M. et al, 1995; Ohba Y. et al.,1999; Velmala R.J. et al., 1999; Ashweii M.S. et al., 1999; Heyen D. W. et al., 1997; Kato Y. et al., 1998; Peelman L., Mortiaux F., et al., 1998; Velmala R., Vilkki J. et al., 1995).
В 1996 году Международным обществом генетиков (ISAG) было рекомендовано использование молекулярных генетических тестов, основанных на полиморфизме микросателлитных локусов ДНК, для определения достоверности происхождения крупного рогатого скота.
В настоящее время идентифицированные микросателлиты составляют значительную группу генетических маркеров удобных для целого ряда исследований, таких как характеристика генетической структуры популяций и степени инбредности, оценка генетических расстояний между семействами, линиями, породами и видами животных, филогенетических исследований (Machugh D.E. et al., 1998; Peelman L.J. et al., 1998; Slate J. et al., 1998).
Применение микросателлитных маркеров даёт возможность определять корреляцию между хозяйственно-полезными признаками и определяющими их генетическими структурами, проводить селекционную работу с линиями, популяциями, породами и стадами, а так же вести отбор животных с желательными генотипом в любом возрасте (Lipkin Е. et al., 1998; Spelman R.J.-, Bovenhuis H., 1998).
Следует отметить, что породы и популяции крупного рогатого скота различаются по количеству аллельных вариантов и уровню гетерозиготно-сти изученных микросателлитных локусов. Данные по генетической гетерогенности крупного рогатого скота отечественной селекции практически отсутствуют. Имеются лишь результаты исследований нескольких микросателлитных локусов у коров черно-пестрой породы (Симоненко В.П., 1999; Шмидт Т.Ю., 2001).
Цель нашей работы - оценка полиморфизма микросателлитных локусов генома красно-пестрой породы крупного рогатого скота.
Были поставлены следующие задачи:
1. Отобрать потенциально информативные микросателлитные локусы для красно-пестрой породы крупного рогатого скота.
Разработать метод ГЩР - анализа генома, пригодный для выявления полиморфных вариантов микросателлитных последовательностей ДНК.
Определить частоту встречаемости аллельных вариантов и генотипов микросателлитных локусов ДНК крупного рогатого скота.
Определить уровень гетерозиготности и информативной ценности выбранных микросателлитных локусов ДНК.
Оценить возможность использования микросателлитных последователей ДНК для оценки генетического разнообразия животных красно-пестрой породы.
Научная новизна работы. Впервые проведено генотипирование крупного рогатого скота отечественной селекции с использованием ряда микросателлитных маркеров, определен уровень гетерозиготности микросателлитных последовательностей ДНК и изучена частота встречаемости аллельных вариантов и генотипов в популяциях животных красно-пестрой и черно-пестрой породы. Выявлен высокий уровень полиморфизма микросателлитных локусов RM388, DIK083, ЕТНІ0 и ЕТН225. Установлено наличие 41 аллельного варианта микросателлитных локусов у крупного рогатого скота красно-пестрой породы (в среднем 10,2 аллеля на локус). Фактическая гетерозиготность изученных локусов составила от 0,53 до 1,0.
Практическая значимость работы. Предложен вариант ГЩР - диагностики, пригодный для анализа полиморфизма микросателлитных последовательностей ДНК крупного рогатого скота без использования дорогостоящих секвенаторов и радиоактивного мечения. Высокий уровень гетерозиготности и значений показателя информативной ценности микросателлитных локусов RM388, DIK083, ЕТН10 и ЕТН225, который составил от 0,87 до 0,99, позволяет рекомендовать их использование для оценки генетического разнообразия животных красно-пестрой и черно-пестрой породы, для определения достоверности происхождения и поиска взаимосвязей с хозяйственно-полезными признаками.
На защиту выносятся следующие положения:
Оптимизация ДНК-технологии оценки полиморфизма микросателлитных локусов генома крупного рогатого скота.
Выявление полиморфизма микросателлитных локусов ДНК крупного рогатого скота.
Определение частоты встречаемости аллелей и генотипов, уровня гетерозиготности и информативной ценности микросателлитных локусов ДНК.
Оценка возможности использования микросателлитных локусов ДНК для выявления меж- и внутрипородной генетической дифференциации крупного рогатого скота красно-пестрой породы.
Апробация работы. Результаты исследований обсуждены на заседаниях Ученых Советов ВНИИплем (2002-2003 гг.), на Международной научной конференции «Генетика и селекция в XXI веке» (Минск, 2002 г.), на научно-производственной конференции "Современные ресурсосберегающие технологии производства продукции животноводства" (Вологда, 2004 г.).
Публикация результатов исследований. По результатам исследований опубликованы 4 научные работы.
Использование полиморфизма микросателлитных локусов генома для оценки генетической гетерогенности крупного рогатого скота
С появлением иммунологических и биохимических маркеров был сделан настоящий прорыв в исследованиях популяционной генетики. В свое время широкое практическое применение в племенной работе получили иммунологические методы для контроля происхождения, исследования племенных ресурсов и генетических процессов в популяциях, оценки племенных особенностей животных. Многие вопросы могут быть разрешены посредством тестирования по группам крови, белкам плазмы, ферментам эритроцитов, BOLA.
Один из подходов к селекции по генотипу, основан на селекции по маркерам. Такое генотипирование может быть легко проведено путем взятия образцов крови от новорожденного животного. Общей оценкой состояния популяции животных является внутрипородное генетическое разнообразие. Изменение генетических различий между породами первоначально проводили с использованием тестов по группам крови. Этот метод внес определенную ценность в изучении структуры популяций сельскохозяйственных животных за последние 20 лет.
Однако маркеры, полученные на основе белкового полиморфизма, не лишены недостатков. Анализ белков позволяет тестировать изменения только в белок-кодирующих последовательностях ДНК, и только у экс-прессирующихся генов. Если учесть, что в геноме животных значительную часть составляют повторяющиеся последовательности, то становится очевидным, что при анализе белкового полиморфизма от исследования ускользает 90 % генома (Сулимова Г.Е., 1995).
Оценки полиморфизма ДНК, проведенные на основании отличий последовательностей ДНК разных индивидуумов, показали, что каждые два неродственных индивидуума отличается не менее чем тремя миллионами пар оснований. Различия между двумя генами не сосредоточены в какой либо из его специфических областей, а разбросаны по всему геному и, в основном, они концентрируются в некодирующих областях генов (Taylar J.F. et al, 1997). Характерной особенностью генома животных является то, что кодирующие последовательности гена составляют лишь малую долю наследственного материала (5-10 %).
Полиморфизм динуклеотидных и тетрануклеотидных повторов ДНК может быть проанализирован в единичных клетках, например, отдельных спермиях (Hubert R. et al., 1992). ДНК тест может быть выполнен с использованием очень маленьких образцов (крови, молока, волос), собранных в любое время. Чтобы получить достаточное для анализа количество амплификата при этом используют прием «расширенной преамплификации» генома (Zhang L. et al., 1992) и проводят полимеразную цепную реакцию в два этапа. Генотипирование единичных сперматозоидов с помощью ПЦР (Saiki R.K. et al., 1985, 1988; Mullis K.B., Faloona F.A., 1987) позволяет измерять частоту генетических рекомбинаций между полиморфными вариантами последовательностей ДНК (Li Н. et al, 1988; Arnheim N. et al., 1990). Значение частоты генетических рекомбинаций, вычисленное таким образом, совпадает с данными, полученными при семейном анализе (Cui X. et al., 1989). Типирование единичных сперматозоидов по микросател-литным локусам генома также оказывается полезным при оценке ожидаемого уровня полиморфизма родственных групп животных, когда для анализа доступно малое количество особей (Goradia Т.М. et al., 1991).
Glowatzki-Mullis M.L. с соавторами (1995) сообщают о новом подходе к контролю происхождения у крупного рогатого скота. Корректирование родства среди племенных пород является необходимым для действенной селекционной программы (Moazami-Goudarzi К. et al., 1997).
Микросателлитные локусы имеют перспективу замены условного типирования по группам крови. Они высоко информативны и просты для использования и стандартизации. Мультиплексные ПЦР и автоматическое определение полиморфизма с использованием лазерной флуоресценции -это новый путь выявления родства. Эффективность микросателлитных ло-кусов очень высока и представляет значительный интерес для контроля происхождения. Полученные результаты могут быть стимулом к изучению других гипервариабельных локусов и поиска новых вариантов для их применения.
Для контроля происхождения крупного рогатого скота фирма Applied Biosystems предлагает набор StockMarks Kit, содержащий 11 микросателлитных локусов, которые равномерно распределены по геному, высоко полиморфны и могут быть идентифицированы по образцам ДНК с использованием PCR (Bates S. et al, 1996; Peterson-Knabe С. et al., 1996). Эта технология имеет преимущество перед традиционными тестами антигенов крови, RFLP анализами и другими методами. Микросателлитный локус выбирается из-за высокой гетерозиготности и возможности повторяться. Точность микросателлитных анализов при определении родства путем исследования 11 микросателлитных локусов составляет более 99,999 %. Основанный на ПЦР, метод более гибок благодаря тому, что используемые в нем мультиплексные реакции могут быть проведены на различных образцах, легко стандартизируются и автоматизируются. StockMarks Kit - это набор для идентификации родителей для точного наследственного анализа. Предназначен для работы с ПЦР системой и системой генотипирования, которая обеспечивает подготовку образца, точность и электронный сбор данных для высокообъемных исследований.
В тоже время опыт микросателлитного тестирования крупного рогатого скота и других видов животных показывает, что коммерческий вариант, предлагаемый фирмой Applied Biosystems (набор реактивов Stock-Marks Kit и соответствующий комплект оборудования), не является оптимальным по разрешающей способности и стоимости анализа (Kanmaki М. etal., 1996).
Bates S. et al. (1996), Mommens G. et al. (1998) сообщают о 22 микросателлитных маркеров, с помощью которых проводилось тестирование 5 пород скота. Так, достоверность происхождения у потомков составила более 99,99 %, если генотипированы оба родителя и более 99,86 %, если один предок неизвестен.
Ritz L. R. с соавторами (2000) предлагают для генетического тестирования и контроля происхождения в семействе Bovinae помимо 11 микросателлитных маркеров, входящих в StockMarks Kit, использовать еще 9 высокополиморфных маркеров. Это позволяет наиболее полно с генетической точки зрения охарактеризовать данное семейство.
Использование микросателлитных локусов для оценки продуктивных признаков крупного рогатого скота
В последние годы изучение генетического полиморфизма стало одним из наиболее важных и плодотворных направлений, как фундаментальной генетики, так и прикладных исследований. Ряд разработок в этой области успешно используют для повышения эффективности селекции сельскохозяйственных животных.
Основной задачей генетики крупного рогатого скота является выявление локусов, определяющих формирование хозяйственно-полезных признаков (Witte J.S. et al, 1996). Для её успешного решения необходимым условием является наличие легко детектируемых высокополиморфных маркеров с кодоминантным типом наследования.
Прогресс в разведении сельскохозяйственных животных может быть достигнут в результате комплексного использования методов традиционной и маркерной селекции (Weller J.I. et al., 1990). Основой последней является молекулярно-генетическая информация о локусах количественных признаков (QTL). Информация о QTL чаще всего бывает непрямой, когда полиморфный маркер только генетически сцеплен с интересующим локу-сом, и реже прямой, основанной на полиморфизме непосредственно QTL, что предпочтительнее для маркерной селекции в связи с меньшим влиянием рекомбинации (Балацкий В.Н., 1998).
Анализ тенденций развития селекции в мире позволяет сделать вывод, что наиболее ощутимый вклад в селекцию в ближайшем будущем внесет широкое применение молекулярно-генетических маркеров, то есть использование ДНК-маркеров в качестве сигнальных признаков (Глазко В.И., Созинов И.А., 1993; Глазко В.И. и др., 1999).
В последнее десятилетие в области фундаментальной и прикладной генетики животных и растений выделилось новое направление, которое получило название селекция с помощью маркеров- MAS (marker assisted selection) (Тихонов B.H., 2002). Несмотря на то, что количественные признаки контролируются множеством генов, продуктивные качества во многом определяются мажорными генами. Картирование таких генов позволит проводить генотипирование родоначальников в рамках маркер направленной селекции - (MAS) для осуществления контроля передачи определенного генетического материала в поколениях (Soller М. & Beckmann J.S., 1982).
Основные принципы маркер зависимой селекции - метод сигналей впервые были сформулированы и детально разработаны А.С. Серебров-ским и его школой в 20-40-х годах. Теоретической предпосылкой для разработки А.С. Серебровским метода «сигналей» явилась хромосомная теория наследственности. С начала 90-х годов исследования в области молекулярной генетики были ориентированы на детальное изучение геномов животных. В рамках этих работ и возник ряд проектов по картированию хромосом быка, свиньи, овцы (Кленовицкий П., Марзанов Н., 1999).
Известно, что множество фенотипических признаков, в частности количественные признаки сельскохозяйственных животных, являются полигенными, и то, что одни и те же фенотипические проявления могут быть следствием мутаций разных генов. Поэтому для определения генетической структуры, определяющей тот или иной фенотипический признак, необходимо установить связь между признаком и локусом генома, который легко детектируется посредствам какого-либо маркера (Soller М., 1994).
Новый класс генетических маркеров появился в середине 80-х годов после открытия полиморфизма ДНК благодаря развитию методов выделения, клонирования и рестрикции генов. Подробный анализ ДНК маркеров приведен в обзорной статье Алтухова и Салменковой (2002).
В настоящее время доминирующую роль в качестве таких маркеров играют микросателлитные последовательности ДНК (Зиновьева Н. А. и др., 2002). С их использованием построена самая подробная генетическая карта крупного рогатого скота, которая легла в основу работ по поиску ло-кусов хозяйственно-полезных признаков с помощью ДНК-маркеров (Кар-pes M.S. et al., 1997).
В последнее время, благодаря совместной работе многих зарубежных лабораторий и финансированию проектов, касающихся картированию геномов, разработан метод использования микросателлитных маркеров в селекции сельскохозяйственных животных (Weber J.L. and May Р.Е., 1989; Rohrer G.A. et al., 1994; Georges M. et al., 1995; Moore S.S. et al., 1991). Недавние исследования показали влияние различий по длине микросателлитов на фенотипический эффект, на физиологию и на уровень развития организма.
В ряде работ показана генетическая связь между микросателлитами и локусами, отвечающими за хозяйственно-полезные признаки у сельскохозяйственных животных (Georges М. et al., 1995; Moore S.S. et al., 1991).
Согласно базе данных французского института сельского хозяйства (INRA), к настоящему времени у крупного рогатого скота выявлено 2394 микросателлита и 2236 из них картированы на хромосомах. Существуют рекомендации, разработанные ФАО по 30 микросателлитным маркерам, которые можно использовать в селекции.
Гипервариабельные микросателлитные повторы являются гораздо более информативными маркерами по сравнению с полиморфными сайтами рестрикции, так как представляют собой мультиаллельные системы с уровнем гетерозиготности, достигающим 70-90 % (Sonstegard T.S. et al., 1998). Кроме того, оказалось, что количество высокоизменчивых микросателлитных последовательностей превышает несколько десятков тысяч, они достаточно плотно и равномерно расположены в каждой из хромосом. Так, более 90 % из идентифицированных (С-А)-повторов являются полиморфными, причем, в большинстве из них, уровень гетерозиготности значительно превышает 50 % (Weissenbach J. et al., 1992).
Наиболее перспективным является использование тандемных повторов, фланкирующих важные кодирующие участки структурных генов, поскольку они облегчают поиск маркеров сцепленных с главными генами признаков продуктивности для селекционных программ.
Современные методы исследования ДНК позволяют надежно регистрировать полиморфизм микросателлитных последовательностей. С открытием новых методов определения полиморфизма на уровне ДНК - по-лимеразной цепной реакции (ПЦР), появилась возможность поиска сцепления между ДНК маркерами и локусами количественных признаков -QTL (Quantitative Trait Loci).
Результаты исследования полиморфизма микросателлтных локусов ДНК и отдельных генов уже используют для повышения эффективности селекции. Они дают возможность определять с высокой степенью достоверностью уровень генетического сходства и варианты генов, участвующих в формировании определенных видов продуктивности (Bishop M.D. et al., 1994).
Исследования полиморфизма участков ДНК привели к выявлению многочисленной группы новых генетических маркеров (Корохов Н.П., Логинова Ю.А. и др., 1996). Микросателлиты, идентифицированные у скота, лошадей, свиней и овец, зарегистрированы в международных базах данных (Jouquand S. et al., 2000) - так называемых банках генов (GenBank или EMBL). Уже в начале 90-х годов было описано множество микросателлитных последовательностей у разных видов домашних животных: у крупного рогатого скота идентифицированы 249 локусов (More., 1992), у лошадей 58 локусов (Graves., 1996), у свиней 935 локусов (Rochrer.,1996) и у овец 223 локуса (Clowatzki-Mullis M.L. et al., 1995; Maddox J.F. et al., 2000). Некоторые микросателлитные локусы идентифицированы в интронах известных генов. Например, у свиней описано 11 таких последовательностей (Ellegren Н., 1995).
Исследования (Dolf G. et al., 1990) выявили, что микросателлитные последовательности распределены по всему геному и могут находиться в интронах генов, определяющих различные белки, которые так или иначе связаны с продуктивностью животных.
Оптимизация ДНК-технологии оценки полиморфизма микросателлитных локусов ДНК крупного рогатого скота
Наибольшую долю в погрешность при определении длин фрагментов вносит этап электрофоретического разделения аллельных вариантов. Поэтому, на данном этапе, требуется особая тщательность и соблюдение идентичности условий проведения электрофореза.
Результаты электрофоретического разделения аллельных вариантов каждого из 4-х микросателлитных локусов были трижды независимо подвергнуты анализу. Полученные данные позволяют заключить, что стандартное отклонение при расчете длин фрагментов с помощью компьютерной программы UN-SCAN-GEL зависит от длины фрагментов и качества препарата и состовляет для локусов RM388 не более 0,4 п.н., для локуса ЕТН10 не более 0,5 п.н., для локуса ЕТН225 не более 0,4 п.н., для локуса DIK083 не более 0,1 п.н.
На основании полученных данных можно сделать заключение, что внесенные изменения и дополнения в стандартный протокол для ПЦР позволяют получать приемлемые результаты при анализах микросателлитных локусов ДНК без использования дорогостоящего оборудования и радиоактивного мечения.
Мы рекомендуем следующие условия проведения ПЦР для разделения и анализа аллельных вариантов при генотипирования крупного рогатого скота по микросателлитным локусам генома. Для микросателлитных локусов ЕТН225 и ЕТН10 рекомендуем следующие параметры амплификации: «горячий старт» - 95С - 5 мин; денатурация - 95С - 1 мин, отжиг - 61С - 1 мин, элонгация - 72С -1 мин.
Для локуса RM 388 и DIK083 режим амплификации должен включать: «горячий старт» - 95С - 5 мин (30 циклов), денатурация - 95С - 1 мин, отжиг - 60С - 1 мин., элонгация - 72С - 1 мин (Hirano Т., et al., 1996; Kossarek L.M., et al., 1996).
После завершения ПЦР этап достройки матрично-праймерных комплексов при 72С рекомендуем увеличить до 60 мин. Количество ядерной ДНК в реакционной смеси 30-60 нг. Концентрация праймеров не менее 50 пМ на 25 мкл. Количество хлорида магния (MgCb) 4-6 мМ. Количество Tag-полимеразы 0,3-0,4 е.а. Концентрация трифосфатов (dNTP) - 200 мкМ. Для разделения продуктов реакции следует использовать неденату-рирующий 5-12 % полиакриламидный гель (ПААГ) и 7 % денатурирующий ПААГ с формамидом. Перед электрофорезом необходимо проводить температурную денатурацию амплифицированных фрагментов. Электро-форетическое разделение проводить при напряжении 100 Вольт в течение 2,5-3 часов.
Амплификация микросателлитных локусов генома крупного рогатого скота с выбранными праймерами при соблюдении указанных выше условий проведения ПЦР позволила выявить полиморфные последовательности ДНК, доступные для анализа с помощью компьютерных программ обработки данных электрофоретического разделения фрагментов.
Первоначальным этапом работ, направленных на поиск оптимальных для анализа микросателлитных локусов, являлся сбор и систематизация опубликованных материалов по генетическим маркерам крупного рогатого скота в мировой литературе и в банках данных международной сети Интернет.
На основании собранной информации проведен отбор 4-х генетических маркеров (ЕТН225, ЕТН10, RM388 и DIK083). Основной критерий, по которому отбирались маркеры, был высокий уровень гетерозиготности. Особенно важно это требование для анализа сцепления, т.к. высокая гетерозиготность маркеров увеличивает число информативных мейозов, что, в свою очередь, увеличивает эффективность тестов сцепления. Выбранные маркеры имеют уровень гетерозиготности не менее 50 % и для них имеются сведения об их хромосомной локализации, числе выявленных аллелей и их размерах, а также сведения о праймерах, используемых для детекции конкретного локуса. Диапазон длин аллельных вариантов подобран таким образом, чтобы он не перекрывался, что позволяет объединять локусы попарно и проводить их одновременный анализ (мультиплексная ПЦР).
Одно из непременных условий, которое соблюдалось нами при отборе маркеров - это высокий уровень полиморфизма, который выражается в оценке ожидаемой и фактической гетерозиготности, РІС (информативной ценности маркеров), а также характеристике аллельного разнообразия и частот исследуемых локусов.
Предложенные условия ПЦР - анализа позволили получить четкую картину распределения фрагментов ДНК - аллельных вариантов микросателлитного локуса RM388 у крупного рогатого скота (рис. 19) и оценить длину микросателлитных последовательностей ДНК. В результате анализа ДНК по локусу RM388 у исследованных животных крас но-пестрой породы обнаружено 14 аллелей длиной от 137 до 165 п.н., в основном отличающихся друг от друга на 2 п.н. Наличие аллеля длиной 165 п.н, предполагает существование аллеля длиной 163 п.н., не обнаруженного в исследуемой выборке животных. Частота встречаемости аллельных вариантов микросателлитного локуса RM388 у животных красно- пестро и породы крупного рогатого скота приведена в таблице 3.
Полиморфизм микросателлитного локуса DIK083
Значительный полиморфизм изучаемого локуса и большое количество аллельных вариантов явились основой формирования значительного количества генотипов. Частота встречаемости генотипов у крупного рогатого скота по микросателлитному локусу DIK 083 приведена в таблице 16.
Среди изученной группы животных красно-пестрой породы (п=21) обнаружено 18 различных генотипов. Выявлено 16 гетерозиготных и 5 гомозиготных особей с генотипами 230/230, 232/232, 242/242, 244/244 и 248/248. Фактическая гетерозиготность животных красно-пестрой породы составила 0,76, что немного ниже ожидаемого уровня гетерозиготности 0,87.
Значение показателя информативной ценности РІС для микросател-литного локуса DIK083 у животных красно-пестрой породы составило 0,87. Проведение амплификации локуса DIK083 в идентичных условиях ПНР из проб ДНК коров черно-пестрой породы привело к неспецифическим результатам. В связи с тем, что полосы, соответствующие аллельным вариантам микросателлитных последовательностей, носили размытый характер, оценка длин фрагментов ДНК таким образом, стала невозможна. Hirano Т. с соавторами (1996) были проведены исследования полиморфизма микросателлитного локуса DIK083 на Международной референтной панели крупного рогатого скота. Было выявлено 8 аллелей, гетерозиготность составила 0,58. В результате проведенных исследований был установлен высокий уровень полиморфизма изучаемых гипервариабельных микросателлитных локусов генома, характеризующихся наличием аллелей разных размеров и достаточно высоким уровнем гетерозиготности и информативной ценности. Число аллелей изучаемых микросателлитных локусов животных красно-пестрой породы варьировало от 8 до 14. Среднее число аллелей на ло-кус составило 10,2. Как видно из анализа результатов, представленных в таблице 17, уровень гетерозиготности всех изучаемых микросателлитных последовательностей превысил 0,50. Это дает возможность использовать протестированные микросател-литные локусы в дальнейших исследованниях сцепления с локусами хозяйственно-полезных признаков. Высокая гетерозиготность обеспечивает большое количество информативных мейозов (случаев рекомбинации), что повышает эффективность тестов сцепления. Средняя гетерозиготность по 4-м изучаемым микросателлитным ло-кусам у животных красно пестрой породы составила 0,78. Такая высокая гетерозиготность популяции подтверждает высокий полиморфизм изучаемых микросателлитных локусов и может объясняться тем, что красно-пестрая порода получена путем использования голштинских быков красно-пестрой масти из разных географических регионов на местном маточном поголовье симментальского скота. Ожидаемая гетерозиготность определяется уровнем аллельного разнообразия (Животовский Л.А., 1991). В наших исследованиях уровень фактической гетерозиготности в целом соответствовал теоретически ожидаемой, кроме микросателлитного локуса RM388, для которого уровень фактической гетерозиготности 0,53 был значительно ниже ожидаемого значения 0,99. Оценка достоверности различий между ожидаемым и фактическим значением гетерозиготности по критерию х показала, что выявленные различия не являются достоверными. Применение вышеуказанных условий ПЦР и разделения фрагментов в наших протоколах позволяет без использования радиоактивного мечения и ДНК-секвенирующих гелей выявлять различия между аллельными вариантами, которые составляют два и более нуклеотидных повторов. Эффективность выявления индивидуальных отличий по полиморфизму микроса-теллитных повторов в наших экспериментах можно вычислить. Средняя величина ожидаемой гетерозиготности, согласно формуле 1- р,2, по 4-м маркерам локусов животных красно-пестрой породы состовляет 90%. Если учитывать различия в длине повторов на 4 п. н., тогда теоретическая гете-розиготность составит (Hubert R. et al., 1992): где размер і- го аллеля минус размер j- го аллеля 4. В этом случае гетерозиготность будет в среднем составлять 0,81. Снижение гетерозиготности до 0,81 является несущественной в плане выявления индивидуальных различий, поскольку при установлении отцовства рассматривается более одного кандидата. Чем больше величина РІС (показателя информативной ценности) для локуса, тем информативнее оказывается его использование в качестве маркера. Принято считать, что при Р1С 0,5 локус очень информативен. В результате анализа наших данных было установлено, что у животных красно-пестрой породы все изученные микросателлитные локусы имели значение Р1С 0,5 (табл. 17), следовательно, эти локусы могут быть с успехом использованы в дальнейших исследованиях. Значение РІС составило от 0,87 для локуса DIK083 до 0,99 для локуса ЕТНЮ. Среднее значение РІС для всех изучаемых микросателлитных локусов достигло 0,93.
Сопоставление полученных результатов исследований на животных красно-пестрой и черно-пестрой породы показало, что существуют различия в количестве выявленных аллелей и характере распределение частот встречаемости аллельных вариантов между изученными группами животных. Уровень генетического сходства изученных групп животных по Хе-ленджеру (1997) составил для микросателлитного локуса RM388 0,54, для локуса ЕТН225-0,69, для локуса ЕТНЮ-0,71. Полученные данные по уровню полиморфизма изучаемых локусов у животных черно-пестрой породы могут быть оценены как предварительные в связи с малой величиной вероятности и высоким уровнем индивидуальных различий по изучаемым гипервариабельным участкам генома (табл.18). Необходима дополнительная проверка полученных результатов на большем поголовье животных черно-пестрой породы.
