Содержание к диссертации
Введение
Глава. 1. Обзор литературы 6
1.1. Мировой генофонд мини-свиней и использование их в биомедицинских исследованиях 6
1.2. Системы групп крови свиней и их использование в практике 19
1.3. Генетические системы групп крови человека 31
1.4. Состояние ксенотрансплантации на современном этапе 45
Глава. 2. Материал и методы исследований 53
2.1. Материал и методы исследований 53
2.2. Методика определения групп крови свиней 55
2.3. Методика определения групп крови человека 61
Глава 3. Результаты собственныхс исслендований 64
3.1. Биологические особенности светлогорских мини-свиней 64
3.1.1. Экстерьер и конституция светлогорских мини-свиней 65
3.1.2. Рост и развитие светлогорских мини-свиней 67
3.1.3. Физиологические параметры организма мини-свиней 72
3.1.4. Интерьерные показатели организма мини-свиней 77
3.1.5. Степень сходства биологии свиньи и человека 79
3.2. Иммуногенетическая характеристика светлогорских мини-свиней 85
3.3. Динамика генетической структуры светлогорских мини-свиней по группам крови в онтогенезе 97
3.4. Сравнение иммунологического статуса светлогорских мини-свиней и человека 101
3.4.1. Схема лабораторных исследований 102
3.4.2. Сходство и различия по генотипам групп крови между мини-свиньями и человеком 104
3.4.3. Выявление эритроцитарных антигенов во внутренних органах мини-свиней 119
3.5. Методологические подходы для создания стад свиней в целях ксенотрансплантации 124
Выводы 125
Практические рекомендации 126
Список использованной литературы
- Системы групп крови свиней и их использование в практике
- Состояние ксенотрансплантации на современном этапе
- Методика определения групп крови свиней
- Рост и развитие светлогорских мини-свиней
Введение к работе
Одним из перспективных направлений трансплантологии специалисты считают ксенотрансплантацию, или межвидовую трансплантацию — трансплантация органов и тканей от животного другого биологического вида, чем человек. Ксенотрансплантация является актуальнейшей проблемой, и во многих странах мира сейчас изучаются возможности преодоления отторжения органов, возникающего из-за реакции иммунной системы. Даже при очень сильной иммуносупрессии организма реципиента ксенотрансплантат от животного не выживает в организме человека более нескольких минут в результате сверхострой реакции отторжения, сопровождающейся массивным гемолизом, агглютинацией эритроцитов и тромбоцитов и множественным тромбозом сосудов пересаженного ксенооргана. Наиболее иммунологически близкими человеку являются свиньи или высшие приматы.
Преимуществами свиньи, по сравнению с приматами, являются ее широкая распространенность, беспроблемное выращивание и содержание, сходство свиных органов с человеческими по размерам и физиологии. К тому же, изъятие свиных донорских органов, не вызывает возражений у защитников природы, поскольку свиней все равно выращивают на мясо. Свиньи схожи с человеком по строению, функциям и физиологии сердечнососудистой системы, пищеварения, строение зубов, почек, кожи, глаза, свиньи имеют сходный с человеком состав крови и цифры артериального давления, а так же существует значительное сходство между многими болезнями человека и свиньи. Для удобства проведения исследований в лабораторных условиях были выведены мини-свиньи, которые не отличаются от обычных свиней основными анатомо-морфологическими признаками. Они удобны при работе в условиях вивария ввиду своих маленьких размеров, быстрой смене поколений, неприхотливости в кормлении и содержании, и добром нраве. Мини-свиньи являются удобной моделью в исследованиях по фармакологии, иммунологии, токсикологии,
4 дерматологии, стоматологии, радиобиологии, в исследованиях алкоголизма, ожирения и вирусных заболеваний.
Так первые опыты по использованию сердечных клапанов свиней для людей были отработаны на сибирских лабораторных мини-свиньях. Разведение этих животных сейчас осуществляется в специальных экспериментальных хозяйствах и интерес к ним растет. Свиные сердечные клапаны очень хорошо подошли человеку по совместимости и морфологии, что подтверлсдено многими ведущими кардиоцентрами у нас в стране и за рубежом.
Важную роль в развитии реакции отторжения, при пересадке органов от человека к человеку (аллотрансплантация - внутри одного биологического вида), играет совместимость по антигенам эритроцитов. Реципиент и донор должны иметь одинаковую группу крови (восемь из десяти людей умирают, потому что не находят вовремя донора с подходящей группой крови), т.е. необходимы идеальные условия для приживления органа. Это положение наиболее актуально при пересадке человеку органов животных. Работ по изучению совместимости по эритроцитарным антигенам свиней и человека практически нет. Это направление и стало темой наших исследований.
Цели и задачи исследований. Цель исследований заключалась в изучении иммунобиологического статуса свиней, степени его сходства с человеком и разработке методических подходов по созданию стад свиней в целях ксенотрансплантации.
В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи исследований:
- изучить биологические особенности свиней (физиологические
параметры, интерьерные показатели)
изучить степень биологического и физиологического сходства свиньи и человека
определить генетический статус типов крови обычных и мини-свиней
изучить динамику генетической структуры мини-свиней по группам крови в онтогенезе
определить степень иммунологического сходства групп крови человека и свиней
- на основе результатов исследований разработать методические
подходы по созданию стад свиней в целях ксенотрансплантации, на
первоначальном этапе
Научная новизна работы состоит в том, что впервые в сравнительном аспекте исследованы интерьерные, физиологические и биохимические особенности мини-свиней, обычных свиней и человека. Проведены исследования по иммунологическому сходству свиной и человеческой крови, а так же исследования по выявлению эритроцитарных антигенов во внутренних органах мини-свиней.
Практическая значимость работы. Полученные результаты служат основой для разработки предложений по созданию стад свиней соответствующих требованиям ксенотрансплантации селекционными методами. Определены типы крови свиней, характеризующиеся наибольшей степенью сходства с типом крови человека. А так же выявлены эритроцитарные антигены во внутренних органах свиней.
Основные положения, выносимые на защиту:
- степень сходства и различия иммунологического статуса свиней и
человека;
методические подходы для создания стад свиней в целях ксенотрансплантации.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и одобрены:
- на ученом совете Всероссийского НИИ племенного дела (2008г);
- на межотдельских научных конференциях Всероссийского НИИ
племенного дела (2007, 2008, 2009гг);
-.на ученом совете Научного центра биомедицинских технологий РАМН (2009г).
Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликованы 5 научных статей, в том числе в ведущих рецензируемых журналах ВАК РФ - 1.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах, иллюстрирована 27 таблицами, 3 схемами. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, собственных исследований, выводов, предложений и списка использованной литературы, который включает 150 источников, в том числе 51 на иностранных языках.
Системы групп крови свиней и их использование в практике
Анализ групп крови нашел широкое применение в хирургической и акушерской практике, в судебной медицине, в ветеринарии, а в последнее время все больше используется в племенном животноводстве. Не удивительно, что во многих странах мира созданы лаборатории и целые институты по изучению групп крови животных.
Исследование групп крови приобретает все более широкое значение при селекции животных. Это объясняется легко наблюдаемыми закономерностями их наследования, неизменяемостью в течение всей постэмбриональной жизни животного, а также относительно простым их определением (с помощью гемолиза или агглютинации).
Группы крови благодаря кодоминантной форме наследования без рецессивных форм представляют собой удобную генетическую модель для изучения влияния на наследственную структуру организма, внутрипородных популяций и пород таких методов селекции, как линейное разведение, инбридинг, скрещивание [77].
Изучение групп крови с успехом используется для установления структуры породы, анализа отдельных генеалогических и заводских линий. Установление четко дифференцированных различий по группам крови между линиями между линиями внутри породы позволит вести линию не только по генеалогии, но и по наличию «сигнальных» антигенов, специфичных для представителей этой линии. Таким разведением под контролем групп крови можно достичь большей однородности внутри линий и в то же время большего различия между линиями и семействами.
Изучение групп крови наметило определенные возможности разработки иммуногенетической оценки и измерения инбридинга. Антигены, определяющие группы крови, представляют очень удобную модель для выявления закономерностей, происходящих при инбридинге [74, 77].
Иммуногенетический мониторинг позволяет направлено регулировать селекционные процессы с целью сохранения в популяции ценных маркерных аллелей [21].
У свиней известно около 80 эритроцитарных антигенов. Широкое наследственное разнообразие, кодоминантное наследование, неизменяемость в онтогенезе позволяют в селекции свиней использовать их в качестве генетических маркеров. С их помощью устанавливают широту генетической изменчивости и уровень гомогенности популяции, характеризуют генетические процессы, происходящие в них; оценивают генетическое сходство (родство) между породами и линиями, используют в качестве маркеров при разведении по линиям, межпородном и межлинейном скрещивании.
Как известно мини-свиньи не отличаются от обычных свиней основными анатомо-физиологическими параметрами [74], а значит иммуногенетические характеристики могут служить показателями генетических различий и сходства популяций при исследовании генеалогической структуры пород и их происхождения [77].
Генетические системы групп крови свиней
Многие исследователи на протяжении ряда лет изучали группы крови свиней и их связь с некоторыми хозяйственно-полезными признаками, таким образом, в настоящее время относительно хорошо изучены 16 генетических систем групп крови свиней, объединяющих более 40 эритроцитарных факторов [77].
Как известно мини-свиньи не отличаются от обычных свиней основными анатомо-физиологическими параметрами, а значит иммуногенетические характеристики могут служить показателями генетических различий и сходства популяций при исследовании генеалогической структуры пород и их происхождения [74,77].
Система А является первой обнаруженной у свиней генетической системой групп крови, но несмотря на это остается одной из наименее ясных. Антиген А свиней имеет определенное иммунологическое сходство с антигеном А у человека.
Состояние ксенотрансплантации на современном этапе
Одним из перспективных направлений трансплантологии специалисты считают ксенотрансплантацию, или межвидовую трансплантацию — трансплантация органов и тканей от животного другого биологического вида, чем человек. Ксенотрансплантация является актуальнейшей проблемой, и во многих странах мира сейчас изучаются возможности преодоления отторжения органов, возникающего из-за реакции иммунной системы. Даже при очень сильной иммуносупрессии организма реципиента ксенотрансплантат от животного не выживает в организме человека более нескольких минут в результате сверхострой реакции отторжения, сопровождающейся массивным гемолизом, агглютинацией эритроцитов и тромбоцитов и множественным тромбозом сосудов пересаженного ксенооргана. Наиболее иммунологически близкими человеку являются свиньи или высшие приматы.
Свинья широко используется в хирургии. В литературе имеются данные о проведении операций по трансплантации сердца и поиске возможностей для применения сердечных клапанов свиньи в качестве гетеропластического материала в кардиохирургии. Сердечные клапаны свиньи, пересаженные человеку, спасли жизнь не одной тысячи людей. Свиные сердечные клапаны очень хорошо подошли человеку по совместимости и морфологии, что подтверждено многими ведущими кардиоцентрами у нас в стране и за рубежом. В Израиле, например, сердечные клапаны свиней в кардиохирургии начали применять уже в 1980 году. Профессор Вилен Тихонов, главный научный сотрудник института кардиологии в Новосибирске, рассказывает: "Успешно отработаны технологии пересадки человеку сердечных клапанов свиней, велись совместные работы с институтами трансплантологии по изучению процессов в клетках сердечной мышцы" [74].
Современная наука огромными шагами идёт вперёд. В США, в лаборатории университета штата Миссури, в ноябре 2003 года, родилась клонированная мини-свинья по кличке Голди [35]. Она стала настоящим прорывом в области генетики и трансплантологии. У этого уникального животного отсутствуют гены, отвечающие за процесс отторжения чужеродной ткани. Это позволяет пересаживать органы такой свиньи человеку, без страха перед реакцией отторжения. И пациентам теперь не придется всю жизнь принимать дорогостоящие медицинские препараты, чтобы избежать отторжения. Мини-свиньи широко используются при моделировании алкоголизма. Так как на человеческий и свиной организмы одинаково воздействуют многие биологические и медицинские препараты, в том числе наркотические, антиалкогольные и радиоактивные вещества.Следует сказать о крайней чувствительности свиней к стрессовым факторам. Многочисленные железы, расположенные у свиней в области спины и шеи, выделяют особые вещества липидной природы -феромоны, образующие сложную гамму, индивидуальную для каждого животного, вследствие чего свиньи способны различать животных, принадлежащих к различным группам. При изменении окружающей среды и возникновении стрессовых ситуаций свиньи отвечают изменением поведенческих и пищевых реакций, гормонального статуса и рН крови. Сопоставление данных, полученных на человеке, с экспериментальными исследованиями на свиньях показало идентичность некоторых изменений минерального обмена, метаболизма и структуры костной ткани, состава белка, возникающих при стрессовых нагрузках. Все эти факты свидетельствуют о несомненной пригодности свиньи для моделирования стресса [49].
Мини-свиньи являются просто незаменимой моделью при изучении онтогенеза иммунного ответа на разные антигены. Во-первых, они невелики по размерам, ими можно легко манипулировать в лабораторных условиях. Во-вторых, свиньи многоплодны, что позволяет в одном помете иметь несколько контрольных и подопытных животных. В-третьих, возможно выращивание поросят в контролируемых стерильных условиях. В-четвертых, поросята рождаются лишенными иммуноглобулинов, обладающих активностью антител [20].
Характер обмена веществ и всеядность свиней, а также возможность вызова у них пищевыми и другими факторами атеросклероза делают этих животных исключительно ценным объектом для изучения роли генетических факторов и особенностей питания при возникновении сердечно-сосудистых заболеваний [58].
К сожалению, в России в настоящее время эта биологическая модель -мини-свинья практически не задействована в решении научных проблем отечественной биологии и медицины. Неслучайно за рубежом зачастую ставят под сомнение результаты наших научных исследований из-за "некондиционности" экспериментальных биомоделей. Приходится проводить опыты на привычных объектах: кроликах, крысах и мышах.
Методика определения групп крови свиней
Объектом исследования служили мини-свиньи светлогорской популяции. Основное поголовье мини-свиней (106 гол.) было аттестованы по 26 эритроцитарным антигенам 10 систем групп крови. Все свиньи были подведены с самого рождения под идентичные условия содержания в лаборатории «биомедицины». У всех животных были взяты образцы крови. У свиноматок и хряков из ушной вены, у поросят из хвостовой вены.
Предварительно были приготавлены пробирки с анти коагулянтом следующего состава: лимоннокислый натрий трехзамещенный 35,0г., глюкоза 20,0г., альбуцид 5,0г., риванол 0,03г., левомицетин 0,15г., дистиллированная вода до 1000 мл. Соотношение антикоагулянта крови 1:1 — 1:2. После взятия порции крови пробирку осторожно переворачивали несколько раз для более равномерного смешивания. Затем при стационарной температуре 3-4С образцы доставлялись в лабораторию. Все пробы крови были собраны быстро в ранние утренние часы. Анализ образцов крови и определение эритроцитарных антигенов был проведен в лаборатории иммуногенетики свиней ВНИИ Племенного дела. Атигенный состав крови свиней определяли по результатам постановки серологических реакций с помощью моноспецифических сывороток реагентов.
Сущность реакции состоит в том, что антитела, содержащиеся в сыворотках-реагентах, соединяются с гомологичными антигенами эритроцитов крови исследуемого животного, вызывая агглютинацию, лизис или преципитацию. Соединение антигена с антителом вызывает изменения субстрата в разной степени, что визуально оценивается и фиксируется в специальных бланках — серологических тестах.
Для выявления антигенов эритроцитов свиней использовались серологические реакции: прямой агглютинации (РА) и реакция связывания комплемента, называемую реакцией гемолиза (РГ).
Перечень наиболее употребительных терминов и обозначение групп крови [52]: Антитела - вещества белковой природы (гаммаглобулины), образующиеся при введении чужеродного антигена и обладающие способностью специфически взаимодействовать с данным антигеном.
Антиген (фактор, антигенная специфичность) - вещество белковой природы, несущее признаки генетической информации и при парентеральном введении в организм способное вызывать иммунный ответ у индивидов, не содержащих данный антиген. Все антигены строго специфичны и выявляются соответствующими антителами.
Аллель — одно из состояний гена. Это комплекс антигенов, отдельный антиген или его (их) отсутствие (рецессивная форма), передаваемые как одно целое от родителя к потомку. По каждой системе групп крови животное имеет в норме два аллеля, один из которых оно унаследовало от отца, другой - от матери.
Аллелофонд - совокупность изученной части генов в популяции, характеризующейся определенной их частотой.
Гемагглютинация (феномен агглютинации) — склеивание эритроцитов друг с другом - проявление реакции прямой агглютинации. Прямой потому, что в данном случае антитела действуют непосредственно на корпускулярные антигенные частицы.
Гемолиз (феномен лизиса) - разрушение эритроцитов, сопровождаемое переходом гемоглобина в раствор. Реакции иммунного лизиса характеризуются тем, что они не происходят при наличии только двух ингредиентов - антигена и антитела. Необходимо присутствие третьего компонента, получившего название комплемента.
Группа крови (феногруппа) - перечень антигенов (или один антиген), выявленных в одной из систем групп крови типирующими реагентами. Антигены в феногруппе пишутся в алфавитном порядке. Именно определенные сочетания антигенов (или один антиген), которые передаются от родителя к потомствури как наследственные единицы, и подразумеваются под понятием «группа крови». Группа сцепления — совокупность генов, локализованных в одной хромосоме. Генетическая система (локус) - участок хромосомы, в котором локализован ген, контролирующий синтез одного или нескольких тесно сцепленных антигенов (белков, ферментов). Антигены разных генетических систем наследуются независимо друг от друга.
Маркированная хромосома - хромосома, характеризующаяся наличием определенного гена или генов.
Тип крови (совокупность групп крови всех генетических систем) -перечень антигенов, выявленных у исследованного животного определенными антигенами [11].
Рост и развитие светлогорских мини-свиней
На протяжении выполнения работы велись наблюдения за ростом и развитием светлогорских мини-свиней. Проводилось регулярное взвешивание животных в различные периоды роста, а также снимались основные промеры у взрослых животных. Проводился отбор для дальнейшего разведения животных крепкого, пропорционального телосложения с хорошо выраженными признаками породы, лишенных недостатков и пороков экстерьера (общая слабость, а также грубость или переразвитость конституции, провислая спина и поясница, перехват за лопатками, слабость конечностей и др.).
В результате проведенных наблюдений можно сделать вывод о том, что для светлогорских мини-свиней, как для обычных пород свиней характерны две особенности роста. Первая особенность заключается в низкой скорости роста эмбрионов до рождения. Скорость роста в этот период очень низкая, меньше, чем у кроликов в 5 раз. Вторая особенность роста свиней выражается в высокой его интенсивности в период после рождения. По интенсивности роста в этот период свиньи превосходят кроликов в 8-10 раз. Эти процессы находятся под генетическим контролем.
Наибольшая интенсивность роста наблюдается до полового созревания, затем темп роста их значительно замедляется. Свиньи продолжают расти и после полового созревания, которое наступает в 4-5 месячном возрасте. Рост хряков и свинок продолжается до трехлетнего возраста. Свиньи разных пород отличаются по характеру роста, что обусловлено различиями генетических вариантов, контролирующими рост у разных пород. Лабораторные мини-свиньи разных линий отличаются по весовым характеристикам и по темпу роста в разные периоды онтогенеза. У светлогорских мини-свиней хряки весят значительно меньше, чем свинки. Двухлетний хряк весит 28-32кг, а свинка этого же возраста весит 37-40кг. Это связано с тем, что идет интенсивный отбор, направленный на уменьшение размеров и живой массы, а поскольку мужской генотип скорее отвечает на селекцию, то, естественно, у мини-свиней вес самцов меньше, чем самок, в то время как у производственных пород, которые отбирались на большую массу и большую интенсивность роста, наоборот, вес самцов больше, чем самок. Такова специфика ответа на селекцию у особей мужского пола.
Светлогорские мини-свиньи достигают половой зрелости к полугоду, но для воспроизводства обычно используют 7-9 месячных животных, так как в это время развитие внутренних органов и костяка достигает полной зрелости. Продолжительность супоросности у мини-свиней также как у обычных составляет 112-114 дней. Это необходимо учитывать при проведении экспериментов, для которых необходимы эмбрионы точного срока развития или при проведении гнотобиологических экспериментов, когда начинают операцию перед самым опоросом.
Поросята мини-свиней растут значительно медленнее, чем поросята обычных пород свиней, и к 6 месяцам достигают 8- 12кг, тогда как поросята обычных пород свиней в этом возрасте весят 70-95кг. Уменьшение массы поросят мини-свиней при правильном рационе кормления не уменьшает их жизнеспособности, они так же энергичны, крепки, как и крупные поросята обычных свиней. Технология выращивания поросят мини-свиней практически такая же, как и обычных свиней. Свинья неприхотлива к уходу и еде, условиям содержания, легко дрессируется, имеет сравнительно короткую беременность, ее потомство многочисленно и скороспело, а генофонд разнообразен. Это дает им преимущество перед многими лабораторными животными.
Помимо собственных наблюдений, измерений промеров, визуальной оценки и вычисления индексов были проанализированы литературные данные по данному разделу. В результате чего был найден материал по установлению корреляционной связи живой массы и признаков экстерьера у светлогорских мини-свиней [35]. Оценка особей по экстерьеру - один из важнейших разделов селекционной работы. По признакам экстерьера определяют тип конституции, породную и линейную принадлежность, особенности телосложения, состояния здоровья. Кроме того, известно, что люди в зависимости от типа телосложения имеют предрасположенность к некоторым видам заболеваний, что необходимо учитывать при моделировании ряда патологий. На 94 мини-свиньях было проведено
изучение коррелятивных связей живой массы особей и ряда признаков экстерьера. Была установлена положительная корреляция между живой массой в 1-, 3- и 6-месячном возрасте и длиной туловища i i=0,8; г3=0,9 и г6=0,9 и обхватом груди за лопатками i"i=0,6; г3=0,9 и г6=0,9 в те же возрастные периоды. Живая масса также положительно коррелирует с обхватом пясти ri=0,l; г3=0,8 и г6=0,5 и с высотой в холке ri=0,7; г3=0,7; Гб=0,5. Поскольку длина туловища, обхват груди за лопатками, высота в холке и обхват пясти не одинаково коррелируют с живой массой, можно считать, что при интенсивном отборе по живой массе в ряде покалений будут получены изменения телосложения у светлогорских мини-свиней в соответствии с задачами и заказом экспериментаторов [26, 80].
