Содержание к диссертации
Введение
1. Аналитический обзор
1.1. Маркеры в генетике и селекции растений 8
1.1.1. Молекулярно-генетические маркеры 11
1.1.2. Понятие полимеразной цепной реакции 17
1.1.3. Типы ДНК-маркеров 22
1.2. Иммунитет растений 32
1.3. Изучение биоразнообразия возбудителя пирикуляриоза (Magnoporthe grisea) 43
1.4. Молекулярный полиморфизм Pi-ta гена устойчивости к пирикуляриозу 47
2. Материалы и методы
2.1. Создание внутригенного маркера к гену устойчивости к пирикуляриозу риса Pi-ta . 52
2.2. Изучение биоразнообразия изолятов Magnoporthe grisea (Herbert) Barr государственной российской коллекции патогена на основе полиморфизма микросателлитных локусов. 60
2.3. Статистическая обработка данных 67
3. Результаты и обсуждение
3.1. Создание внутригенного ДНК маркера для гена устойчивости к пирикуляриозу риса Pi-ta 69
3.2. Поиск источников гена устойчивости Pi-ta среди сортов и сортообразцов коллекции исходного материала ВНИИ риса при помощи маркерной системы ARRRIpi-taR/pi-taL 72
3.3. Изучение биоразнообразия изолятов Magnoporthe grisea (Herbert) Barr государственной российской коллекции патогена на основе молекулярно-генетического подхода 75
4. Выводы 96
5. Список литературы 98
6. Приложение
- Маркеры в генетике и селекции растений
- Типы ДНК-маркеров
- Создание внутригенного маркера к гену устойчивости к пирикуляриозу риса Pi-ta
- Создание внутригенного ДНК маркера для гена устойчивости к пирикуляриозу риса Pi-ta
Введение к работе
Рис - одна из важнейших зерновых культур. Его зерном питается почти половина человечества. Среди факторов, лимитирующих урожай риса, ведущее место занимают болезни и вредители. Несмотря на мощное развитие в настоящее время агрохимической индустрии, возможности ее далеко не беспредельны. Причем использование химических средств защиты растений приводит к химическому загрязнению окружающей среды (в частности загрязнению фунгицидами). Скученность и однотипность возделываемых растений агробиоценоза привело к возникновению новых и весьма благоприятных условий для питания, размножения и специализации в процессе филогенеза видов фитопатогенов и, в конечном счете к значительным изменениям в составе вредоносных грибковых болезней сельскохозяйственных культур [1; 9]
Грибы - неотъемлемая часть биосферы нашей планеты и важный объект народно-хозяйственного значения. С одной стороны грибы используются в пищу человеком и для изготовления лекарственных препаратов, а с другой стороны являются возбудителями заболеваний человека, причиной аллергических реакций, потенциальными биологическими ядами. Но наиболее значимы грибы как фитопатогены. Грибы вызывают более десяти тысяч различных заболеваний растений, что приводит большим потерям, около 20-30%, урожая сельскохозяйственных культур [116, 7]
Настоящее требует более тонкого и бережного подхода к использованию природных ресурсов, в том числе и в земледелии. В данных условиях в соответствии с закономерностями развития агроэкосистем должны измениться стратегия и тактика не только защиты растений, но и всей растениеводческой практики.
Применение устойчивых сортов - наиболее надёжный метод борьбы с большинством болезней растений, в том числе и с пирикуляриозом риса По
словам одного из создателей отечественной фитоиммунологии Шапиро И.Д., «потребность в сортах, иммунных к фитопатогенам, на протяжении научно-технического прогресса в сельском хозяйстве будет увеличиваться. Причем в особенности возрастет значение таких сортов при переходе от интегрированной защиты растений к управлению агробиоценозами» [48,49]
Генетическое разнообразие, природное или созданное человеком, является основой для выведения новых сортов сельскохозяйственных культур, в том числе и риса. Маркеры - распознаваемые фенотипические проявления генов - удобно использовать для отбора растений, несущих гены устойчивости к интересующему селекционера заболеванию, и отслеживания этих признаков в процессе селекции и в семеноводстве. Первоначально в этих целях применялись морфологические маркерные признаки (особенности формы, окраски). Количество их ограничено, к тому же полигенная структура многих агнономически ценных признаков растений значительно усложняет генетическое картирование агрономически важных генов и контроля над переносом этих генов в новые формы растений развитие методов молекулярной биологии привело к появлению нового класса молекулярно-генетических маркеров — фрагментов ДНК, соответствующих нуклеотидным последовательностям и входящих непосредственно в структуру целевого гена или сцепленными с этим геном [44]. Маркерная селекция значительно упрощает процесс отбора растений с интересующим селекционера геном [25; 26].
Исходя из вышесказанного, использование ДНК-маркеров коренным образом изменило методы оценки генетического разнообразия, паспортизации и классификации сортов растений и штаммов грибов, картирования и определения, физической природы генов, интрогрессии новых генов и генетического мониторинга в селекции и генетике риса и его патогенов.
Актуальность проблемы. Пирикуляриоз - одно из наиболее вредоносных заболеваний риса, вызываемое возбудителем Magnaporthe
grisea (Herbert). Действенная и экологически безопасная стратегия борьбы с этим заболеванием - выведение устойчивых сортов, что является одним из важных направлений в селекции риса [12].
В селекции устойчивых к пирикуляриозу сортов риса перед селекционером становятся две проблемы: выбор подходящих генов устойчивости и прогноз стабильности устойчивости сорта с этой комбинацией генов. Вот почему необходим простой, но эффективный метод анализа генов устойчивости к этому заболеванию, учитывая, что многие сорта, вовлекаемые в скрещивания, содержат несколько генов устойчивости и многие селекционные линии поддерживаются долгое время. Гены вертикальной устойчивости могут быть выявлены из анализа реакции сорта на инокуляцию моноизолятами Magnoporthe grisea (Herbert) Barr с известными генами авирулентности. Но такой классический фитопатологический тест требует затраты времени и значительных материальных средств. Также важным лимитирующим фактором является нестабильность генов авирулентности возбудителя пирикуляриоза риса и перекрывание спектра расоспецифической устойчивости [24].
Маркирование генов устойчивости к патогену позволяет быстро и эффективно проводить пирамидирование генов в генотипе сорта.
Необходимо также помнить, что неотъемлемой составляющей управления комплексом защитных мер против грибковых заболеваний растений является изучение самого патогена. В свете современного развития молекулярно-биологических подходов, появилась возможность исследования генетического разнообразия молекулярно-генетическими методами.
Цель и задачи исследований. Целью работы являлась разработка эффективного метода идентификации генов устойчивости риса к биотическим стрессам (пирикуляриозу) в селекционных программах, ориентированных на создание устойчивых к пирикуляриозу сортов, основанных на полиморфизме ДНК-маркеров, а также изучение биоразнообразия возбудителя пирикуляриоза риса (Magnoporthe grisea
6 (Herbert) Barr) молекулярно-генетическими методами. В связи с этим в ходе исследований были поставлены следующие задачи:
Разработать ДНК-маркерную систему для выявления гена устойчивости к пирикуляриозу риса Pi-ta.
Провести поиск доноров устойчивости к гену AVRPi-ta коллекции ВНИИ риса с использованием сконструированного молекулярного маркера ARRRIpi-taR/pi-taL.
Провести «ДНК-паспортизацию» образцов Российской Государственной коллекции изолятов возбудителя пирикуляриоза риса с помощью микросателлитных маркеров.
На основании данных микросателлитного анализа сгруппировать изоляты в соответствии со степенью генетического родства.
Научная новизна исследований. В настоящей работе впервые:
- создан ДНК-маркер ARRRIpi-taR/pi-taL на основе полимеразной
цепной реакции, позволяющий идентифицировать ген устойчивости к
пирикуляриозу Pi-ta
- проведен скрининг коллекции образцов исходного материала ВНИИ
риса на наличие расоспецифического гена устойчивости к пирикуляриозу Pi
ta, на основе его ДНК-полиморфизм.
проведена «ДНК-паспортицазция» образцов Российской Государственной коллекции изолятов возбудителя пирикуляриоза риса с помощью микросателлитных маркеров.
- отобраны наиболее полиморфные маркеры, необходимые для оценки
генетического родства штаммов возбудителя пирикуляриоза риса.
Научно-практическая ценность работы.
Создан внутригенный ДНК-маркер, необходимый для обнаружения гена устойчивости к пирикуляриозу Pi-ta, и ведения маркерной селекции на устойчивость к пирикуляриозу.
Показана возможность использования полиморфизма
микросателлитных локусов для ранжировки изолятов Pyricularia grisea Sacc. согласно генетическому родству и их географическому происхождению.
Степень генетического полиморфизма между изученными изолятами Magnoporthe grisea (Herbert) Barr, выявленная по данным микросателлитного анализа, говорит о возможности их использования для создания генетических «отпечатков».
Основные положения, выносимые на защиту:
Создание внутригенного доминантного ДНК-маркера к гену устойчивости к пирикуляриозу риса Pi-ta.
Скрининг образцов коллекции исходного материала ВНИИ риса на наличие гена Pi-ta.
«ДНК-паспортизация» образцов Российской коллекции возбудителя пирикуляриоза, держателем которой является ВНИИ фитопатологии.
Апробация работы. V региональная научно-практическая конференция молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» 18-19 декабря 2003г., г. Краснодар (ул. Калинина, 13)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения и обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 115 страницах, содержит 12 таблиц и 23 рисунков.
Маркеры в генетике и селекции растений
Методы быстрой идентификации генотипов и определение отдельных генов имеют важное значение в процессе создания новых сортов и их размножение в селекционных учреждениях.
Другой важнейшей проблемой современного растениеводства является учет и сохранение мировых генетических ресурсов растений для селекции. Особую ценность как исходный материал представляет генофонд культурных растений: районированные и стародавние сорта. Сорта народной селекции, разного рода селекционные образцы: линии, мутанты, гибриды и т.д. Этот фонд создавался на протяжении всей истории человечества. Он непрерывно улучшается и обогащается. И накопленный материал нуждается в постоянном анализе с использованием новых методов [3].
20 век ознаменовался бурным развитием биологии. Работа Уотсона и Крика, разгадавших структуру ДНК (1953г) - молекулы-носителя наследственной информации, позволила проводить исследования на молекулярном уровне структурной организации гена и генома. Наибольший прогресс до сих пор касается прокариот. Работа с высшими эукариотами, к которым относятся важнейшие сельскохозяйственные растения, продвигается достаточно медленно. Один из эффективных и используемых уже несколько десятилетий подходов - это молекулярные маркеры [14, 130, 132].
Использование маркеров - "сигналий", изменчивость которых связана с признаками, важными для селекционеров, началось с работ А.С.Серебровского (1926). Маркер - это метчик, в биохимии фактор идентификации. Понятие "генетический маркер" в генетической литературе применяется для обозначения четко фенотипически проявляющегося менделирующего признака, который сопряжен с изменчивостью другого, качественного или количественного признака [147]. Их применяют в случаях, если изучаемый ген кодирует качественный признак с неполной пенерантностью или сопряжен с количественным признаком, а также в случае неявного проявления гена. Отбирая в потомстве генотипы с маркером, можно с определенной вероятностью ожидать, что они унаследуют признак, по которому ведется селекция. В практике генетического анализа экспериментатор, как правило, имеет дело не с самим геном - маркером, а с его каким-либо фенотипическим выражением, представляющим собой конкретный, хорошо различимый, дискретный, то есть качественный, признак. Такой признак можно рассматривать как фактор идентификации соответствующего ему гена, то есть как маркер самого гена [6].
Генетические маркеры играют исключительно важную роль в изучении наследственной конституции организма и особенно в оценке исходного и селекционного материала, поскольку облегчают контроль за включением желаемых и пежелаемых генетических факторов от родительских форм в создаваемые сорта и гибриды [15, 88].
Изначально для генетического маркирования использовались преимущественно морфологические признаки - форма органа, окраска, опушенность и так далее - как наиболее доступные экспериментатору. Но у сельскохозяйственных растений существует очень мало морфологических признаков, которые могут служить генетическими маркерами. Обычные генетические маркеры имеют малую информативность, в связи с тем, что почти все они представлены только двумя аллельными состояниями и не связаны с изменчивостью хозяйственно важных признаков. К тому же, преобладающая часть их нестабильна, так как зависит от условий развития организма. Маркирование биологических свойств и хозяйственных признаков растения - одна из главных практических задач, к решению которой должна стремиться биохимическая и молекулярная генетика как теоретическая основа современной селекции [13, 133].
"Маркерная технология" вошла в биологию довольно давно. На первых порах она опиралась на весь комплекс химических субстанций, вплоть до веществ вторичного происхождения. Наиболее же перспективным оказался анализ макромолекул белков и нуклеиновых кислот. Так называемое молекулярное маркирование основано на их полиморфизме. Подобный полиморфизм обнаружен физико-химическими методами при анализе масел, спиртов, органических кислот (что например используется в лихенологии), веществ вторичного происхождения. Однако этот полиморфизм из-за ряда принципиальных ограничений не получил широкого применения. В числе этих ограничений - наличие промежуточных этапов при реализации информации. Наиболее эффективными оказались молекулярные методы, позволившие создать тест-системы на уровне продуктов генов (белковых полиморфизм), а позднее на уровне генетического материала клетки (полиморфизм ДНК) [19, 134].
Типы ДНК-маркеров
Основные задачи в исследованиях полигенной основы реализации хозяйственно-ценных признаков сельскохозяйственных растений и животных связаны с необходимостью подбора оптимальных типов молекулярно-генетических маркеров (МГМ): 1) для идентификации сортов растений 2) для оценки их генеалогических связей; 3) для поиска МГМ, ассоциированных с селекционно-ценными признаками.
За последние годы накопилось большое количество данных об эффективности использования МГМ на уровне как белков, так и ДНК, РНК, для решения многих задач генетики, селекции, сохранения биологического разнообразия, изучения механизмов эволюции, картирования хромосом, а также для семеноводства [130]. Используемые маркеры должны обладать определенными свойствами и отвечать ряду требований: 1) доступность фенотипических проявлений аллельных вариантов для идентификации у разных особей; 2) отличимость аллельных замещений в одном локусе от таковых в других локусах; 3) доступность существенной части аллельных замещений в каждом изучаемом локусе для идентификации; 4) изучаемые локусы должны представлять случайную выборку генов в отношении их физиологических эффектов и степени изменчивости; 5) равномерность распределения по локализации в геноме; 6) легкая выявляемость, воспроизводимость и дешевизна; 7) возможность автоматизации выявления; 8) относительная нейтральность [63, 79].
Очевидно, что не существует такого стандартного набора маркеров, который отвечал бы всем этим требованиям и эффективность маркирования будет зависеть от используемого типа МГМ.
Несколько типов МГМ основаны на использовании явления полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Различия между индивидуумами по длине рестрикционных фрагментов обусловлено мутациями, которые приводят к появлению или исчезновению нового сайта рестрикции, и также мутациями, которые приводят к вставке или делеции блоков нуклеотидов, например, тандемно повторяющихся участков в некодирующих областях ДНК эукариот. Различия но длине рестрикционных фрагментов могут быть выявлены либо непосредственно с помощью гель-электрофореза (таксономический фингерпринт ДНК, таксонопринт), либо с помощью блот-гибридизации по Саузерну со специфическим меченным зондом (собственно метод ПДРФ и ДНК-фингерпринт) [131].
Хотя получаемые результаты в большинстве можно оценить высоко, непосредственное использование суммарной ДНК ставит ряд проблем. Первая - разное отношение сигнала к фону при ДНКазном расщеплении. Вторая — активность должна быть высока у равномерно меченых хромосомных зондов. Третья — при анализе лимитирующим фактором может стать количество геномной ДНК. А также то, что все эти методы очень чувствительны к реактивам и к оборудованию и требуют очень высокой квалификации персонала, что снижает повторяемость результата в различных лабораториях.
Второй подход к изучению полиморфизма ДНК, основанный полимеразной цепной реакции (ПЦР, polymerase chain reaction, PCR), позволяет избежать этих недостатков. Одними из наиболее удобных для картирования признаны STS-маркеры (sequenceagged site или "адресованная" ПЦР)- уникальные последовательности генома, выявляемые при помощи ПЦР. STS-маркеры получают следующим образом. Прежде всего определяют нуклеотидную последовательность небольших участков ДНК с известной локализацией на карте сцепления. Затем к этому участку подбирают пару праймеров с расстоянием между ними не менее 1 т.п.н., чтобы ПЦР проходила с высокой эффективностью. Выбранный участок ДНК и праймеры анализируют на наличие аналогов в базах данных, содержащих секвенированные на данный момент последовательности. При отсутствии аналогов проводят ПЦР с использованием в качестве матрицы геномной ДНК. Если в результате амплификации образуется один единственный фрагмент ДНК, то он может использоваться в качестве STS-маркера. Так, например, широко используется методика получения специфических последовательностей при помощи интер-Alu ПЦР. Этот метод основан на частой и статистически случайной встречаемости в геноме человека повторяющихся Alu-последовательностей. Семейство Alu последовательностей — одно из наиболее изученных семейств коротких диспергированных повторов (SINE, short interspersed repeats), названных так, потому что все они содержат сайт для эндонуклеазы Alul. Среднее расстояние между Alu-последовательностями оценивается в 5 т.п.н. Поскольку ПЦР в стандартных для большинства методик условиях проходит только при расстоянии между праймерами, не превышающем 1 — 2,5 т.п.н., лишь некоторые пары Alu-последовательностей амплифицируются. Тем не менее, подобные пары встречаются достаточно часто. Продукт интер-Alu ПЦР в большом проценте случаев содержит уникальный фрагмент геномной ДНК, что позволяет использовать его как специфический зонд или основу для создания STS-маркеров [130].
ДНК - полиморфизм может быть тестирован различными способами, включая прямое определение нуклеотидной последовательности ДНК. В настоящее время используют ряд приемов выявления полиморфизма различных участков геномной ДНК, сравнительное описание основных из них представлено ниже. I. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ, RFLP). RFLP-аллели при сцеплении с основными аллелями могут использоваться в качестве генетических маркеров, так как их наследование происходит по законам Менделя; RFLP не всегда приводит к фенотипическим изменениям и часто наблюдается в некодирующих областях ДНК [86].
Создание внутригенного маркера к гену устойчивости к пирикуляриозу риса Pi-ta
Для разработки дизайна праймеров при создании внутригенного ДНК-маркера использовали аминокислотные и нуклеотидны последовательности доминантной (источник - сорт Yashiro-mochi) и рецессивной (источник -сорт Tsuyake) аллелей гена Pia. Их номера в базе данных www.ncbi.nih.gov соответственно ААК00132 и АА045178 для аминокислотных последовательностей; AF207842 и AY196754 - для нуклеотидных последовательностей.
Из литературных данных известно, что устойчивый и чувствительный аллели гена Pia отличаются заменой 918 аминокислотного остатка серина на аланин. Для определения данной точки полиморфизма на кодирующей этот белок нуклеотидной последовательности аминокислотная последовательность была превращена в нуклеотидную с помощью программы «Конверсия ДНК/белок», предоставленной для свободного доступа на сайте "Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru. Затем было проведено сравнение полученных нуклеотидных последовательностей доминантных и рецессивных аллелей гена Pia, с использованием алгоритма «multiple alignment» в программе CLUSTALW. После определения точки полиморфизма были сконструированы два аллельспецифичных праймера, причем прямой праймер, специфичный для доминантной аллели, начинался с полиморфной точки, а обратный выбран с точки зрения методического удобства (завершается на GC, не образует «шпилек»). Затем было проведено сравнение «Поиск области генома» в системе поиска BLAST базы данных www.gramene.org, с полученных последовательностей праймеров, с использованием их нуклеотидной последовательности в качестве запроса поиска, чтобы исключить возможность амплификации неспецифичных зон ДНК с помощью этих праймеров [74].
На основе разработанного дизайна праймеров был сформирован заказ и праймерные пары, были синтезированы фирмой ЗАО «Синтол», Россия.
Созданный аллельспецифичный маркер для идентификации доминантной аллели целевого гена был назван нами ARRRIpiaR/piaL.
Был выполнен подбор условий ДНК амплификации. Изначально температура отжига праймера Pia была рассчитана по формуле С. W. Dieffenbach et al. (1995): Т = 4Cx(G + С) + 2Сх(А + Т)-3, где G, С, А, Т - количество гуанидиновых, цитозиновых, адениновых и тиминовых оснований соответственно. В дальнейшем эмпирически, путем градиента температур, подобрали оптимальную температуру. Первоначально при постановке ПЦР были проверены три различных температуры отжига: 55, 60 и 65С. Амплификация эффективно проходила при всех температурах отжига, но при 55 и 60С наблюдалось значительно большее присутствие неспецифически амплифицированных фрагментов, чем при 65С [47,104]. Чтобы убрать возможность ошибки (появления ПЦР-продукта у сорта, не несущего целевую аллель исследуемого гена и окончательного уменьшения неспецифически амплифицированных фрагментов были апробированы следующие температуры отжига: 68, 70 и 72С, причем температура отжига 72С является самой высокой из возможных для работы фермента Taq-полимеразы. Наименьшее количество неспецифически амплифицированных фрагментов было выявлено при 72С, что показано на рисунке 2. Также следует отметить, что праймерная пара ARRRIpiaR/piaL очень чувствительна к чистоте используемой в реакции ДНК и качеству Taq-полимеразы.
Для поиска источников гена устойчивости к пирикуляриозу риса Pia с использованием созданной маркерной системы ARRRIpiaR/piaL были взяты в коллекции исходного материала ВНИИ риса следующие сорта и сортообразцы: Кулон, Лидер, Кулон (2003), Спальчик, Фонтан, Нарцисс, Кубань 3, Снежинка, Дубовский, Курчанка, Краснодарский 3352, Снежинка, Лагуна, Спринт, Краснодарский 424, Водолей, Серпантин, Изумруд, КПК 17, Стрелец, Талисман, Аметист, ВНИИР 7887, Кубань 3, Виола, ВНИИР 8847, Раздольный, Рапан, Кендзо 3782, КП-27-02, КП-9-01, КП 37-01, КП 40-02, КП 27-02, К-0632, К-0636, К-0681, К-01939, К-02129, К-2131, К-02135, К-22258, К-02385, К-02397, К-02497, К-02503, К-2332, К-2742, К-2728, К-2744,
К-0681, Баллила, К-02980, К-03097, К-03524, К-03389, К-03695, К-03781, К-03782, К-02979, Азуцена, IR 36, К-3980, Рапан, Лиман, К1.
В качестве положительного контроля для анализа полиморфизма гена устойчивости Pia использован сорт К1, несущий доминантную аллель гена, а в качестве отрицательного - Nipponbare и С101А51, несущие рецессивную аллель гена Pia.
Выделение ДНК сортов риса. Первым этапом ПЦР-анализа является получение матрицы для реакции ДНК амплификации - выделение и очистка ДНК. При выполнении этой работы было испытано 3 различных метода выделения растительной ДНК. Для анализа использовали бесхлорофилльные семидневные проростки, получаемые путем инкубации во влажной камере: в стерильной чашке Петри, на увлажненной стерильной фильтровальной бумаге, в темноте, при температуре 25С.
Создание внутригенного ДНК маркера для гена устойчивости к пирикуляриозу риса Pi-ta
В виду сопряженной эволюции возбудителя Magnoporthe grisea (Herbert) Barr и поражаемого им растения Oryza sativa, изучение фитопатогена - важная составляющая часть селекционных программ, нацеленных на создание устойчивых к пирикуляриозу сортов риса. Генетическая паспортизация патогена в различных зонах рисосеяния , кроме того, имеет большое значение для изучения его мирового генетического многообразия, что является одной из ключевых задач совместных усилий ученых из международных исследовательских центров (CIRAD, IRRI, CDC). Мониторинг расового состава паразита в разных рисосеющих регионах мира необходим для разработки правильной селекционной стратегии в создании устойчивых сортов риса.
Стремительное развитие биотехнологии привело к появлению современных молекулярно-генетических методов исследования расового состава данного (как и многих других) патогена. В первую очередь - это возможность установления генетического родства между выделенными изолятами патогена на основе применения молекулярных маркеров, в том числе - и с изолятами с известными генами (а)вирулентности.
Кроме того, генетическая паспортизация изолятов патогена необходима при защите авторских прав держателей коллекций последнего.
В рамках данного исследования проведена генетическая паспортизация единственной в России коллекции патогена, держателем которой является
Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии. ДНК 59 изолятов коллекции с известными генами (а)вирулентности, охарактеризованных, кроме того, по комплексу культурально морфологических свойств, была любезно предоставлена нам для проведения молекулярного (микросателлитного) анализа сотрудниками лаборатории микологии и иммунитета ВНИИФ. Моноизоляты Кр-03-02 и Кр-03-01 (см. табл 3.2) выделены во ВНИИ риса в лаборатории биотехнологии из Краснодарской популяции патогена.
Высокий уровень полиморфизма, выявляемый SSR-маркерами, ко-доминантный характер их наследования, аллельспецифичность определяют ценность этой маркерной системы, позволяют говорить о возможности ее использования для оценки генетической изменчивости между изолятами Magnoporthe grisea (Herbert) Barr [57, 105].
Идентификация и паспортизация изолятов может выполняться на основании данных об аллельных состояниях использованных маркеров у каждого отдельно взятого изолята. В связи с этим для оценки степени генетического сходства среди избранных нами изолятов коллекции ВНИИ фитопатологии и составления их ДНК-фингерпринта было использовано 23 нейтральных, т.е. не сцепленных с каким-либо признаком, микросателлитных маркеров, отобранных, исходя из принципа максимального полиморфизма, на основе литературных данных [111]. От анализа двух маркеров отказались, в связи с тем, что они не показали полиморфизма на изучаемых изолятах. Как видно из табл. 3.4, маркеры проявили различный уровень полиморфизма: от двух до двенадцати аллелей на один микросателлитный локус с максимальным полиморфизмом по маркерам Pyrms 43 - 44, Pyrms 59 - 60, Pyrms 99 -100 и Pyrms 125 - 126.
