Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы
1.1 Полиморфизм генов молочных белков у крупного рогатого скота
1.2. Влияние полиморфизма молочных белков на молочную родуктивность и качество молока
1.3 Полиморфизм гена пролактина и его влияние на хозяйственно-полезные признаки
2 Материал и методы исследований
3 Результаты собственных исследований
3.1. Оценка полиморфизма гена каппа-казеина и гена пролактина с помощью ДНК-диагностики
3.1.1. Полиморфизм животных по гену каппа-казеина
3.1.2. Полиморфизм животных по гену пролактина
3.2. Влияние генотипа каппа-казеина на молочную продуктивность
3.3. Влияние генотипа пролактина на молочную продуктивность
3.4. Влияние комплексного генотипа по генам каппа-казеина и пролактина на молочную продуктивность коров
3.5. Технологические свойства молока коров с различными генотипами каппа-казеина
3.6. Воспроизводительная способность коров с различными генотипами каппа-казеина и пролактина.
3.7 Динамика живой массы телок с различными генотипами каппа-казеина и пролактина
Выводы
Пракические предложения
Список использованной литературы
- Влияние полиморфизма молочных белков на молочную родуктивность и качество молока
- Полиморфизм гена пролактина и его влияние на хозяйственно-полезные признаки
- Полиморфизм животных по гену пролактина
- Влияние генотипа пролактина на молочную продуктивность
Введение к работе
Актуальность. Успех селекционной работы в значительной степени зависит от точности определения племенной ценности животных. В связи с этим возрастает значение разработки методов, позволяющих более обоснованно и своевременно выявлять лучших животных, прогнозировать их племенные качества в раннем возрасте.
Достижения современной молекулярной генетики позволяют определять гены, контролирующие хозяйственно-полезные признаки. Среди множества таких генов можно выделить группу мажорных генов, вносящих наибольший вклад в формирование и функционирование хозяйственно-полезных признаков.
Современные ДНК-технологии позволяют идентифицировать генотипы молочных белков у производителей и молодняка, поэтому генотипы животных можно использовать в качестве генетических маркеров и путем отбора и подбора закреплять наиболее ценные из них для следующих поколений.
Известно, что при оценке коров значение имеет не только высокая молочность, но и качество молока, то есть содержание в нем жира, белка и других фракций. Селекция на жирномолочность - это норма отечественного скотоводства, селекции же на белковомолочность до сих пор уделяется мало внимания. В исследованиях ряда авторов показано, что белковомолочность находится в определенной зависимости от наследственных факторов -породной принадлежности, влияния быка-производителя и полиморфизма белков молока.
Большое внимание исследователей в последнее время привлекает локус гена каппа-казеина. Из всех аллельных вариантов каппа-казеина выделяют В-аллельный вариант, который ассоциируется с более высоким содержанием белка в молоке и более высоким выходом белковомолочных продуктов, а также лучшими коагуляционными свойствами молока. Возрастающее значение производства белковой продукции диктует необходимость использования генетических и селекционных методов для повышения экономической эффективности этого производства. В связи с этим предлагается считать генотип каппа-казеина экономически важным селекционным критерием для пород крупного рогатого скота, специализированных в молочном направлении продуктивности.
Пролактин - один из семейства белковых гормонов, которые принимают участие в инициации и поддержании лактации и могут рассматриваться как потенциальные генетические маркеры молочной продуктивности крупного рогатого скота. Однако сведения о полиморфизме гена пролактина, которые могли бы послужить основой для создания таких маркеров, крайне ограничены. Этот ген практически не исследовался как маркер молочной продуктивности.
Активное участие продуктов гена пролактина в формировании признака молочной продуктивности служит основанием для поиска значимых ассоциаций полиморфных вариантов с конкретными параметрами молочной продуктивности и создания на их основе тест-систем, пригодных для использования в генетико-селекционной работе.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы является изучение хозяйственно-полезных признаков коров черно-пестрой и красно-пестрой пород, имеющих различные генотипы по локусам генов каппа-казеина и пролактина.
В связи с этим поставлены следующие задачи:
• генотипировать животных по локусам генов каппа-казеина и пролактина методом ДНК-диагностики;
• определить частоту встречаемости аллельных вариантов и генотипов, генетическую структуру стад черно-пестрой и красно-пестрой породы по генам каппа-казеина и пролактина;
• оценить технологические свойства молока у коров черно-пестрой пород с различными генотипами каппа-казеина; • выявить особенности формирования молочной продуктивности у коров черно-пестрой и красно-пестрой пород с различными генотипами по локусам генов каппа-казеина и пролактина;
• изучить воспроизводительные качества коров черно-пестрой и красно-пестрой пород с различными генотипами по генам каппа-казеина и пролактина;
• провести анализ динамики живой массы телок с различными генотипами по генам каппа-казеина и пролактина.
Научная новизна. Получены новые данные по частоте встречаемости аллельных вариантов и генотипов каппа-казеина у крупного рогатого скота черно-пестрой и красно-пестрой пород российской селекции. Впервые в стадах животных черно-пестрой и красно-пестрой пород методом ПЦР-ПДРФ анализа геномной ДНК изучен полиморфизм и определена частота встречаемости аллельных вариантов и генотипов по гену пролактина. Установлены различия технологических свойств молока коров черно-пестрой породы с различными генотипами каппа-казеина. Дана оценка показателей молочной продуктивности, воспроизводительных качеств коров и динамики живой массы телок черно-пестрой и красно-пестрой пород с различными генотипами каппа-казеина и пролактина.
Практическая значимость. Проведенные исследования позволяют выявить возможности генетического совершенствования коров черно-пестрой и красно-пестрой пород в направлении повышения качества и технологических свойств молока. Показаны преимущества молока коров, несущих аллель В каппа-казеина, по содержанию белка и технологическим свойствам при приготовлении сыра. Накопление в стадах животных, несущих в своем геноме желательные аллельные варианты генов, приведет к увеличению производства белковомолочной продукции высокого качества.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были обсуждены:
- на конференциях молодых ученых МСХА, 2004 г., 2005 г.; - на международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», ВИЖ, 2004 г.;
Публикация результатов исследований. По результатам исследований опубликовано 11 научных работ.
Влияние полиморфизма молочных белков на молочную родуктивность и качество молока
Выход и качество молочных продуктов в значительной степени обусловлены качественным составом молочных белков. Интерес исследователей к изучению генетического полиморфизма белков молока связан прежде всего с тем, что различные аллельные варианты этих белков обусловливают хозяйственно ценные признаки и поэтому могут быть использованы в качестве их маркеров. Опыт многих стран свидетельствует о важности селекции коров по белковомолочности, так как это во многом определяет технологические свойства молока, его пищевую ценность. Поскольку полиморфные белки составляют значительную часть молочного белка, ряд авторов изучали их влияние на содержание общего белка в молоке и выявили различия между коровами, имеющими неодинаковые генетические типы белков. В этой связи было высказано предположение о зависимости белковомолочности от генотипа коров по полиморфным системам молока и возможности использования генетических типов молочных белков в селекции крупного рогатого скота (J.F. Medrano et al, 1990; СМ. Cowan et al, 1992; Л.С. Жебровский, 1977; P.A. Хаертдинов, 1988; B.E. Митютько,1990).
В исследованиях ряда авторов показано, что белковомолочность находится в определенной зависимости от полиморфизма гена каппа-казеина. На сегодняшний день можно утверждать, что качество молока и возможность его использования в сыроварении в значительной степени зависят от аллельных вариантов каппа-казеина (D.V. Мс Lean et al, 1984; J. Schaar, 1984; J. Schaar, 1985; G. Pagnacco, F. Caroli, 1987). Связь генотипических вариантов каппа-казеина с качественными и технологическими показателями молока выявлена у всех исследованных пород крупного рогатого скота.
Каппа-казеин представляет собой единственный компонент казеина, на который действует сычужный фермент. Это свойство каппа-казеина используется для получения сырной и творожной массы. Расщепление в молекуле каппа-казеина пептидной связи Phe (105) - Met (106), имеющей повышенную чувствительность к действию протеиназ, приводит к разрушению мицеллярной структуры казеинового комплекса и створаживанию казеинов.
Из всех известных вариантов каппа-казеина А и В генетические варианты наиболее распространены. Исследования связи аллельных вариантов гена каппа-казеина и качества молока показали, что молоко, содержащее В-аллельный вариант каппа-казеина, ассоциируется с более высоким содержанием белка в молоке и более высоким выходом творога и сыра, а также лучшими коагуляционными свойствами молока (J. Schaar, 1985; Н. Graven, 1990).
Более того, G.E. Vagerud с соавторами (1992) показали, что молоко от коров с генотипом АВ или ВВ каппа-казеина имело лучший вкус, хранилось на 5 дней дольше, имело более короткое время свертывания и более плотный сгусток, чем молоко от коров с генотипом АА.
К. Pabst (1992) при изучении 5000 коров голштинской и англерской породы установил, что хотя содержание белка в перерабатываемом молоке было более низким у коров с генотипом ВВ (3.70 против 3.95 для АА), содержание белка в зрелом сыре были одинаковым. Использование белка при приготовлении сыра было на 2.7% лучше для молока коров с генотипом ВВ.
В то же время I.L.L. Мао с соавторами (1992) на относительно большой группе 11015 коров голштинской породы показали, что В-аллель каппа-казеина было достоверно более благоприятен для более высокого выхода молока и белка, а также связан с повышенным процентным содержанием белка в молоке.
A Van Eenennaam, J.F. Medrano (1991), нашли, что В-аллель каппа-казеина присутствует в большем количестве в молоке коров с генотипом АВ. Причина влияния на количественное выражение аллельных вариантов не вполне понятна и может определяться различием последовательностей некоторых факторов транскрипции с разной степенью гомологии. В пределах этих последовательностей были найдены точковые мутации (Т.А. Schild, et al, 1994, S. Kaminski, 1995).
Полиморфизм гена пролактина и его влияние на хозяйственно-полезные признаки
Пролактин (PRL, лактогеный гормон, маммотропин, лютеотропный гормон), гормон роста (GH), и хорионический соматомаммотропин (плацентарный лактоген, PL) представляют собой семейство белковых гормонов, обладающих значительной гомологией последовательностей. Их молекулы у разных видов насчитывают 190-199 аминокислотных остатков. Гомология аминокислотных последовательностей GH и PRL человека - 35%. Все три гормона имеют общие антигенные детерминанты и оказывают сходное действие: обладают рост-стимулирующей и лактогенной активностью.
Пролактин продуцируется передней долей гипофиза и принимает участие в регуляции лактации. Пролактин - белковый гормон с молекулярной массой около 23000 дальтон. секретируется лактотрофами -ацидофильными клетками передней доли гипофиза. Подобно другим родственным гормонам (гормону роста и плацентарному лактогену) Пролактин синтезируется в виде предшественника - препролактина, отличающегося от зрелого гормона наличием N-концевого сигнального пептида, отщепляющегося во время секреции полипептида в кровь. Уровень пролактина возрастает на поздних сроках беременности и при лактации.
X. Сао и др. (2002) выделили ген пролактина крупного рогатого скота и подробно описали его структуру. Ген пролактина имеет размер 9388 п.о. и состоит из 5 экзонов и 4 интронов.
Хотя пролактин первоначально был идентифицирован как лактотропный гормон, секретируемый гипофизом, к настоящему времени накоплено много данных о разнообразии физиологических функций пролактина, включая осморегуляцию, репродукцию, поведенческие реакции (N. Ben-Jonathan et al,1996, С. Bole-Feysot et al,1998). Было показано также, что пролактин синтезируется в различных тканях, включая эндотелиальные и иммунные клетки, нейроны и др. (С. Clapp et al, 1998 , N. Ben-Jonathan et al, 1996). Более того, участие пролактина в регуляции иммунного ответа привело к созданию концепции о двойной функциональной роли пролактина — как гормона и как цитокина (N. Ben-Jonathan et al, 1996).
Пролактин участвует в инициации и поддержании лактации у млекопитающих (R.M. Akers et al, 1981). Многие биологические функции, такие, например, как экспрессия генов казеинов, осуществляются через рецепторы пролактина (L. Hennighausen et al, 1997). Активирование транскрипции генов белков молока включает олигомеризацию рецептора и активацию киназы Jak2, которая фосфорилирует остатки тирозина у рецепторов сигнальных трансдукторов и активаторов транскрипции Stat5a and Stat5b (L. Hennighausen et al, 1997; V. Goffm et al, 1997; H. Seyfert et al, 2000). Сигнальные трансдукторы и активаторы транскрипции (STATs) представляют собой семейство из 7 транскрипционных факторов (J.E. Darnell et al, 1994, С. Schindler et al, 1995). STATs также известны как главные медиаторы действия гормона роста и пролактина на гены, находящиеся под их коїггролем (L.S. Argetsinger et al, 1996; E. Antoniou et al. 1999; K. Flisikowski et al,2003).
Молекулярные события, которые индуцируются пролактином, до сих пор мало изучены. Известно, что через несколько минут после добавления пролактина происходит высвобождение арахидоновой кислоты (F. Blachier et al, 1988). Добавление арахидоновой кислоты в инкубационную среду с трансплантатами эпителиальных клеток лактирующеи молочной железы приводит к стимуляции синтеза казеинов. По-видимому, пролактин стимулирует секрецию казеинов через арахидоновую кислоту. По контрасту с гормонами, которые быстро деградируют в лизосомах (J.W. Burgess et al, 1992), пролактин остается в молоке не только в расщепленной, но и в интактной форме (Y.N. Sinha, 1995; М. Lkhider et al, 2001). Пролактин транспортируется через везикулярный путь, который включает не только эндосомы, поздние эндосомы и мультивезикулярные тельца, но также везикулы, локализованные в области аппарата Гольджи, и секреторные везикулы, содержащие казеиновые мицеллы (М. Ollivier-Bousquet, 1998). Возможно, это необходимо для разделения пролактин-индуцированных воздействий, которые зависят (сигнал к секреции белков молока) или не зависят (сигнал к экспрессии генов белков молока) от интеграции в аппарат Гольджи. Эти данные подтверждают гипотезу, что пролактиновые сигналы могут восприниматься различными клеточными сайтами (М. Lkhider et al, 2001).
На основе сходства GH, PRL (А.В. Dietz et al,1992) и PL несколько лет назад была высказана гипотеза, согласно которой гены, детерминирующие синтез этих гормонов, возникли в результате дупликации одного гена-предшественника (H.D. Niall et al, 1971). Единственный ген пролактина, кодирующий очень сходный белок, по размеру в 5 раз превосходит гены GH и PL. Ген пролактина у крупного рогатого скота (bPRL) имеет протяженность 10 т.п.н. (S.A. Camper et al, 1984; J.H. Woichik et al,1982).
У крупного рогатого скота ген пролактин локализован в области q21 хромосомы 23 и тесно сцеплен с генами класса I и класса II главного комплекса гистосовместимости (A. Xu, Н.А Lewin, 1991; А.В. Dietz et al, 1992,1997). Наиболее тесное сцепление отмечено между генами пролактина и BoLA-DRB3 (А.В. Dietz et al, 1992; Н.А. Lewin et al, 1992; MJ. Van Eijk et al, 1995). В тканях крупного рогатого скота на гаплоидный геном приходится по одной копии генов GH и PRL (S.A. Camper et al, 1984).
Полиморфизм животных по гену пролактина
В связи с возросшими требованиями рынка к качеству молочной продукции, в частности к количеству и составу молочного белка, а так же к сыродельческим характеристикам молока, возникает насущная необходимость в выявлении и использовании в селекции генетических маркеров, напрямую или косвенно связанных с качественными и количественными признаками молочной продуктивности.
Аллельные варианты генов белков молока являются важнейшими маркерами молочной продуктивности крупного рогатого скота (Н. Gravert, 1990). Наиболее изученным является локус каппа-казеина, в котором десять аллелей. Генетические варианты А и В аллелей наиболее распространены (Grosclaude F. et al, 1972). Они различаются двумя аминокислотными заменами (Thr 136-»Iso и Asp 148- А1а) и вызваны соответствующими точковыми мутациями в позициях 5309 (С-»Т) и 5345 (L.J. Alexander, et al, 1988; Vaiman et al, 1994) в нуклеотидной последовательности.
В данной работе проведено исследование крупного рогатого скота черно-пестрой породы в Центральной зоне (Московской области) и красно-пестрой породы в Центрально-Черноземной зоне разведения скота (Воронежская область) по выявлению в геноме аллельных вариантов генов А и В, связанных с качеством молока.
Были взяты пробы крови от 72 нетелей черно-пестрой породы в СХПК колхозе-племзаводе им М. Горького Ленинского района Московской области и от 126 коров красно-пестрой породы в племзаводе «Дружба» Павловского района Воронежской области. Из крови были выделены и очищены препараты ДНК.
Исходя из наличия и локализации точковых мутаций, определяющих принадлежность к различным аллельным вариантам, нами были использованы два олигонуклеотидных праймера: Bocas А и Bocas В.
С помощью ПЦР была проведена амплификация проб ДНК. При ПЦР происходит амплификация фрагмента ДНК, ограниченного с концов праймерами, которые отжигаются на противоположных цепях ДНК.
Праймеры Bocas А и Bocas В синтезированы на основе нуклеотидной последовательности ДНК гена каппа-казеина крупного рогатого скота. Они гомологичны высококонсервативным зонам гена каппа-казеина. В результате проведения полимеразной цепной реакции с праймерами Bocas А и Bocas В амплифицировался фрагмент гена каппа-казеина, содержащий мутацию, длиной 530 п.н. (L. J. Alexander et al. 1988). Данные проведённого анализа 168 проб ДНК указывают на идентичность длин полученных амплификатов (530 п.н.) во всех образцах, их гомогенность и высокую специфичность.
После амплификации была проведена рестрикция. Для рестрикционного анализа полученного фрагмента гена использовали эндонуклеазу Hindlll. Эндонуклеаза Hindlll распознаёт последовательность из шести нуклеотидов A/AGCTT. Согласно нуклеотидной последовательности гена в аллельном варианте А отсутствуют сайты рестрикции Hindlll, а в аллельном варианте В присутствуют сайты узнавания рестриктаз. Эндонуклеаза Hindlll расщепляет аллель В гена каппа-казеина на два фрагмента длиной 400 и 130 п.н. Характеристика фрагментов рестрикции Hindlll аллельных вариантов гена каппа-казеина приведена в таблице 2.
Влияние генотипа пролактина на молочную продуктивность
Успех в развитии молочного скотоводства во многом определяется интенсивностью воспроизводства стада, которое оказывает прямое влияние на производство молока и темпы реализации генетического потенциала продуктивности. Воспроизводство является основным фактором повышения молочной продуктивности стада и главным биологическим условием, лимитирующим рост поголовья.
Проблема повышения воспроизводительной способности животных остаётся одной из самых сложных, особенно в связи с концентрацией поголовья и внедрением промышленной технологии производства молока.
В связи с этим стабилизации показателей воспроизводительной способности коров придаётся большое значение. В то же время к факторам, снижающим плодовитость коров, можно отнести: большую концентрацию поголовья, стойловое содержание и отсутствие активного моциона, неподготовленность нетелей к отёлу. Каждый из этих факторов оказывает отрицательное влияние на воспроизводительную способность коров, суммарное же их действие может привести к снижению оплодотворяемости, увеличению межотельного периода, сокращению выхода телят и молочной продуктивности и, как следствие, к преждевременному выбытию из стада.
Изменчивость воспроизводительной способности коров в основном определяется средовыми факторами к которым молено отнести: условия содержания, кормления, микроклимат, а также живую массу и комплекс организационно-хозяйственных мероприятий.
Воспроизводительная способность коров складывается из относительно независимых признаков: возраст физиологической и хозяйственной зрелости, количество отёлов, продолжительности межотельного периода, сервис-периода, эмбриональной и постэмбриональной жизнеспособности. Каждый из перечисленных факторов формируется в результате реализации генотипа в конкретных условиях среды.
Возраст первого отёла в большей степени зависит от ростовых показателей, в том числе от живой массы, т. е. от хозяйственной зрелости животного и соответствии живой массы средне-породным требованиям.
Интервал между нормальными отёлами (МОП) является одним из важных факторов, определяющих экономическую эффективность молочного стада. В идеале он должен быть равен одному календарному году. Интервал между отёлами определяется продолжительностью стельности и сервис-периода.
Интегральным показателем плодовитости коров является индекс воспроизводительной способности (КВС), который определяется отношением количества дней календарного года к межотельному периоду. Оптимальным считается КВС = 1. При показателях КВС меньше единицы корова считается проблемной. Для оценки воспроизводительной способности коров-первотёлок используется формула Дохи. Согласно индексу Дохи плодовитость первотёлок считается хорошей, если он более 48, средней - от 41 - 48, ниже 41 - плохой показатель плодовитости.
Нами проведён анализ воспроизводительной способности коров черно-пестрой и красно-пестрой пород с разными генотипами по гену капп-казеина и пролактина.
Анализ таблицы 22 показывает, что при сравнительном изучении возраста первого отёла коровы красно-пестрой породы с гомозиготным генотипом каппа-казеина ВВ имеют более высокие показатели признака, чем гетерозиготные АВ и гомозиготные АА.
В анализируемых группах выявлена недостоверная разница между группами по продолжительности сервис-периода. Установлена более короткая продолжительность сервис-периода, сухостойного и межотельного периода, у гомозиготных коров с генотипом ВВ в сравнении с генотипами АА и АВ.
