Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Мастит крупного рогатого скота 10
1.2. Резистентность и механизмы ее развития 17
1.3. Фторхинолоны 29
1.4. Кетопрофен 42
2. Собственные исследования 48
2.1. Материалы и методы 48
2.2. Результаты исследований 67
2.3. Результаты изучения антибактериальной активности энрофлоксацина 67
2.4. Результаты изучения острой токсичности противомаститного препарата в опытах на лабораторных животных 77
2.5. Результаты изучения субхронической токсичности противомаститного препарата в опытах на лабораторных животных 79
2.6. Результаты изучения местно-раздражающего действия на паренхиму вымени после однократного и многократного интрацистернального введения противомаститного препарата 82
2.7. Результаты изучения фармакокинетики энрофлоксацина, ципрофлоксацина и кетопрофена в молоке и плазме крови коров 86
2.8. Результаты определения остаточных количеств энрофлоксацина, ципрофлоксацина и кетопрофена в молоке коров после многократного введения противомаститного препарата 90
2.9. Результаты определения оптимальной дозы противомаститного препарата 92
2.10. Результаты изучения терапевтической эффективности противомаститного препарата в условиях производства 93
3. Обсуждение результатов 99
Выводы 128
Практические предложения 130
Список литературы 131
Приложение а 156
Приложение б 163
- Резистентность и механизмы ее развития
- Фторхинолоны
- Результаты изучения антибактериальной активности энрофлоксацина
- Результаты изучения фармакокинетики энрофлоксацина, ципрофлоксацина и кетопрофена в молоке и плазме крови коров
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Анализ структуры заболеваний крупного рогатого скота в молочном скотоводстве показывает, что развитию отрасли существенно препятствуют инфекционные и незаразные болезни лактирующих коров, среди которых наиболее серьёзный ущерб наносит мастит. (Роман Л. Г., Полянцев Н. И., 2008; Слободняк, В.И. , 1999)
Экономический ущерб, связанный с маститом, складывается из снижения удоев и качества молока, потери молочной продуктивности и преждевременной выбраковки коров до завершения генетически заложенного лактационного периода. (Слободняк, В.И.,1999; Кузьмин Г. Н., 1995; Tollersrud T., Kenny K., Reitz Jr. A.J. and Lee J.C., 2000). Помимо экономического ущерба, мастит представляет серьезную опасность для здоровья людей, в связи с возможным попаданием в молоко патогенных для человека микроорганизмов и их токсинов (Модин А. Н., Климов Н. Т., Ефанова Л. И., 2010). Предрасполагающими факторами развития мастита являются нарушение условий содержания, кормления и доения, а также гинекологические заболевания и изменение обмена веществ, что в комплексе снижает общую резистентность организма и способствует ослаблению барьерной функции тканей вымени. На этом фоне создаются благоприятные условия для внедрения и распространения патогенных и условно-патогенных микроорганизмов в паренхиме вымени, что вызывает воспаление молочной железы – мастит.
Наиболее что при маститах выделяют монокультуры или ассоциации микроорганизмов, таких как стрептококки – Str. agalactiae, Str. dysgalactiae, Str. pyogenes, Str. uberis; стафилококки — Staph. pyogenes aureus, Staph. citreus, Staph. Albus, а также Escherichia coli и Pseudomonas aerugenosa ( Jones G.M., Bailey T.L., Roberson J.R.,1998).
Несмотря на большое количество, используемых противомаститных препаратов, их эффективность постоянно снижается, вследствие широкого распространения антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов. Поэтому разработка новых противомаститных препаратов активных в отношении устойчивых к антибиотикам патогенов продолжает оставаться актуальной и важной для ветеринарной практики проблемой (Париков В.А., Климов Н.Т., Романенко А.И., 2000).
Одним из путей воздействия на антибиотикорезистентные микроорганизмы является применение новых соединений, к которым у бактерий еще не сформировались механизмы устойчивости. К таким соединениям относятся фторхинолоны, механизм действия которых заключается в ингибировании активности ферментов ДНК-гиразы и топоизомеразы IV, приводящей к нарушению синтеза ДНК бактериальной клетки, что обеспечивает отсутствие перекрестной резистентности с другими антибактериальными соединениями, сульфаниламидами и нитрофуранами (Altreuhter P., 1987; Anadon A., 1992).
Поэтому на основании собственных исследований и литературных данных в качестве антибактериального компонента в состав нового противомаститного препарата был включен энрофлоксацин из группы фторхинолонов, ранее не использовавшийся в лекарственных средствах для интрацистернального введения при лечении мастита. Энрофлосацин обладает широким спектром действия в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, хорошей биодоступностью из места введения, а также малотоксичен для теплокровных животных. (Kanemaki N., Matsuura K., Yashiro N., Takasu K., Ushuruda H., 1995; Abd el-Aziz M.I., Aziz M.A., Soliman F.A., Afify N.A., 1997).
Хотя основным этиотропным фактором в развитии мастита являются инфекционные агенты, патогенез болезни во многом основан на развитии воспалительных процессов в паренхиме вымени, приводящих к появлению боли и отеков, что осложняет течение болезни и увеличивает сроки выздоровления.
Поэтому важной составляющей успешной терапии мастита, помимо этиотропного компонента, воздействующего на причину болезни – микроорганизмы, является применение фармакологических средств, обладающих противовоспалительным действием и снижающих болевую реакцию, то есть, воздействующих на патогенез и симптомы заболевания (Anderson K.L., Kindahl H., Petroni A., Smith A.R., Gustafsson B.K.,1985). Применяемые в противомаститных препаратах глюкокортикоиды (преднизолон, дексаметазон), несмотря на выраженный противовоспалительный эффект, обладают рядом нежелательных побочных реакций, например, таких как снижение местного иммунитета. Поэтому в последнее время широкое применение в медицине и ветеринарии нашли нестероидные противовоспалительные соединения (НПВС), которые обладают выраженным противовоспалительным, анальгезирующим и жаропонижающим действием, при этом практически не оказывают побочного действия на макроорганизм. Среди НПВС одним из наиболее сильных обезболивающих соединений является кетопрофен, широко применяемый у нас в стране и за рубежом в различных лекарственных формах. Поэтому в качестве противовоспалительного компонента в состав нового противомаститного препарата дополнительно был включен кетопрофен.
Учитывая, что до настоящего времени в зарубежной и отечественной ветеринарной практике лекарственный препарат для интрацистернального введения на основе энрофлоксацина с кетопрофеном не использовался, представлялось актуальным изучить его фармако-токсикологические свойства и терапевтическую эффективность при лечении мастита бактериальной этиологии у лактирующих коров.
Цели и задачи исследований.
Изучить фармако-токсикологические свойства и терапевтическую эффективность нового лекарственного препарата для интрацистернального введения на основе энрофлоксацина и кетопрофена при лечении мастита у лактирующих коров.
В задачи исследований входило:
- определить антибактериальную активность энрофлоксацина в опытах in vitro на изолятах микроорганизмов, выделенных из молока коров больных маститом, в сравнении с другими группами антибактериальных средств, широко используемыми при лечении мастита у коров;
- изучить фармако-токсикологические свойства лекарственного препарата на основе энрофлоксацина и кетопрофена на лабораторных животных;
- изучить раздражающее действие на паренхиму вымени лекарственного препарата для интрацистернального введения на основе энрофлоксацина и кетопрофена;
- изучить фармакокинетику и установить сроки выведения остаточных количеств энрофлоксацина, ципрофлоксацина и кетопрофена с молоком лактирующих коров после интрацистернального введения лекарственного препарата;
- установить оптимальную терапевтическую дозу и разработать схему применения лекарственного препарата на основе энрофлоксацина и кетопрофена для лечения мастита бактериальной этиологии у коров в период лактации;
- оценить терапевтическую эффективность и безопасность применения лекарственного препарата на основе энрофлоксацина и кетопрофена при мастите дойных коров в условиях производства.
Научная новизна.
Впервые изучены фармако-токсикологические свойства нового лекарственного препарата на основе энрофлоксацина и кетопрофена для интрацистернального введения. Установлены особенности распределения, накопления в тканях паренхимы вымени и сроки выведения остаточных количеств кетопрофена, энрофлоксацина и его метаболита ципрофлоксацина с молоком. В условиях животноводческих хозяйств обоснована эффективность применения противомаститного препарата в ветеринарной практике.
Практическая значимость работы.
На основании результатов исследований доказана возможность безопасного и эффективного использования лекарственного препарата для интрацистернального введения на основе энрофлоксацина и кетопрофена в ветеринарной практике. Экспериментально обоснованы оптимальная терапевтическая доза (300 мг энрофлоксацина и 50 мг кетопрофена в шприце-дозаторе 7,5 мл), схема применения (трехкратно с интервалом 12 ч) и сроки возможного использования молока (через 1 сутки) в пищевых целях после интрацистернального введения препарата дойным коровам.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на:
- IV съезде ветеринарных фармакологов и токсикологов России «Актуальные вопросы ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации» Москва, 2013 г.;
- Заседании ученого совета ФГБУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» в 2012, 2013 гг.
Личный вклад соискателя.
Диссертационная работа является результатом научной работы в период с 2009 по 2013 гг. Основной объем исследований проведен автором самостоятельно и выполнен при научно-методической и консультационной помощи кандидата ветеринарных наук Б.В. Виолина.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
- результаты изучения антибактериальной активности энрофлоксацина;
- характеристика фармако-токсикологических свойств лекарственного препарата для интрацистернального введения по результатам доклинических исследований;
- результаты изучения фармакокинетики и динамики выведения остаточных количеств кетопрофена, энрофлоксацина и ципрофлоксацина с молоком коров после интрацистернального введения нового противомаститного препарата;
- результаты клинических исследований лекарственного препарата на основе энрофлоксацина и кетопрофена при лечении мастита коров в условиях производства;
- практические предложения по применению лекарственного препарата на основе энрофлоксацина и кетопрофена в ветеринарной практике.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, 4 из них в изданиях, рекомендованных ВАК России.
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 173 листах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы, приложение. Работа иллюстрирована 33 таблицами, 8 рисунками, 6 графиками. Список литературы содержит 292 источников, в том числе 187 иностранных.
Резистентность и механизмы ее развития
В настоящее время применение антибактериальных средств в животноводстве достигло высокого уровня. Все чаще такие препараты используются не для лечения, а для профилактики заболеваний. В связи с чем огромное количество здоровых животных систематически подвергаются обработке антибактериальными веществами, что в свою очередь создает благоприятную обстановку для появления, развития, распространения и сохранения резистентных бактерий, которые могут вызывать инфекционные заболевания у животных и человека (6).
Под резистентностью (устойчивостью) понимают способность микроорганизма переносить значительно большие концентрации препарата, чем остальные микроорганизмы данного штамма (вида), или развиваться при таких концентрациях, которые превышают достигаемые в макроорганизме при введении антибактериальных препаратов в терапевтических дозах (30). Механизм действия антибактериальных соединений (АБС) направлен на угнетение более или менее специфичного для микроорганизмов (прокариот) метаболического процесса, что происходит в результате связывания АБС с определенной мишенью, в качестве которой может выступать либо фермент, либо структурная молекула микроорганизма. В связи с этим АБС подавляют жизнедеятельность микроорганизмов в концентрациях, не наносящих или наносящих минимальный вред эукариотическим клеткам макроорганизма (273, 286). Резистентность микроорганизмов к АБС может быть природной и приобретенной. Актуальной проблемой является приобретенная резистентность, характеризующаяся устойчивостью отдельных штаммов бактерий сохранять жизнеспособность при концентрациях антибиотиков, подавляющих основную часть микробной популяции (73, 274, 292). Развитие резистетности у микроорганизмов происходит, как правило, в результате спонтанных хромосомных мутаций генома бактериальной клетки, что не связано с направленным действием на ДНК бактерии 8 антибактериальных препаратов, которые играют роль лишь селективных агентов. В результате воздействия антимикробных препаратов на популяцию основная масса бактериальных клеток гибнет (если антибиотик обладает бактерицидным действием) или прекращает развитие (если антибиотик обладает бактериостатическим действием), при этом микроорганизмы, оказавшиеся устойчивыми, сохраняются, приобретают конкурентное преимущество в борьбе за питательные вещества, размножаются и распространяются в окружающей среде. В дальнейшем приобретенная резистентность закрепляется и передается по наследству последующим генерациям бактерий. Таким образом, происходит селекция устойчивых микроорганизмов под воздействием антибиотиков. Поэтому устойчивость наиболее часто встречается к антибактериальным средствам, которые применяются длительное время, например, к пенициллинам, тетрациклинам, хлорамфениколу (229, 275).
Также развитие резистентности может происходить вследствие процесса адаптации (приспособления) микроорганизма к «вредному» воздействию антибиотического вещества. При этом в некоторых случаях наблюдается замена одних звеньев обмена веществ, другими, не подверженными действию препарата, или микроорганизмы начинают усиленно вырабатывать соединения, разрушающие молекулу антибиотика, тем самым нейтрализуя его действие. Например, ряд штаммов стафилококков и спороносных бактерий образуют фермент пенициллиназу, разрушающий пенициллин с образованием продуктов, не обладающих антибиотической активностью. Это явление называется энзиматической инактивацией антибиотиков (58, 229, 275). Другим путем распространения генов резистентности являются внехромосомные факторы устойчивости, к которым относятся плазмиды и транспозонные элементы. Плазмиды – представляют собой стабильно существующие внехромосомные элементы в виде ковалентнозамкнутых колец ДНК, 9 способных самостоятельно реплицироваться в бактериальной клетке. При этом в одной бактериальной клетке одновременно могут находиться плазмиды, отвечающие за разные свойства микроорганизма, например, за токсичность и резистентность (58, 275). Конъюгирующие плазмиды, такие как плазмиды резистентности R, в своем составе содержат два компонента — r-фактор, отвечающий за резистентность к антибиотикам и фактор переноса устойчивости RTF, основной фукнцией которого является обеспечение передачи генетической информации. Иногда r-факторы (неконъюгирующие плазмиды) могут самостоятельно существовать в бактериальных клетках. При этом межбактериальное перемещение таких r-факторов происходит в результате их коинтеграции с конъюгирующими плазмидами. Такая плазмида может содержать 10 и более детерминант устойчивости к различным антибактериальным веществам (275). Плазмидам присущ «плейотропный эффект», заключающийся в способности плазмид оказывать влияние на многие свойства бактерий, в частности, на чувствительность к различным фагам, скорость размножения, чувствительность к лизису детергентами и так далее. В основе этого эффекта лежат изменения поверхностных слоев клеточной стенки под влиянием плазмид (7, 58). Способность плазмид циркулировать от животных к животным, от животных к человеку и от человека к животным способствует быстрому распространению резистентности микроорганизмов к антибактериальным соединениям и обуславливает их важную роль в эволюции этих организмов. Транспозонные элементы – это фрагменты ДНК, которые свободно перемещаются от одного репликона к другому. Транспозоны, определяя разные фенотипические признаки бактериальной клетки, в том числе и резистентность к антибактериальным препаратам, могут содействовать тем самым переносу детерминант резистентности к антибиотикам между хромосомой, плазмидами и фагами. 0
Наряду с этим они не подчиняются rec-системам клетки, тем самым передача хромосомных маркеров между неродственными видами ничем не ограничивается. Ввиду того, что в состав транспозонов входят детерминанты устойчивости и при постоянно действующем в условиях производства селективном давлении антибактериальных препаратов на бактериальные популяции, возможно образование гибридных плазмид, обусловливающих новые комбинации устойчивости к химиотерапевтическим веществам (58). Транспозоны способны перемещаться не только в пределах одного вида, но также попадать в новые виды и роды микробов. Было установлено, что транспозоны Т1699 и Т1700, локализованные в неконъюгативных плазмидах S. marcescens, первоначально проникая в конъюгативную плазмиду этого вида, перемещаются в другие роды семейства Enterobacteriaceae (275, 289). Для распространения резистентности среди микроорганизмов к антибактериальным соединениям решающее значение имеет локализация кодирующих генов (плазмидная или хромосомная). При плазмидной локализации генов происходит быстрое внутри - и межвидовое распространение резистентности, при хромосомной – наблюдают распространение резистентного клона (34). Устойчивость микроорганизмов к антибактериальным препаратам в случае как плазмидной, так и хромосомной локализации детерминант резистентности может быть обусловлена несколькими механизмами: 1.Модификация чувствительной мишени. В ходе эволюционного процесса в результате естественных мутаций в кодирующих генах, возможно снижение или утрата способности специфических рецепторов к связыванию с антибактериальными препаратами. В результате чего антибиотик, проникший в клетку, не может блокировать биохимические процессы (72, 292).
Фторхинолоны
Класс хинолонов включает две основные группы препаратов, принципиально различающихся по структуре, активности, фармакокинетике и широте спектра антибактериальной активности: нефторированные хинолоны и фторхинолоны. В настоящее время все известные фторхинолоны имеют одинаковую структуру:
Общими структурными признаками всех фторхинолонов является оксогруппа в позиции 4, кислотная функциональная группа в позиции 3, атом фтора в позиции 6, а также по одному заместителю в 1-м и 7-м положениях. Фтор в позиции 6 отличает фторхинолоны от хинолонов и обуславливает более широкий спектр активности и эффективность. Некоторые из фторхинолонов имеют также замещения в 5-й и 8-й позициях основной структуры хинолона. При этом замещение в N-1 обязательно для антибактериальной активности молекулы. Оптимальным является циклопропиловый остаток, который (за исключением левофлоксацина) имеется во всех новых фторхинолонах. Замещение в С-5 основной структуры хинолона в значительной степени определяет активность молекулы в отношении грамотрицательных бактерий и хламидий. 0 Хинолоны классифицируют по времени введения в практику новых препаратов с улучшенными антимикробными свойствами. Различные химические замещения и боковые группы обуславливают разнообразные свойства представителей разных групп, такие как липофильность, объем распределения, биодоступность и скорость выведения, при этом антибактериальная активность разных фторхинолонов принципиально не отличается. Согласно рабочей классификации, предложенной R. Quintiliani (1999), хинолоны разделяют на четыре поколения. Хинолоны I поколения преимущественно активны в отношении грамотрицательных микроорганизмов, и при этом не создают высоких концентраций в крови и тканях. Одним из первых представителей этого поколения является налидиксовая кислота (группа нафталидин-карбоновых кислот), полученная еще в 1962 г. и до сих пор применяемая в урологической практике. Синтезированные в 70-е годы оксолиновая кислота и циноксацин, так же применяются в урологии. Из-за невозможности создания эффективных и безопасных концентраций во внутренних органах, использование хинолонов первого поколения ограниченно. В основном их применяют при лечении неосложненных инфекций мочевыводящих путей. Недостатком представителей этого поколения фторхинолонов является быстрое развитие к ним резистентности у микроорганизмов (39, 54, 164, 201, 268).
Фторхинолоны II поколения разрешены для клинического применения с начала 80-х годов и отличаются широким спектром антимикробного действия, высокой бактерицидной активностью и хорошей фармакокинетикой, что позволяет применять их для лечения инфекций различной этиологии и локализации, в том числе осложненных инфекций мочевых путей и пиелонефритов, респираторных, желудочно-кишечных и кожных инфекций (240, 243). Фторхинолоны II поколения, характеризуются более высокой активностью в отношении грамположительных бактерий 1 (прежде всего пневмококков и анаэробов), а также внутриклеточных патогенов, в том числе микоплазм. Соединения, относящиеся к III поколению, содержат в положении 7 хинолонового ядра незамещенный или замещенный пиперазиновый цикл, а в положении 6 – атом фтора (41, 154, 201). По широте спектра действия и антибактериальной активности их можно сравнить только с бета-лактамами третьего и четвертого поколения (94, 182, 196, 240). Тровафлоксацин, в настоящее время является единственным представителем 4 поколения фторхинолонов и обладает более выраженной антимикробной активностью в отношении анаэробов, но в отношении грамположительных и грамотрицательных не отличается от фторхинолонов третьего поколения. Его активность в отношении Pseudomonas spp., сопоставима с ципрофлоксацином (8, 63, 101, 117, 133, 149, 183, 193, 253, 290). Все фторхинолоны хорошо всасываются при приеме внутрь, достигая максимальной концентрации через 1-3 ч; прием пищи несколько удлиняет процесс всасывания (154). Фторхинолоны хорошо проникают во многие органы и ткани, причем концентрации в них равны или превышают сывороточные. Все фторхинолоны, за исключением пефлоксацина и офлоксацина, достаточно медленно выводятся из организма. В России на сегодняшний день в ветеринарии зарегистрированы энрофлоксацин, флюмеквин, ципрофлоксацин, норфлоксацин, офлоксацин, пефлоксацин, марбофлоксацин. Среди фторхинолонов наиболее широкое применение нашел энрофлоксацин, благодаря антибактериальному спектру действия, фармакокинетическим параметрам и безопасности для организма животных (87, 168). Энрофлоксацин – это производное хинолокарбоксильной кислоты, относится к группе фторхинолонов второго поколения и состоит из одного радикала фтора в позиции 6, одного радикала пиперазинила в позиции 7 и радикала циклопропила в позиции 1 (138, 225). Энрофлоксацин был 2 синтезирован в 1983 году и представляет собой слегка желтоватый, мелкий кристаллический порошок, без запаха, с горьковатым вкусом. Молекулярный вес энрофлоксацина: 359,4. Эмпирическая формула: C19H22FN3O3 (рисунок 1). Рисунок 1. Структурная формула энрофлоксацина С химической точки зрения это кислота: 1-циклопропил-6-фтор-1,4 дигидро-4-оксо-7-(4-этил-1-пиперазинил)-3-карбоксильный хинолон. Энрофлоксацин трудно растворим в воде, мало растворим в этаноле, хорошо растворим в хлороформе, кислых и щелочных растворах. Наличие атома фтора и карбоцикла определяют степень антимикробной активности и широту спектра действия энрофлоксацина. Этилпиперазильный заместитель обеспечивает оптимизацию фармакокинетических свойств, способствует повышению активности в отношении стафилококков, анаэробов, микобактерий. Механизм действия фторхинолонов, в том числе и энрофлоксацина, отличающийся от других антибактериальных веществ, обеспечил для энрофлоксацина отсутствие перекрестной резистентности с другими антибиотиками, сульфаниламидами и нитрофуранами.
Наиболее распространенной является версия о том, что мишенью их действия являются бактериальные топоизомеразы – топоизомераза IV и ДНК–гираза, осуществляющие изменение пространственной конфигурации молекулы ДНК на различных этапах ее репликации. Каждый из ферментов состоит из четырех субъединиц. Так, ДНК–гираза, тетрамерный фермент, состоит из двух субъединиц gyrА и двух субъединиц gyrB, которые кодируются генами gyrА и gyrB. Топоизомераза IV, имеющая также тетраметрическую структуру, состоит из субъединиц parC и parE (соответствующие гены parC и parE). Гены обоих ферментов локализованы 3 на бактериальной хромосоме. Топоизомераза IV осуществляет разрезание на отдельные полипептидные цепочки формирующуюся в ходе репликации линейную молекулу ДНК. Одна из основных функций ДНК–гиразы заключается в снятии напряжения, возникающего впереди репликационной вилки в результате расплетения двойной спирали ДНК в ходе репликации (98, 150, 207, 252).
Репликация ДНК происходит одновременно сразу в двух направлениях кольца хромосомы, создавая две репликационные вилки. Раскручивание спирали ДНК в обоих направлениях вызывает скручивание хромосомы в направлении спирали и делает хромосому плотной. ДНК-гираза предотвращает положительное суперскручивание, закручивая ДНК в противоположном направлении (287). Таким образом, в молекулу ДНК вводится виток отрицательной суперспирализации и снимается топологическое напряжение, возникающее впереди движущейся репликационной вилки.
Принято считать, что фторхинолоны имеют две связывающие области, одна взаимодействует с ДНК, другая – с ДНК-гиразой. Ингибирование репликации ДНК обусловлено формированием комплекса ДНК-гираза-фторхинолон-ДНК, который блокирует движение вдоль репликационной вилки, что приводит к гибели микробной клетки. Этот феномен был назван «poison hypothesis». Полагается, что фторхинолоны связываются с ДНК-гиразой в присутствии ДНК и ионов Mg2+, которые, возможно, необходимы для формирования комплекса. Однако они не связываются с каждым элементом независимо (235).
Результаты изучения антибактериальной активности энрофлоксацина
Результаты изучения антибактериальной активности энрофлоксацина в отношении различных изолятов микроорганизмов в сравнении с другими представителями из группы фторхинолонов (норфлоксацин, ципрофлоксацин и флюмеквин) и представителей других антибактериальных групп представлены. Результаты исследований показали, что наиболее активными соединениями из группы фторхинолонов в отношении стафилококков являются энрофлоксацин и ципрофлоксацин (таблица 9): МПК50 энрофлоксацина составила 0,25 мкг/мл, что соответственно в 4, 10 и 20 раз ниже, чем у ципрофлокацина (МПК50 1 мкг/мл), норфлоксацина (МПК50 2,5 мкг/мл) и флюмеквина (МПК50 5 мкг/мл).
Все изученные изоляты были устойчивы к флюмеквину (МПК50 и МПК90 составили соответственно 5 и 10 мкг/мл) и умеренно чувствительны к действию норфлоксацина (МПК50 2,5 мкг/мл). Изолят №22 оказался устойчив к действию ципрофлоксацина, норфлоксацина и флюмеквина (МПК 5 мкг/мл, 10 мкг/мл и 100 мкг/мл соответственно), но в тоже время проявил умеренную чувствительность к энрофлоксацину (МПК 2,5 мкг/мл). Изоляты №№1, 2, 3, 4, 5, 10-13, 15 ,17-20, 26, 39, 42-44 (39%) устойчивые к флюмеквину (МПК 10 мкг/мл), умеренно чувствительные к норфлоксацину (МПК 2,5 мкг/мл) и ципрофлоксацину (МПК 1 мкг/мл), оставались чувствительными к энрофлоксацину (МПК 0,25 мкг/мл).
Стрептококки оказались более устойчивы к действию фторхинолонов, чем стафилококки. Все исследованные изоляты были резистентны к флюмеквину и норфлоксацину (МПК50 100 и 10 мкг/мл соответственно), а к ципрофлоксацину и энрофлоксацину проявили умеренную чувствительность (МПК50 2,5 мкг/мл).
Три изолята Streptococcus faecalis (№№3, 4, 5, 7, 8, 10 , 11, 12) были умеренно устойчивы к действию энрофлоксацина и ципрофлоксацина (МПК 1-2,5 мкг/мл), однако МПК флюмеквина и норфлоксацина в отношении этих изолятов была значительно выше (от 10 до 100 мкг/мл).
При изучении чувствительности выделенных изолятов стафилококков к другим классам антибактериальных соединений было показано, что все штаммы чувствительны к гентамицину (МПК 0,05-1 мкг/мл), за исключением двух, проявившего слабую чувствительность (5 мкг/мл) (таблица 10). Эффективными в отношении стафилококков также были доксициклин (МПК50 0,25 мкг/мл), цефтиофур и амоксициллин (МПК50 0,4 мкг/мл). Клиндамицин проявил меньшую активность: только у 45% изолятов чувствительность проявлялась на уровне 0,5 мкг/мл. Цефалексин и левомицетин были наименее активны: их МПК50 составили соответственно 2,5 и 5 мкг/мл.
Изоляты 21-23 оказались мультирезистентными к антибиотикам (таблица 9 и 10), при этом изолят 21 сохранял чувствительность только к энрофлоксацину и ципрофлоксацину (таблица 9), изолят 22 – только к цефтиофуру, изолят 23 – только к доксициклину и гентамицину (таблица 10).
Наиболее активными в отношении стрептококков были антибиотики из группы -лактамов: МПК50 амоксициллина и цефтиофура составила 0,5 мкг/мл, менее активным оказался цефалексин, его МПК в отношении большинства изолятов была в 10 раз выше, чем МПК цефтиофура (таблица 10).
Только половина изолятов стрептококков проявила чувствительность к доксициклину в концентрации 0,5 мкг/мл, при этом 5 изолятов были устойчивы к действию этого антибиотика. К действию гентамицина стрептококки были умеренно чувствительны (МПК50 1 мкг/мл), а к действию клиндамицина (МПК50 50 мкг/мл) – устойчивы. Изоляты Streptococcus faecalis №2 и №6 были мультирезистентными и сохраняли чувствительность соответственно только к ципрофлоксацину (МПК 1,0 мкг/мл) и цефтиофуру (МПК 0,25 мкг/мл).
Наиболее чувствительными из энтеробактерий к энрофлоксацину и ципрофлоксацину были эшерихии, протей и сальмонеллы (МПК0,01-0,5 мкг/мл). Клебсиеллы проявили меньшую чувствительность (МПК энрофлоксацина составила 0,05-1,5 мкг/мл), но при этом оставались в категории чувствительных микроорганизмов. Только три изолята E. coli (№14, 23, 31) были умеренно чувствительны к энрофлоксацину и норфлоксацину (МПК 1,25 мкг/мл), при этом к флюмеквину они были устойчивы (МПК 10 мкг/мл), а к ципрофлоксацину – чувствительны. 83% изученных изолятов E. сoli были чувствительны к норфлоксацину. 17% изолятов проявили умеренную чувствительность.
Половина изученных изолятов E.сoli были чувствительны к действию флумеквина и МПК которого составила 0,2-0,6 мкг/мл (МПК50 0,6 мкг/мл). 34% выделенных изолятов E.сoli были умеренно чувствительны и МПК флюмеквина составила 1-2,5 мкг/мл. Изоляты №№3, 13, 14, 23, несмотря на умеренную чувствительность к норфлоксацину (МПК 1,25-2,5 мкг/мл) и устойчивость к флумеквину (МПК 5-10 мкг/мл), оставались чувствительными к действию энрофлоксацина и ципрофлоксацина. Изоляты №1, 2, 28 , 29 оставаясь умеренно чувствительными к флумеквину (МПК 1 мкг/мл), проявляли высокую чувствительность к действию энрофлоксацина, ципрофлоксацина и норфлоксацина.
Все изоляты протея и сальмонелл были менее чувствительны к норфлоксацину, чем к ципрофлоксацину и энрофлоксацину (МПК50 составила соответственно 0,1 и 0,5 мкг/мл) и устойчивы к флюмеквину (МПК50 5 мкг/мл).
По отношению к норфлоксацину изоляты Klebsiella проявляли умеренную чувствительность и его МПК50 составила 1 мкг/мл. МПК50 флюмеквина была в 10 раз выше, чем у энрофлоксацина и ципрофлоксацина и в 2,5 раза выше, чем у норфлоксацина (МПК50 2,5 мкг/мл). Три изолята Klebsiella (№1, 2 и 10) проявили устойчивость к флюмеквину, МПК которого составили 5 и 10 мкг/мл.
Только 60% выделенных изолятов Klebsiella были чувствительно к цефтиофуру (МПК50 0,5 мкг/мл), остальные проявили устойчивость – МПК 5-10 мкг/мл.
Из всех изученных антибиотиков цефтиофур оказался наиболее эффективным в отношении изолятов E. сoli. Его МПК50 составила 0,5 мкг/мл, что в 3, 10, 50 и 200 раз ниже, чем у гентамицина, амоксициллина, левомицетина, доксициклина соответственно.
Более половины изученных штаммов E. сoli были устойчивы к действию амоксициллина (МПК 3-100 мкг/мл), 6 изолятов проявили умеренную чувствительность (МПК 1,5-3,0 мкг/мл) и только для одного изолята МПК была 0,1 мкг/мл. МПК гентамицина в отношении E. сoli находилась в пределах 0,5-10 мкг/мл. 12 изолятов E. сoli были чувствительны к действию гентамицина, 23 изолята проявили умеренную чувствительность. Только один штамм E. сoli оказался устойчивым к действию этого антибиотика (МПК10 мкг/мл).
Левомицетин проявил слабую активность в отношении исследованных E. сoli: только 2 штамма были чувствительны к его действию (МПК 0,5 мкг/мл) и два – умеренно чувствительны (МПК 3 мкг/мл), а МПК в отношении большинства штаммов была выше 10 мкг/мл.
Изоляты №№1, 2, 7, 11, 12, 14, 15, 16, 24, 26-31, 35, 36 (47%) E. сoli оказались более чувствительными к цефтиофуру (0,5 мкг/мл), чем к гентамицину (МПК 1-2,5 мкг/мл), а также проявили устойчивость в отношении других антибиотиков (5-100 мкг/мл).
29 изолятов (76%) E. сoli были более чувствительны к цефтиофуру (0,2-1 мкг/мл), чем к гентамицину (0,5-1,25 мкг/мл). Восемь (31%) из них проявили умеренную чувствительность к амоксициллину (1,5-3 мкг/мл), но при этом были устойчивы к действию доксициклина, левомицетина, клиндамицину. МПК последних находилась в пределах 10-100 мкг/мл. Из всех изученных изолятов E. сoli только три №№12, 18, 23 были чувствительны и 3 изолята – умеренно чувствительны к действию доксициклина, и в тоже время были устойчивы к левомицетину и клиндамицину.
Результаты изучения чувствительности изолятов Proteus mirabilis показали, что они были устойчивы ко всем исследуемым антибиотикам, за исключением гентамицина, МПК50 которого составила 1 мкг/мл. МПК цефтиофура была 10 мкг/мл, амоксициллина – в пределах 25-100 мкг/мл, доксициклина – 5-25 мкг/мл, левомицетина – 50-100 мкг/мл, клиндамицина – 100мкг/мл.
В отношении изолята Serratia наиболее эффективными оказались гентамицин (МПК 0,25 мкг/мл) и цефтиофур (МПК 1 мкг/мл), к остальным же антибиотикам изолят был устойчив (МПК в пределах 10-100 мкг/мл).
Изоляты Salmonella spp. проявили наибольшую чувствительность к действию цефтиофура (МПК50 0,5 мкг/мл) и гентамицина (МПК50 1 мкг/мл). В отношении амоксициллина (МПК50 10 мкг/мл), доксициклина (МПК50 25 мкг/мл), левомицетина (МПК50 10 мкг/мл) и клиндамицина (МПК 100) они были устойчивы.
При введении препарата в желудок у крыс и мышей во всех испытанных дозах 2500, 5000, 8000, и 10000 мг/кг наблюдалась весьма специфическая картина интоксикации. На следующие сутки после введения у животных отмечали выделение черных фекалий, на хвосте засохшие кровянистые выделения. В зависимости от дозы указанные симптомы проходили на 3-5 сутки. В то же время в поведении крыс и мышей отсутствовали признаки, которые свидетельствовали бы о наличии болевой реакции (при которой животные беспокойны, прижимаются ко дну клетки, ползают, скребут лапами и т.п.).
Можно заключить, что максимально переносимая доза, не вызвавшая гибели подопытных животных – ЛД0 составила 10000 мг/кг. ЛД50 препарата при пероральном введении крысам и мышам будет превышать 5000 мг/кг, поэтому согласно общепринятой гигиенической классификации (ГОСТ 12.1.007-76) препарат относится к 4 классу опасности (ЛД50 5000мг/кг).
Согласно полученным результатам по изучению ульцерогенного действия на слизистую желудка, установлено, что препарат во всех испытанных дозах способствует образованию дефектов слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта. При введении в дозах 8000 и 10000 мг/кг наблюдались множественные эрозии и кровоизлияния на слизистой, что соответствует 3 баллам. В минимальной дозе 5000 мг/кг ульцерогенное действие было менее выражено, отмечались точечные кровоизлияния и эрозии и оценивалось 1-2 баллами.
Результаты изучения фармакокинетики энрофлоксацина, ципрофлоксацина и кетопрофена в молоке и плазме крови коров
Результаты изучения местно-раздражающего действия на паренхиму вымени после однократного введения противомаститного препарата показали, что среднее количество соматических клеток в молоке коров до введения препарата составляло 181,6+24,58 тыс./см3 при колебании этого показателя в пределах от 127 до 195 тыс/см3 (таблица 18). Через 3 часа после введения препарата отмечалось увеличение среднего содержания соматических клеток в молоке (р 0,05). Уже через 6 часов количество соматических клеток в молоке из опытной четверти вымени приближалось к периоду до введения препарата (211,4+26,06 против 181,6±24,58тыс./см3). В последующие периоды отбора проб молока (через 9-24 часа после введения препарата) содержание соматических клеток в молоке из опытной четверти вымени не отличалось от исходного уровня.
При этом результаты определения соматических клеток в молоке коров из контрольной четверти вымени, в которую не вводили препарат, показали, что содержание их после введения препарата ни в одном случае не превышало исходного уровня (таблица 18). Результаты изучения раздражающего действия препарата на паренхиму вымени после многократного введения противомаститного препарата показали, что до его введения среднее количество соматических клеток в молоке коров в I и II группах (получавших терапевтическую дозу и трехкратную терапевтическую дозу соответственно) составило из задних правой (опытной) и левой (контрольной) четвертей вымени 178,20±75,43; 168,20±28,09; 106,00±52,00 и 115,33+10,33 (тыс/см3) соответственно (таблица 19). В первую дойку количество соматических клеток достоверно повышалось у коров обеих групп только в молоке из опытных четвертей вымени и достигало максимального значения соответственно 998,8±97,32 тыс/см3 и 1115,33+267,01 тыс/см3 по сравнению с 178,20±75,43 тыс/см3 и 106,00±52,00 тыс/см3 в период до введения препарата. Уже на вторую дойку отмечалось снижение уровня соматических клеток, и их содержание было сравнимо с контролем. Так у коров группы I (получавших терапевтическую дозу) это количество составило 235,60±99,83 тыс/см3; у коров группы II (получавших трехкратную терапевтическую дозу): 226,33±50,96 тыс./см3 относительно соответствующих контролей 145,60+81,11 и 153,33±28,22 тыс/см3. В течение всего опытного периода количество соматических клеток в молоке из контрольных четвертей вымени у коров обеих опытных групп не изменялось (таблица 19). При изучении раздражающего действия препарата на паренхиму вымени в первую дойку отмечали, что молоко из четвертей вымени, в которые пятикратно вводили препарат в терапевтической и трехкратной терапевтической дозах, имело желтоватый оттенок. Ко второй дойке цвет молока восстанавливался. Молоко из других четвертей вымени во все периоды опыта имело обычный цвет и консистенцию. При сравнении динамики изменения количества соматических клеток у коров I и П группы (т.е. которым вводили в опытную четверть вымени соответственно препарат в терапевтической и трехкратной терапевтической дозах) можно отметить, что в количественном отношении данный показатель был несколько выше у животных группы П в первую дойку. Тем не менее, нормализация уровня соматических клеток имела место в одно и то же время (на 2 дойку).
При изучении раздражающего действия при однократном и многократном интрацистернальном введении противомаститного препарата клинических признаков воспаления молочной железы у коров выявлено не было. Таблица 18. Содержание соматических клеток в молоке коров из опытной и контрольной четвертей вымени после однократного интрацистернального введения противомаститного препарата (n=5)
Определение энрофлоксацина и ципрофлоксацина проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием флуоресцентного детектора. Для определения кетопрофена использовали УФ-детектор. Метод основан на совместной экстракции энрофлоксацина, ципрофлоксацина и кетопрофена из образцов плазмы крови и молока водно-метанольным раствором, содержащим HClO4 и H3PO4.
В результате изучения фармакокинетики энрофлоксацина и ципрофлоксацина в молоке коров после однократного интрацистернального введения противомаститного препарата установлено, что энрофлоксацин быстро поступал в паренхиму вымени и уже через час обнаруживался в максимальном количестве в молоке из опытной четверти вымени (678,74 мкг/мл) (таблица 20). В дальнейшем уровень препарата постепенно снижался, достигая через 6 часов концентрации 7,58 мкг/мл, через 21 час – 0,01 мкг/мл, через 24 часа содержание энрофлоксацина было ниже предела детектирования метода.
Результаты исследования показали, что ципрофлоксацин обнаруживался уже через час после введения в молоке из опытной четверти вымени (таблица 22). Однако его концентрация даже в период максимального накопления была примерно в 80 раз (8,05 мкг/мл) ниже по сравнению с энрофлоксацином (678,74 мкг/мл). Через 9 часов и в последующие сроки после введения препарата содержание ципрофлоксацина в молоке было даже несколько выше (0,146 мкг/мл), чем уровень энрофлоксацина (0,05мкг/мл). Через 24 ч, когда энрофлоксацин в молоке коров опытной четверти вымени не обнаруживали, ципрофлоксацин еще присутствовал в концентрациях на уровне предела количественного определения (0,02 мкг/мл). Содержание ципрофлоксацина в молоке из контрольной четверти вымени также было максимально через час после введения препарата, но примерно на порядок ниже по сравнению с молоком из опытной четверти вымени, в которую вводили препарат.
Согласно полученным результатам по изучении фармакокинетики кетопрофена после однократного интрацистернального введения противомаститного препарата в терапевтической дозе уже через час он обнаруживался в пробах молока из опытной четверти вымени в максимальных концентрациях, но уже через 6 часов его содержание резко падало с 21,00 мкг/мл до 0,67 мкг/мл .
Исходя из того, что активным в антибактериальном отношении метаболитом энрофлоксацина в организме является ципрофлоксацин, то при определении остаточных количеств в молоке коров анализировали содержание обоих продуктов (таблица 25).
В ходе определения остаточных количеств энрофлоксацина и его метаболита ципрофлоксацина в молоке из опытной четверти вымени коров установлено, что энрофлоксацин обнаруживался на три срока: 12, 24 и 36 часов из опытной четверти вымени после пятикратного введения противомаститного препарата (таблица 25). Максимальная концентрация (41,56±6,45 нг/мл) имела место на 12 часов, в последующие сроки содержание препарата снижалось до 16,39±2,37 нг/мл. Спустя 36 часов содержание энрофлоксацина было на уровне предела количественного определения метода (5,00 нг/мл). Через 48 часов после последнего введения препарата энрофлоксацин не обнаружили ни в одном образце молока.
Динамика содержания ципрофлоксацина в молоке из опытной четверти вымени носила несколько иной характер (таблица 25). Максимальная концентрация также имела место через 12 часов после последнего введения препарата, и она составила 65,78±4,80 нг/мл. Через 24 часа его уровень снизился примерно в 3 раза и был в пределах 20,01±4,60 нг/мл, что наблюдалось и через 36 часов. Далее концентрация ципрофлоксацин была ниже количественного определения метода ( 5,00 нг/мл).
