Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Респираторные и желудочно-кишечные болезни телят бактериальной этиологии 9
1.2. Комплексная антибактериальная терапия, как способ преодоление устойчивости микроорганизмов 15
1.3. Доксициклин
1.3.1. Физико-химические свойства 19
1.3.2. Механизм действия 20
1.3.3. Фармакокинетика 20
1.3.4 Токсичность 22
1.3.5. Методы анализа 24
1.3.6. Гигиенические нормативы 25
1.4. Флорфеникол 26
1.4.1. Физико-химические свойства 26
1.4.2. Механизм действия 27
1.4.3. Фармакокинетка 28
1.4.4. Биодоступность и токсичность 30
1.4.5. Методы анализа 31
1.4.6. Гигиенические нормативы
2. Материалы и методы исследований 34
3. Результаты исследований 46
3.1. Результаты исследований острой и подострой токсичности 46
3.1.1. Результаты исследований острой токсичности препарата флоридокс на лабораторных животных при внутрижелудочном введении 46
3.1.2. Результаты исследований острой токсичности препарата при внутримышечном введении 50 3.1.3. Результаты исследований подострой токсичности препарата при
внутримышечном введении 52
3.2. Результаты исследований раздражающего и аллергенного дейст
вия флоридокса 62
3.2.1. Результаты исследований раздражающего действия препарата на кожу и конъюнктиву кроликов 62
3.2.2. Результаты исследований аллергенных свойств препарата на морских свинках 62
3.3. Результаты изучения влияния флоридокса на антитоксическую функцию печени, эмбриотоксических и тератогенных свойств 64
3.3.1. Результаты исследований влияния флоридокса на антитоксическую функцию печени 64
3.3.2.Результаты изучения эмбриотоксических свойств препарата на сам ках белых крыс 65
3.4. Результаты исследований подострой токсичности флоридокса на телятах 67
3.5. Разработка метода определения доксициклина, флорфеникола и флорфеникол амина в органах и тканях животных
3.5.1. Подбор условий определения доксициклина в биосубстратах 74
3.5.2. Подбор условий определения флорфеникола, флорфеникол амина в биосубстратах 78
3.6. Определение доксициклина, флорфеникола и флорфеникол амина в образцах плазмы крови, органах и тканях телят 84
3.6.1. Результаты определения доксициклина и флорфеникола в образцах плазмы 84
3.6.2. Результаты определения доксициклина, флорфеникола и флорфеникол амина в органах и тканях 87
3.7. Изучение терапевтической и лечебно - профилактической эффек тивности флоридокса на телятах 89
4. Обсуждение 94
5. Выводы 104
6. Практические предложения 106
7. Список литературы
- Физико-химические свойства
- Результаты исследований острой токсичности препарата флоридокс на лабораторных животных при внутрижелудочном введении
- Результаты изучения влияния флоридокса на антитоксическую функцию печени, эмбриотоксических и тератогенных свойств
- Определение доксициклина, флорфеникола и флорфеникол амина в образцах плазмы крови, органах и тканях телят
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время на развитие животноводства в нашей стране обращают все большее внимания. Особое значение имеет получение здорового жизнеспособного молодняка телят и решение вопросов, направленных на повышение их продуктивности и сохранности.
Выполнению этой задачи мешают болезни телят раннего возраста различной этиологии. Несвоевременная и неправильная выпойка молозива, несбалансированное и неполноценное кормление, нарушение условий содержания, сырость, сквозняки и другие изменения микроклимата в родильных отделениях и телятниках приводят к возникновению различных респираторных и желудочно-кишечных болезней молодняка. В этиопато-генезе этих болезней основную роль играют пастереллы, стафилококки, стрептококки, патогенные штаммы E.coli, микоплазмы, вирусы и др. При изменении внешней среды и понижении устойчивости организма эта микрофлора становиться патогенной и может стать причиной развития патологического процесса. Желудочно-кишечные и бронхо-легочные заболевания проявляются у телят в форме токсической диспепсии, гастроэнтеритов, бронхитов, бронхопневмонии, плевритов и т.д. Все это, в конечном итоге, без оказания лечебной помощи, приводит к гибели молодняка (Пахмутова В.М. 2006; Шабунин СВ. 2008; Антипов В.А. 2009).
Чтобы предотвратить массовый падеж, необходимо своевременное и качественное вмешательство ветеринарных специалистов. В решении этой важной проблемы ветеринарная наука добилась определенных успехов. Для лечения легочных и желудочно-кишечных болезней молодняка предложены различные схемы и большое количество фармакологических средств, включая антибиотики, сульфаниламиды, фторхинолоны и др. Общим недостатком антимикробных средств является то, что длительное применение одних и тех же препаратов приводит к появлению устойчивых штаммов микроорганизмов, и тем самым к снижению их лечебной эффективности, что в свою очередь усложняет и удорожает процесс лечения (Ковалев В.Ф.,1983; Ковалев В.М, Виолин.Б.В.,1985).
В этой связи изыскание новых резервных комплексных антибактериальных препаратов имеет важное практическое значение. Применение рациональных комбинаций антибактериальных средств позволяет расши-
рить спектр действия комплексного препарата и предотвратить развитие резистентности у микроорганизмов.
Исходя из вышеизложенного, в настоящей работе изучен комплексный антибактериальный препарат флоридокс на основе доксициклина и флорфеникола производства ЗАО «Нита - Фарм» (г. Саратов).
Цель и задачи исследований. Целью работы было изучение фарма-ко-токсикологических свойств и терапевтической эффективности комплексного препарата на основе доксициклина и флорфеникола.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-определить острую и подострую токсичность препарата на белых мышах и крысах при внутрижелудочном и внутримышечном применении;
-изучить раздражающее действие препарата на кожный покров и слизистую конъюнктиву кроликов и выяснить аллергенные свойства препарата на морских свинках;
-исследовать специфическую токсичность препарата (гепатотокси-ческие, эмбриотоксические и тератогенные свойства);
-изучить подострую токсичность препарата на телятах;
-разработать метод ВЭЖХ с масс-спектрометрическим определением действующих веществ и их метаболитов в биосубстратах.
-изучить фармакокинетику доксициклина и флорфеникола в организме телят.
—установить наличие остаточных количеств действующих веществ и их метаболитов в органах и тканях телят после курсового применения препарата;
-изучить терапевтическую эффективность препарата при бронхопневмонии и колибактериозе телят;
-разработать проект инструкции по применению препарата при болезнях телят бактериальной этиологии.
Научная новизна работы. Впервые проведена фармако - токсикологическая оценка комплексного препарата флоридокс. Определены параметры острой и подострой токсичности, раздражающего, аллергенного, гепато-токсического, эмбриотоксического и тератогенного действия. Разработан метод ВЭЖХ с масс-спетрометрическим определением действующих веществ и их метаболитов в органах и тканях телят. Определены сроки воз-
можного использования мяса и субпродуктов для пищевых целей после курсового применения препарата. Изучена эффективность препарата при бронхопневмонии и колибактсриозе телят.
Практическая значимость работы. Для лечения бронхопневмонии и колибактсриоза телят рекомендован новый комплексный препарат фло-ридокс на основе доксициклина и флорфеникола. Разработана методика определения остаточных количеств доксициклина, флорфеникола и флор-фениколамина в органах и тканях животных с использованием метода ВЭЖХ с масс-спсктрометрическим определением. Данные по исследованию фармако-токсикологических свойств, терапевтической эффективности и фармакокинетики легли в основу разработки нормативных документов (СТО и инструкции по применению флоридокса).
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
-результаты изучения фармако - токсикологических свойств препарата на лабораторных животных и телятах;
-результаты разработки метода ВЭЖХ с масс-спсктрометрическим определением действующих веществ и их метаболитов в органах и тканях телят;
-результаты изучения фармакокинетики флоридокса и определение остаточных количеств действующих веществ (доксициклина, флорфеникола и флорфениколамина) в органах и тканях телят;
-результаты изучения терапевтической эффективности препарата при бронхопневмонии и колибактериозе телят.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на научно-методической комиссии ФГУ «ВГНКИ» (2009 г.); на ученом совете ГНУ ВНИИСГЭ 2009-2011 гг.; на III съезде фармакологов и токсикологов России «Актуальные проблемы ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации» (Санкт-Петербург, 2011); на международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы современной ветеринарии» (г. Краснодар, 2011г.); на международной научной конференции «Лекарственные препараты для животных» (г. Москва 2011 г.); расширенном совещании ГНУ ВНИИ ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Россельхозакадемии. (2011 г.).
Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликованы 4 печатные работы в изданиях, входящих в перечень ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 128 страницах компьютерного текста и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Список литературы включает 205 источников, в том числе 106 отечественных и 99 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 33 таблицами и 8 графиками.
Физико-химические свойства
Таким образом, бронхопневмонию рассматривают не только как местный процесс с локализацией в легких, но и как общее заболевание, проявляющееся нарушением всех систем и функций организма.
Регистрируется бронхопневмония преимущественно у телят 1 -3 месячного возраста. Болезнь возникает чаще всего в зимний, весенний и летний сезон года. Зимняя и весенняя вспышка обычно начинается в феврале с максимальным количеством больных и их гибелью в марте - апреле [2, 7, 56].
У молодняка по своему происхождению бронхопневмонии телят подразделяют на первичные и вторичные.
Первичные бронхопневмонии обычно возникают вследствие воздействия неблагоприятных факторов внешней среды и нарушения санитарно-гигиенического режима содержания: сырость, скученность, повышенное содержание аммиака в помещении, воздействие низких температур, плохое кормление, отсутствие моциона, воздействие комплекса стресс-факторов в период комплектации и перевозки поголовья, особенно в условиях промышленной технологии и т.д.; в результате чего понижается естественная резистентность молодого организма телят [6,10, 24, 51, 87,104]. Вторичные бронхопневмонии наблюдаются при ряде инфекционных заболеваний. Одной из причин заболевания молодняка бронхопневмонией являются патогенные и условно-патогенные микроорганизмы, находящиеся в организме животных в латентном состоянии и приобретающие вирулентные свойства при снижении резистентности и иммунологической реактивности организма животных [73, 74, 178].
Многообразие различных вирусных возбудителей, принадлежащих к высокопатогенным латентным семействам Herpesviridae, Adenoviridae, Paramyxoviridae и др., вызывают заболевания органов респираторной системы и создают благоприятные условия для бактериальной микрофлоры, которая при определенных условиях может стать первопричиной заболевания [14, 23, 43, 47, 89, 96].
Из пневмонических очагов, трахеальной и бронхиальной слизи у большинства заболевших и павших от бронхопневмонии животных удается выделить одновременно представителей разной бактериальной флоры: Streptococcus pneumonia, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pasteurella multocida, Pseudomonas aeruginosa, а также вирусы инфекционного ринот-рахеита, парагриппа-3 и вирусной диареи микоплазм, грибов, хламидий [11,14,17, 46, 96,106,150,165].
Смешанные инфекции бактериальной этиологии, как правило, на фоне стрессов и иммунодефицитов протекают значительно тяжелее, вызывая глубокие патологические изменения в бронхах и легких заканчиваясь чаще всего гибелью животных [5, 7, 9,13, 30, 46, 87, 91, 94, 106].
По мнению СМ Сулейманова (1986), респираторные болезни на фоне стрессов протекают у телят в виде острых вирусных инфекций, а затем могут осложняться вторичной инфекцией. В большинстве случаев бактериальная микрофлора в этиологии бронхопневмонии играет вторичную, осложняющую роль [87].
Больные животные являются источником дальнейшего распространения заболевания.
Основной путь передачи инфекции, по данным некоторых авторов, аэрогенный и воздушно-капельный [64, 87].
Клинические проявления смешанных инфекций очень разнообразны н не специфичны для каждого из составляющих их заболеваний. Они, как правило, не характеризуются суммой симптомов, а чаще сопровождаются активизацией патологического процесса.
При преимущественном участии в развитии бронхопневмонии патогенной бактериальной микрофлоры изменения характеризуются в основном экссудативным процессом и лейкоцитарной реакцией, что проявляется быстрым накоплением сначала серозного, а затем катарального экссудата в просвете бронхиол и альвеол. Слизистая оболочка становится отечной, набухшей, поверхность ее бугристой. Это обусловлено тем, что бактерии обычно не проникают в стенку слизистой оболочки, а размножаются почти исключительно в просветах дыхательных полостей респираторных отделов легких [11, 29].
Характер воспалительного процесса при бронхопневмонии варьируется в зависимости от этиологического фактора и степени сопротивляемости организма.
При остром течении болезни вначале поражаются, как правило, поверхностно лежащие дольки легких. Как указывают большинство авторов, основными клиническими признаками острой бронхопневмонии являются: лихорадка с повышением температуры тела на 1-2 С, вялость, напряженное дыхание, смешанная одышка, отечность слизистой носовой полости и трахеи, серозно-катаральное или катаральное истечение из носовых отверстий, выделение во время кашля катарального экссудата, хрипы в грудной клетке, глубокий кашель. В начальных стадиях бронхопневмонии и при остром ее течении в верхушечных и сердечных долях обнаруживают множественные дольковые поражения в виде пневмонических очажков, расположенных поверхностно или в толще легкого.
Подострая бронхопневмония характеризуется более затяжным течением и более длительной лихорадкой.
Для хронических бронхопневмоний характерно длительное течение, часто с периодами обострений и затуханий. В зависимости от длительности процесса, в результате слияния дольковых поражений часто обнаруживаются плеврит, перикардит [3,11, 25, 52, 88,109].
Результаты исследований острой токсичности препарата флоридокс на лабораторных животных при внутрижелудочном введении
В течение всего опытного периода проводили тщательный мониторинг состояния и поведения крыс. Гибель крыс во всех опытных группах отсутствовала. Примерно после третьего-четвертого введения препарата в максимальной дозе 350 мг/кг у крыс данной опытной группы отмечали повышенную агрессивность. Кроме того, даже по внешнему виду было заметно, что крысы отстают от контрольных животных в приросте массы тела.
У крыс, которым испытуемый препарата вводили в дозах 175 и 70 мг/кг, не наблюдали каких-либо симптомов интоксикации или патологических реакций. Животные были активны, охотно потребляли корм и воду, адекватно реагировали на внешние раздражители и т.п.
На протяжении всего эксперимента обследовали место инъекции. При пальпации не отмечали уплотнения; отсутствовала отечность; локальная температура кожи была нормальной. Наше наблюдение в отношении отсутствия местного раздражающего действия препарата позже подтвердилось при вскрытии крыс и тщательном макроскопическом обследовании места инъекций: во всех случаях симптомов воспаления не наблюдали.
Одним из объективных показателей переносимости препаратов является динамика прироста массы тела.
В таблице 5 приведены подробные данные по приросту массы тела в условиях настоящего подострого опыта.
Обращает на себя внимание то, что при введении испытуемого препарата в самой большой дозе, т.е. 350 мг/кг, имело место статистически достоверное снижение относительного прироста массы тела по сравнению с этим показателем у контрольных крыс (111,05±3,04 против 130,88±2,63%). В тоже время динамика прироста массы тела у крыс, которым препарат вводили в дозах 175 и 70 мг/кг, не отличалась статистически значимым образом от контроля (125,33±3,00 и 132,29±2,88 по сравнению с 130,88±2,63%). Определение массовых коэффициентов органов крыс приведено в таблице 6. Обращает на себя внимание достоверное увеличение относительной массы печени, почек и семенников у крыс, которым вводили испытуемый препарат в верхней дозе, т.е. 350 мг/кг (40,54±0,91; 7,70±0,14 и 12,12±0,51 в отличие 36,70±0,35; 6,58±0,16 и 9,49±0,24 от контроля). Массовые коэффициенты других органов крыс данной опытной группы были сравнимы с контрольными значениями.
Значения относительной массы органов крыс, которым препарат вводили в дозах 175 и 70 мг/кг, не подверглись изменениям. Приведем наглядные сравнения. Массовые коэффициенты печени, почек, селезенки и сердца у опытных крыс (в указанном порядке доз) составили 38,31±0,69 и 36,88±0,74; 6,95±0,14 и 6,55±0,14; 3,69±0,14 и 3,38±0,06; 3,59±0,12 и 3,52±0,04 против соответствующих контрольных значений 36,70±0,35; 6,58±0,16; 3,75±0,32 и 3,69±0,26.
В таблице 7 приведены наиболее информативные гематологические показатели у крыс трех опытных и контрольной групп.
Основываясь на тестированных показателях, становится очевидным, что препарат не приводил к значимому изменению состояния периферической крови у опытных крыс.
У животных, которым препарат вводили в дозах 350; 175 и 70 мг/кг, например, уровень гемоглобина равнялся соответственно 138,40±2,57; 139,50±1,89 и 137,50±6,50 против контрольного значения 144,20±1,43 г/л.
Приведем сопоставления, касающиеся форменных элементов. В группах крыс с введением препарата в указанном порядке доз количество эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов составило соответственно 7,72±0,18, 7,79±0,19 и 7,10±0,51; 11,84±1,15; 11,19±0,81 и 9,62±0,69; 664,50±51,85; 654,30±51,50 и 642,90±60,04 по сравнению с 7,40±0,05 (1012/л); 10,22±1,44 (10%) и 629,40±95,85 (109/л) в контроле.
Еще одним важным доказательством того, что исследуемый препарат не оказал влияния на гематологические показатели в условиях настоящего опыта, является отсутствие изменений в лейкограмме (таблица 7).
Результаты определения ряда важных биохимических показателей сыворотки крыс приведены в таблице 8.
Отметим наиболее важные отклонения показателей в ходе эксперимента от нормы. Прежде всего, они касаются анализа сыворотки крови крыс, которым препарат вводили в двух верхних дозах, т.е. 350 и 175 мг/кг. В данном случае можно указать на статистически значимые изменения следующих показателей: уровня общего билирубина (1,41±0,71 (при введении препарата только в дозе 350 мг/кг) по сравнению с 16,58±1,07 мкмоль/л в контроле); мочевины (7,87±0,30 и 7,71±0,31 по сравнению с 10,52±0,52 ммоль/л в контроле); общего белка (63,90±1,55 и 70,50±1,77 против 80,10±2,53 г/л в контроле); активности альфа-амилазы (337,20±39,81 и 486,10±15,27 против 583,40±18,05 Е/л в контроле) и концентрации глюкозы (7,09±0,27 и 7,31±0,26 против 8,63±0,27 ммоль/л).
Более подробно остановимся на некоторых изменениях при введении препарата в указанных высоких дозах.
Традиционно функциональное состояние печени оценивают по ряду биохимических показателей, например, таких как билирубин, активность аланинамино- и аспартатаминотрансфераз и других. В случае введения препарата в дозе 350 мг/кг из названных показателей изменениям подвергся только уровень билирубина (таблица 8). Правда, при рассмотрении ин дивидуальных значений концентрации общего билирубина обращает на себя внимание, что существенные изменения имели место у четырех животных (1,8; 6,8; 9,8 и 9,9 мкмоль/л). Тем не менее, это дает основание предположить, что испытуемый препарат в высокой дозе оказал определенное отрицательное влияние на функцию печени.
Результаты изучения влияния флоридокса на антитоксическую функцию печени, эмбриотоксических и тератогенных свойств
Данные биохимических исследований телят второй опытной группы объединены в таблицу 15. Анализ данных таблицы указывает на существенное влияние препарата в дозе 350,0 мг/кг/сутки на биохимические показатели крови.
Статистически достоверные изменения по сравнению с контрольными животными зафиксированы по таким показателям, как билирубин общий, билирубин прямой, ACT, АЛТ, мочевина, общий белок и щелочная фосфатаза на 36,2, 51,8, 18,2, 66,4, 52,4, 11,7, 62,1% соответственно (таблицы 15-16).
Показатели активности ACT, АЛТ, уровня общего и прямого били-рубинов указывают, что исследуемый препарат отрицательно влияет на функцию печени.
Можно судить о токсическом воздействии препарата на почки, так как количество мочевины достоверно было выше, нежели у контрольных животных. Во время опыта наблюдалась тенденция к постепенному увеличению уровня креатинина в сыворотке крови опытных животных, что также указывало на негативное влияние препарата на почки, однако количественное его изменение находилось в пределах ошибки выборки.
Среднесуточные приросты массы тела телят перед началом опыта составляли в среднем 475±35 г и 483±37 г в опытных и контрольной группе. В течение эксперимента среднесуточный привес телят контрольной и первой опытной группы находился примерно на одном уровне (с колебаниями от 460 до 490 г). Во второй опытной группе после 5-ти введений препарата в испытуемой дозе 350мг/кг/сутки среднесуточный прирост упал в среднем на 30 % (на 143 г) и во все время введения препарата находился на уровне 340-365 г. Через 15 суток после отмены препарата показатели привеса достигали исходных и не отличались от таковых у телят контрольной группы. Так же как и в представленных результатах первой опытной группы высокий уровень щелочной фосфатазы обусловлен активным ростом и развитием костной ткани подопытных телят.
После окончания применения препарата проводилось наблюдение за животными в течение 15 суток. По завершении срока наблюдения за животными были отобраны пробы крови и еще раз произведены биохимические исследования сывороток крови. В результате показатели крови вернулись к исходным (фоновым) значениям (таблицы 15 и 16).
На основании полученных данных можно заключить, что препарат флоридокс в дозе 175 мг/кг при длительном применении является малотоксичным при внутримышечном введении телятам. Количество доксициклина, нг/мл Площадь пика доксициклина смесь ацетонит-рилаи 0,1%-ного раствора уксусной кислоты (50:50) смесь уксусной кислоты, ацето-нитрила и метанола (55:25:20) смесь ацетони-рила и 5 мМ раствора аммония ацетата(80:20) 0,00445 3,33 103 1,24 103 0,0445 3,37 104 0,52 104 0,445 3,74 105 - График 1 Калибровочная кривая доксициклина для стандартных растворов в элюен-те - смесь ацетонитрила и 0,1%-ного раствора уксусной кислоты (50/50)
Таким образом, в качестве элюента решено было использовать смесь ацетонитрила и 0,1%-ного раствора уксусной кислоты (50/50), при использовании которого обеспечивается высокий уровень чувствительности и линейная зависимость результатов определения.
При подборе условий экстракции доксициклина исследовали возможность применения этилацетата, изопропилового спирта, гексана, буферные системы - фосфатно-сульфитный буфер, 0,05М фосфатный буфер.
Результаты подбора условий экстракции (таблица 18) показали, что наилучшие условия экстракции достигаются при использовании фосфатно-сульфитного буфера (ЗМ КН2Р04 и 1М Na2S03) и смеси этилацетат - изо-пропиловый спирт (88:12). В результате процент экстракции доксициклина из проб достигает 88%. Таблица 18 Подбор условий экстракции доксициклина из плазмы крови
Концентрация мкг/мл Процент экстракции, % мл фосфатно-сульфитного буфера(ЗМКН2Р04и1МNa2SOs) и 6 мл смесиэтилацетат-изопропиловый спирт(88:12 v/v) Этил ацетат смешивание с 2 мл 0,05М фосфатного буфера, затем экстракция 5 мл гексана, высушивание, растворение с элюенте
Для оценки линейности зависимости «концентрация - площадь пика» в пробах плазмы крови были подготовлены образцы с внесенным в них стандартом доксициклина в концентрации от 0,01 до 10,00 мкг/мл плазмы. Полученные образцы подвергали экстракции и анализу.
Полученные данные показывают, что зависимость «концентрация -высота пика» сохраняет линейность в исследованном диапазоне концентраций при экстракции доксициклина из проб плазмы.
Определение процента экстракции доксициклина из проб печени, почек, мышечной ткани, легких и сердца проводили с использованием уже подобранных условий. Для пробоподготовки использовали образцы органов и тканей массой 0,5-1 г, вносили в них 100-500 мкг стандарта докси циклина, затем добавляли 4 мл фосфатно-сульфитного буфера (ЗМ КН2Р04 и 1М Na2S03), после чего гомогенизировали образец с 6 мл смеси этилаце-тат-изопропиловый спирт (88:12 v/v). Смесь перемешивали и центрифугировали при 3000 об./мин в течение 5 минут, органический слой отделяли и упаривали. Полученный сухой остаток восстанавливали с помощью 0,8 мл мобильной фазы и анализировали.
Определение доксициклина, флорфеникола и флорфеникол амина в образцах плазмы крови, органах и тканях телят
Таким образом, на основании полученных результатов можно сделать следующие заключение, доза 350 мг/кг является токсической; доза 175 мг/кг является пороговой (минимально действующей); доза 70 мг/кг является недействующей,
С учетом установленных параметров токсического действия препарата на крысах и мышах LD50 = 5600 (4097 -7103) мг/кг и LD5o = 6500 (5360-І-7640) мг/кг, соответственно. В обоих случаях препарат можно отнести к 4 классу опасности согласно общепринятой гигиенической классификации (ГОСТ 12.1.007-76).
Исследование аллергизирующего и раздражающего действия препарата показало, что введение препарата морским свинкам в указанных дозах не предотвращали гибели животных от гистаминного шока, но и не ускоряли ее по сравнению с контрольными животными. Реакция у контрольных и подопытных животных на введения гистамина была одинаковой и проявлялась беспокойством, учащением дыхания, принятием бокового положении тела, судоргами и заканчивалась гибелью животных.
Поскольку конъюнктивальная проба является очень чувствительным тестом и в ряде случаев позволяет выявить реакцию животных на аллерген при слабой аллергизации и отрицательных кожных тестах, нами было установлено, что однократное нанесение препарата на слизистую оболочку глаза морским свинкам не вызывало покраснение склеры, расчесов, отеков век ни через 15 минут (гиперчувствительность немедленного типа), ни через 24 - 48 часов (гиперчувствительность замедленного типа). Следовательно, препарат не обладает аллергизирующими свойствами.
Не была установлена опасность развития неаллергического дерматина или раздражающего действия препарата при многократных эпикутан-ных накожных аппликаций и однократном нанесении на слизистую конъюнктиву кроликов. Отмечена незначительная гиперемия слизистой при многократном применении препарата Дозы препарата 175 и 70 мг/кг массы животного не оказали гепато-токсического действия на функцию печени крыс.
Введение препарата самкам крыс в дозе 1/20 от LD so (175 мг/кг), в критические сроки беременности не вызывало эмбриотоксического и тератогенного эффектов, что значительно улучшает данный комплексный препарат по сравнению с монокомпонентными аналогами. Например, известно, что препараты доксициклина обладают слабым тератогенным действием [124], что значительно ограничивает область их использования.
В сложном комплексе изменений, которые могут происходить в организме телят от повышенных доз препарата, первостепенные значения имеют гематологические и биохимические показатели. Нами было установлено, что препарат в дозе 1/20 от LD50 (что соответствует 175 мг/кг) при ежедневном внутримышечном введении телятам не оказывает влияния на клинические, гематологические и биохимические показатели. Однако доза 1/10 от LD5o(350 мг/кг) на 10 сутки применения вызывает в картине крови телят достоверные изменения содержания гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов. Подтверждением токсического влияния препарата на функцию печени является повышение уровней ACT и АЛТ, общего и непрямого билирубина. Через 15 суток после отмены препарата все функциональные изменения в организме телят приходили в норму. Таким образом, можно констатировать, что эта доза вызывает временное угнетение системы кроветворения и функции печени и др., что соответствует данным литературы по токсическому действию флорфеникола и доксициклина [166, 183, 186, 202, 204].
Изучение содержание флорфеникола и доксициклина в крови телят при однократном в/м введении необходимо для установления научно-обоснованных доз препарата, кратности его введения и разработки наиболее рациональных схем применения при различных болезнях животных.
Метод экстракции флорфеникола и доксициклина из биосубстрата был заимствован из зарубежных источников [129], а условия хромато-масс-спектрометрического определения концентраций действующих веществ подбирались к нашему оборудованию.
Для оценки степени экстракции проводили построение калибровочной кривой, как для водных растворов, так и образцов плазмы. Как показал анализ калибровочных кривых степень извлечения флорфеникола при экстракции по данной методике составила для флорфеникола 87-90% и флор-феникол амина - 81%. А для доксициклина - 88%.
Разработанная методика определения позволила идентифицировать также метаболит флорфеникола - флорфеникол амин. В целом, преимуществом усовершенствованного метода является его адаптация к условиям российского рынка химических реагентов, воспроизводимость методики, достаточно высокая чувствительность, значительно превышающая наиболее распространенный в настоящее время метод высокоэффективной жидкостной хроматографии. Все эти факторы позволили оценить доступные фармакокинетические параметры испытуемого препарата.
Анализируя результаты определения действующих веществ в плазме, следует отметить, что при однократном внутримышечном введении исследуемого препарата флорфеникол в крови находили в более высокой концентрации в первый час, чем содержание доксициклина за этот же период. Причем для доксициклина характерно было наличие двух пиков, соответствующих 1 и 9 часам. Второй пик через 5 часов можно объяснить, как повторным всасыванием вещества из кишечника после выделения его печенью с желчью, так и использованием пролонгирующего компонента в лекарственной форме. Низкая концентрация доксициклина вызвана, по всей видимости, его высокой степенью связывания с белками крови и медленным всасыванием из места инъекции. Оба действующие вещества препарата обнаруживались в крови в разных концентрациях на протяжении 24 часов, при этом содержание флорфеникола было значительно выше, чем доксициклина (график 8)
