Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Роль цитокинов в регуляции воспалительных процессов при ревматоидном артрите 12
1.2. Полиморфизм генов цитокинов при ревматоидном артрите 21
1.3. Подходы к прогнозированию терапии ревматоидного артрита 31
Глава 2. Материалы и методы исследования 43
2.1. Клиническая характеристика групп пациентов 44
2.2.Клинические и лабораторные методы исследования активности воспалительного процесса 50
2.3. Методы определения концентрации цитокинов TNF-a, IFN-y, IL-2, IL-4, IL-5,IL-10, IL-12,IL-13,GM-CSF 57
2.4. Методы исследования полиморфизма генов TNF А в позициях С-863А, G-308A, G-238A, IL-1B Т-31С, IL6 G-174C, IL4 С-590Т, IL10 С-592А 57
2.5. Методы статистической обработки результатов 58
Глава 3. Результаты и обсуждение 63
3.1. Цитокиновый профиль больных с ревматоидным артритом 63
3.1.1. Сравнительный анализ концентрации цитокинов в сыворотке крови у больных ревматоидным артритом и здоровых лиц 64
3.1.2. Концентрации цитокинов в сыворотке крови у больных с различной активностью ревматоидного артрита в динамике наблюдения 69
3.1.3. Зависимость эффективности иммуносупрессивной терапии от уровня сывороточных цитокинов у больных ревматоидным артритом 75
3.2. Анализ прогностической значимости исследования полиморфизма генов цитокинов 83
3.2.1. Распределение генотипов цитокинов у больных ревматоидным артритом и здоровых лиц в Западной Сибири 83
3.2.2. Распределение генотипов цитокинов в группах пациентов с различным течением ревматоидного артрита 87
3.2.3. Распределение генотипов цитокинов в группах пациентов с различной эффективностью терапии ревматоидного артрита 94
3.3. Оценка значимости исследования сывороточного уровня цитокинов и полиморфизма генов цитокинов в прогнозе эффективности терапии ревматоидного артрита 101
Заключение 109
Выводы 114
Практические рекомендации 116
Список сокращений 118
Список литературы 120
Приложение А 141
Приложение Б 142
- Роль цитокинов в регуляции воспалительных процессов при ревматоидном артрите
- Подходы к прогнозированию терапии ревматоидного артрита
- Сравнительный анализ концентрации цитокинов в сыворотке крови у больных ревматоидным артритом и здоровых лиц
- Оценка значимости исследования сывороточного уровня цитокинов и полиморфизма генов цитокинов в прогнозе эффективности терапии ревматоидного артрита
Введение к работе
Актуальность темы и степень ее разработанности
Высокая социальная значимость ревматоидного артрита (РА) определяется преимущественным поражением лиц трудоспособного возраста, неуклонным прогрессированием болезни, ранней инвалидизацией и сокращением продолжительности жизни (Насонов Е.Л., 2013). Широкая распространённость РА (частота в популяции 1%), зачастую упорное течение заболевания, связанное с недостаточной эффективностью и трудностями при подборе адекватной терапии, обеспечивают необходимость внедрения в практику новых высокотехнологичных, индивидуализированных методов диагностики и терапии пациентов с РА.
Исследования последних лет показали, что иммунокомпетентные клетки и продуцируемые ими цитокины определяют полиморфизм аутоиммунных воспалительных заболеваний, в том числе и РА (Александрова Е.Н., Насонов Е.Л., 2013; Mclnnes LB. и соавт., 2007). TNF-a, IL-1, IL-6, IL-8, GM-CSF осуществляют активацию фибробластов и экспрессию молекул адгезии, что рассматривается как основной механизм поддержания воспаления и прогрессии РА, формирования системных проявлений и осложнений. В то же время реализация аутоиммунного воспаления связана с продукцией IL-4, IL-10, ингибирующих деятельность провоспалительных цитокинов (Новиков А.А. и соавт., 2010). Уровень продукции самих цитокинов определяется структурой регуляторных участков генов цитокинов, сосредоточенных, как правило, в промоторных или интронных участках генов.
В последние десятилетия произошли существенные изменения в подходах к лечению ревматологических больных, включая внедрение концепции раннего агрессивного лечения и комбинированной базисной противовоспалительной терапии, широкое применение генно-инженерных биологических препаратов (ГИБП) (Каратеев Д.Е, 2012; Балабанова P.M., 2012). В настоящее время выбор терапии РА осуществляется эмпирически, не предусматривая чувствительность пациентов к лечению, что ограничивает возможности лечебного воздействия в будущем и способствует неконтролируемой прогрессии заболевания.
Проводятся работы по выявлению лабораторных, инструментальных, иммунологических и иммуногенетических маркеров прогностически неблагоприятных
форм РА и эффективности терапии, однако результаты различных исследований зачастую противоречивы (Breedveld F. С, Combe В., 2011; Romao V. С. и соавт., 2013), и поиск указанных биомаркеров остается актуальной проблемой медицины.
В настоящей работе проведено динамичное определение уровня провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, исследован полиморфизм генов цитокинов у пациентов РА на фоне различных схем терапии. Уровень цитокинов обуславливает развитие и поддержание воспаления при РА, в связи с чем проанализирован совместно с распределением основных медиаторов воспаления. Результаты исследования направлены на разработку критериев использования сывороточного уровня провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, полиморфизма их генов в комплексе с лабораторными показателями в качестве маркеров прогрессирующих форм РА, прогноза эффективности и нечувствительности к терапии.
Цель исследования
Оптимизация терапии ревматоидного артрита путем применения прогностической стратегии на основе оценки клинической значимости сывороточного уровня и полиморфизма генов цитокинов.
Задачи исследования
-
Провести комплексный анализ соотношения циркулирующих провоспалительных и противовоспалительных цитокинов (TNF-a, IFN-y, IL-2, IL-12 (p70), GM-CSF, IL-4, IL-10, IL-13, IL-5) у пациентов с ревматоидным артритом при различной активности воспалительного процесса.
-
Оценить зависимость эффективности базисной противовоспалительной терапии от уровня сывороточных цитокинов до начала лечения и динамику их концентраций в процессе терапии.
-
Изучить характер ассоциированности генотипов в промоторных участках генов цитокинов (TNFA в позициях С-863А, G-308A, G-238A, IL-1B Т-31С, IL6 G-174C, IL4 С-590Т, IL10 С-592А) с клиническим течением РА и эффективностью различных схем его лечения среди европеоидного населения Западной Сибири.
-
Провести клинический анализ прогностической значимости исследованных лабораторных признаков течения ревматоидного артрита.
Научная новизна исследования
В настоящей работе проведено комплексное исследование участия иммунологических и иммуногенетических факторов в формировании и развитии РА среди европеоидного населения Западной Сибири, имеющего определенные отличия в характере распространения некоторых аллелей различных генов от населения европейской части России.
Впервые для этой группы пациентов установлена динамичная взаимосвязь сывороточных концентраций провоспалительных и противовоспалительных цитокинов (TNF-a, IFN-y, IL-2, IL-12 (p70), GM-CSF, IL-4, IL-10, IL-13, IL-5) с активностью воспалительного процесса, характером течения РА, с эффективностью базисной противовоспалительной терапии (БПВТ).
Впервые для этой группы показано, что полиморфизмы генов TNFA С-863А, G-308А, G-238A, IL-1B Т-31С, IL6 G-174C, IL4 С-590Т, IL10 С-592А ассоциированы с вариантами клинического течения РА, эффективностью БПВТ и aHTH-TNF-терапии.
Впервые установлено, что пациенты с РА, имеющие хороший ответ при назначении БПВТ, кардинальным образом различаются по комбинациям генотипов цитокинов от больных, у которых этот ответ отсутствовал.
Впервые представлены данные по информативности комплекса лабораторных, иммунологических и иммуногенетических признаков в оценке возможности прогнозирования течения и эффективности терапии РА.
Теоретическая и практическая значимость работы
В результате проведенного исследования пациентов с РА в Сибирском регионе продемонстрирована динамика изменения уровня провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови в ходе иммуносупрессивной терапии и возможность использования комплексного анализа их уровня в качестве маркера эффективности проводимой терапии.
Верификация аллелей и генотипов генов, кодирующих продукцию провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, участвующих в патогенезе ревматоидного артрита, позволяет прогнозировать эффективность БПВТ и терапии ингибиторами TNF-a.
На основании выделения информативных признаков разработан комплексный подход прогноза варианта течения и эффективности терапии РА. Внедрение в
клиническую практику ведения пациентов с РА выявленных иммунологических и иммуногенетических признаков позволит значительно снизить вероятность использования заведомо неэффективных лекарственных средств, проводить индивидуализированное назначение препаратов пациентам с прогнозируемой высокой эффективностью данного вида терапии, производить своевременную коррекцию лечения.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Дополнительными критериями активности процесса и эффективности терапии при
ревматоидном артрите является определение концентрации про- и
противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови.
-
Клиническое течение РА и ответ пациентов на базисную противовоспалительную терапию ассоциированы с генотипами в промоторных участках генов ряда цитокинов.
-
Комплексный прогностический подход с исследованием сывороточных концентраций цитокинов и полиморфизма генов цитокинов позволяет выявлять неблагоприятные варианты течения РА и проводить персонализированный выбор терапии.
Внедрение в практику
Результаты исследования внедрены в работу терапевтического и консультативного отделений ФГБУ «НИИ клинической и экспериментальной лимфологии» СО РАМН, терапевтических отделений ФГБУ «НЦКЭМ» СО РАМН, используются для выявления неблагоприятных вариантов течения РА, прогноза эффективности базисной терапии и мониторирования проводимого лечения.
Апробация работы
Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Международной конференции «Фундаментальные проблемы лимфологии и клеточной биологии» (Новосибирск, 2008, 2011 гг.), V съезде ревматологов России (Москва, 2009), Евразийском симпозиуме (Чолпон-Ата, 2009), выездной научной сессии «Актуальные вопросы клинической лимфологии» (Андижан, 2009), III Городской научно-практической конференции врачей «Актуальные проблемы профилактики, диагностики и лечения болезней внутренних органов» (Новосибирск, 2009), I Всероссийской научной конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI
века» (Москва, декабрь 2012), ученых советах и семинарах ФГБУ «НИИКЭЛ» СО РАМН (Новосибирск, 2010-2013).
По материалам работы в 2009 г. получена именная стипендия администрации Новосибирской области в сфере научной деятельности. Работа заняла второе место среди лучших научных работ молодого ученого по терапии на I Всероссийской научной конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» (Москва, декабрь 2012 г.).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе 6 статей в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК МОН РФ для публикаций основных результатов диссертационных работ, 3 тезиса в иностранной печати. 2 соавторства в монографии.
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя. Работа изложена на 146 страницах машинописного текста, иллюстрирована 6 рисунками, содержит 27 таблиц, приложения (4 таблицы). Библиографический указатель включает 185 источников, из них 32 отечественных и 153 зарубежных.
Работа выполнена в рамках темы НИР ФГБУ «НИИКЭЛ» СО РАМН №005, госрегистрационный №01.2.00951656 «Разработка новых лимфотропных технологий диагностики, лечения и профилактики заболеваний соединительной ткани на основе идентификации транскрипционных генов и установление их связи с чувствительностью к заболеваниям, особенностям клинического течения и эффективности проводимой терапии».
Роль цитокинов в регуляции воспалительных процессов при ревматоидном артрите
Синовиальное воспаление и гиперплазия синовии определяют прогноз течения РА. Синовиальная оболочка сустава при РА инфильтрирована множеством специфических иммунных клеток, поддерживающих воспалительный процесс. Ревматоидная синовия характеризуется наличием большого спектра цитокинов, свидетельствующих об активации моноцитов/макрофагов (TNF-a, IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12), лимфоцитов (IFN-y, IL-2, IL-6, IL-10, IL-13, IL-16, IL-17, TGF-3), фибробластов и эндотелиальных клеток (IL-1, IL-6, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18), при этом список определяемых цитокинов постоянно расширяется [26, 85]. Большинство этих цитокинов в соответствии с их установленными в экспериментах свойствами считается ответственным за воспалительные и пролиферативные реакции в синовиальной мембране, костную и хрящевую деструкцию, системные проявления болезни. В то же время некоторые из перечисленных цитокинов (TGF-P, IL-10) способны, напротив, уменьшать проявления синовита. Локальная и системная гиперпродукция цитокинов являются основой клинических проявлений РА [26].
Основное значение в развитии РА придают двум тесно взаимосвязанным процессам: антиген-специфической активации CD4+T-лимфоцитов по ТЫ-типу, характеризующейся избыточным синтезом IL-2, IFN-y, IL-17, IL-18 и дисбалансу между гиперпродукцией провоспалительных цитокинов преимущественно макрофагальной природы, таких как TNF-a, IL -1, IL-6, IL-8, IL-15 и др. и противовоспалительных цитокинов (IL-4, IL-10, IL-13, растворимый антагонист IL-1, растворимые TNF-рецепторы), с преобладанием продукции первых над вторыми [34, 67]. Соотношение между про- и противовоспалительными цитокинами определяет выраженность клинических проявлений болезни и различия в эффективности терапии [106].
Спектр цитокинов, определяемых в сыворотке крови больных РА, соответствует их содержанию в синовиальной жидкости и находится в соответствии с Th-І медиаторными механизмами воспаления [130]. Так, Hessian Р.А. и соавт. провели исследование провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в ткани ревматоидных узелков 10 больных РА [73]. 9 из 10 узелков содержали гены IFN-y и характеризовались повышенной экспрессией TNF-a, IL-ір совместно с IL-12, IL-10, IL-15, IL-18. Таким образом, цитокиновый профиль в ревматоидном узелке сопоставим с профилем цитокинов в синовиальной оболочке и патологические процессы имеют общие аутоиммунные механизмы, развивающиеся по ТЫ типу [73].
TNF-a - провоспалительный цитокин, который синтезируется как мембраносвязанный протеин и высвобождается после протеолитического воздействия TNF-конвертазы (ТАСЕ). TNF-a входит в состав TNF-суперсемейства, многие из членов которого включаются в патогенез РА. Лимфотоксин и LIGHT регулируют субсиновиальную микроархитектонику, TRAIL, Fas-лиганд - участвуют в апоптозе, RANKL, рецептор активатор NF-KB лиганда- в активации остеокластов [1, 122].
При PA TNF-a преимущественно продуцируется синовиальными макрофагами. Конкретный стимулирующий агент по настоящее время не выявлен, но он определенно вовлекает TRL, семейство рецепторов, которые опознают специфическую молекулярную структуру и активируют иммунную систему, другие цитокины, такие как IL-15. TNF-a связывается двумя убиквитарными экспрессируемыми рецепторами (TNF-RI, TNF-RII), индуцирующими высвобождение других цитокинов и металлопротеиназ фибробластами, снижающими синтез протеогликанов хондроцитами и способствующими дифференцировке моноцитов в остеокласты в присутствии RANKL. TNF-a обладает способностью стимулировать хондроциты, вызывая деградацию хрящевой ткани и участвует в резорбции кости. Принципиальное значение имеет тот факт, что TNF-a синтезируется клетками, расположенными в избыточном количестве на стыке между паннусом и суставным хрящом, в той зоне, с которой начинается деструкция сустава. При иммуногистохимическом окрашивании было установлено, что мононуклеары, содержащие TNF-a преимущественно локализуются в периваскулярной области синовии [122]. Наибольшие концентрации TNF-a установлены в зонах с преобладанием лейкоцитов, что подтверждает участие TNF-a в усилении экспрессии молекул межклеточной адгезии на мембранах эндотелиальных клеток, индукции синтеза хемотаксических факторов. В синовиальной ткани, полученной методом артроскопии, у больных РА выявлен высокий уровень экспрессии TNF-a и IL-6 [45]. Ингибиторы TNF-a улучшают клинические проявления РА, снижают прогрессию костного эрозирования. В дополнение к этой роли при PA, TNF-a является важной частью в механизме реагирования к определенным инфекционным агентам. Оппортунистические инфекции, включая реактивацию латентного туберкулеза, или нарушения опухолевого иммунитета представляют потенциальную серьезную опасность анти TNF-терапии.
IL-1 способствует развитию воспаления при РА, включая увеличение синтеза IL-6, хемокинов, GM-CSF, простагландинов и коллагеназы. Он также играет центральную роль во многих животных моделях артритов. Существуют две формы IL-1: IL-ip, или секретируемая, и IL-la, которая экспрессируется внутри клеток и ассоциирует с клеточными мембранами. IL-1 активируется через I тип IL-1 рецептора (IL-RI). Макрофаги являются основным источником IL-1 в синовии при PA. IL-1 выполняет функции «катаболического» цитокина в синовиальной мембране. Он участвует в костной резорбции и деградации хряща. В группах пациентов с наличием деструктивных изменений в суставах IL-1 определяется в высоких концентрациях в синовиальной жидкости в сравнении с группой пациентов без эрозивных изменений [122]. Участие IL-1 в механизме костной резорбции осуществляется несколькими путями. В первую очередь - это стимуляция простагландина Е2, подавление синтеза коллагена, стимуляция пролиферации фибробластов, увеличение числа остеокластов, стимуляция активатора плазминогена и т.д. Деградация хрящевой ткани происходит в результате подавления синтеза протеогликанов, стимуляции выработки хондроцитами матриксных металопротеиназ. Разнообразные воспалительные факторы индуцируют продукцию IL-1 при РА, преимущественно TNF-a, GM-CSF, иммуноглобулин Fc-фрагмент, фрагменты коллагена и, в меньшей степени, -иммунные комплексы.
IL-18 - другая провоспалительная часть IL-1 семейства. IL-18 индуцирует продукцию IFN-y, IL-8, TNF-a, GM-CSF в синовиальных макрофагах. IL-18 смещает иммунный ответ Т-клеток в сторону ТЫ-фенотипа. Он экспрессируется преимущественно синовиальными фибробластами и макрофагами в ответ на IL-1 и TNF-a стимуляцию. Ингибирование IL-18 приводит к стиханию симптомов артрита в модели у мышей. Человеческий IL-18 -связывающий протеин блокирует IL-18 активность in vitro и является потенциальным терапевтическим агентом РА [118].
IL-6 имеет плейотропный эффект и влияет на системное воспаление через активацию гемопоэза и многочисленные клеточные типы иммунной системы. IL-6 относится к семейству IL-6 цитокинов, другими представителями которого являются IL-11, IL-27, IL-31, цилиарный нейротрофический фактор, кардиотрофин-1, кардиотрофин-подобный цитокин, нейропоэтин, лейкемический ингибиторный фактор и онкостатин М. В данном семействе цитокинов сигнальная трансдукция опосредуется мембранным гликопротеином 130 (gpl30). Специфическая биологическая активность IL-6 связана с его способностью активировать гены-мишени, участвующие в процессах дифференцировки, выживаемости, апоптоза и пролиферации клеток [14, 87]. IL-6 -мультифункциональный цитокин, продуцируемый различными типами лимфоидных и нелимфоидных клеток, включая Т- и В-лимфоциты, моноциты, кератиноциты, эндотелиальные клетки, фибробласты, мезангиальные клетки, клетки трофобласта, опухолевые клетки и др. Индукторами синтеза IL-6 служат IL-1, IL-2, TNFa, INF-у и колониестимулирующие факторы, ингибиторами - IL-4, IL-10 и IL-13. IL-6 рассматривается как значительный фактор активации синтеза белков острой фазы в печени, к которым относится и СРБ. IL-6 участвует в активации эндотелия и способствует формированию костных эрозий через стимуляцию созревания остеокластов [117, 150]. При РА уровень IL-6 значительно снижается после лечения TNF-ингибиторами. Клинические исследования IL-6 ингибиторов показали существенно более значимую эффективность, чем подобных TNF-a антагонистов [117].
Подходы к прогнозированию терапии ревматоидного артрита
Современная концепция фармакотерапии РА ориентирует врача на достижение полной или частичной ремиссии с использованием принципиально новых подходов терапии: «окно возможности» и «ранний РА». В основе указанных концепций лежат данные о том, что наиболее высокая степень деструкции суставов, определяющая неблагоприятный прогноз болезни, наблюдается именно в дебюте заболевания [12, 14].
Во многих случаях лечение БПВП недостаточно эффективно контролирует клинические проявления и рентгенологическую динамику РА. Частота ремиссии не превышает 25% [82]. Эффект ГИБП по сравнению с «традиционными» базисными препаратами, как правило развивается значительно быстрее и более выражен. Не смотря на это 30-40% пациентов не отвечают на терапию ГИБП [91], что с учетом высокой стоимости препаратов еще острее ставит вопрос по поиску прогностических маркеров эффективности терапии. Низкие показатели по достижению ремиссии у больных РА являются серьезным стимулом для разработки новых подходов в фармакотерапии РА с применением и БПВП, и ГИБП [15, 143, 175].
В настоящее время проводятся работы по разработке стандартизированных показаний к назначению терапии РА, но в основном они базируются на мнение экспертов [29]. Вариабельность течения РА и диссоциация между клиническими симптомами и прогрессированием костной деструкции создают трудности для оценки активности заболевания и вероятного ответа на терапию [68, 182]. Для более точного прогнозирования характера течения РА и эффективности терапии необходим анализ комплекса параметров, участвующих в развитии воспаления [72].
В качестве потенциальных предикторов в различное время исследовались и применялись клинические, социальные, лабораторные, иммунологические и генетические маркеры. К социальным параметрам неблагоприятного прогноза относят курение, низкий уровень образования, низкий социально-экономический статус [175]. Среди клинических предикторов используют подсчет количества болезненных и припухших суставов, оценку по опроснику здоровья Health Assessment Questionnaire (HAQ), ранее выявление эрозий суставов, отсутствие эффекта на БПВТ в течение 6 месяцев [64, 136]. Кроме того, недавно группа испанских исследователей представила доказательства, подтверждающие возможность использования ультразвука для количественной оценки воспаления при РА, в том числе у пациентов классически оцениваемых как находящихся в состоянии ремиссии [152].
Romao V.C. и соавторы в качестве предикторов хорошего ответа на МТ выделяют также выделяют ряд клинических факторов: мужской пол, некурящий пациент, ранняя стадия болезни, низкая активность в дебюте заболевания, отсутствие предыдущего использования БПВП, сопутствующая терапия ГК [143].
Такие лабораторные параметры, как скорость оседания эритроцитов (СОЭ), острофазовые белки (С-реактивный белок (СРБ), сывороточный амилоидный белок А (САА), фибриноген и матричная металлопротеиназа З (ММПЗ)) и аутоантитела (ревматоидный фактор (РФ), антицитруллинированные антитела (АЦЦП)), являясь важным инструментом для диагностики РА, в различное время применялись для оценки активности, определения прогноза, выбора метода лечения болезни и мониторинга эффективности проводимой терапии [27, 63, 64].
СОЭ — высокочувствительный, но неспецифичный маркер системного воспаления. Его определение может быть полезным для мониторирования течения РА, однако увеличение СОЭ не всегда коррелирует с активностью заболевания и не является основанием для изменения дозы глюкокортикоидов в отсутствие динамики клинических проявлений [27].
СРБ — классический острофазовый белок плазмы крови, рассматривающийся как наиболее чувствительный лабораторный маркер инфекции, воспаления и тканевого повреждения. По современным представлениям, даже незначительное повышение концентрации СРБ является независимым проспективным фактором риска кардиоваскулярных осложнений [142]. Определение СРБ классическими методами является полезным тестом для оценки активности патологического процесса и прогноза тяжести деструктивного поражения суставов у больных РА [129, 144]. Показано, что использование именно СРБ, а не СОЭ при подсчете DAS28 позволяет более достоверно оценить активность заболевания [180]. Определение базального уровня высокочувствительного СРБ (в.ч. СРБ) имеет важное значение для стратификации больных РА по степени кардиоваскулярного риска [96, 141].
САА является предшественником амилоидного белка А, основного компонента амлоидных отложений при вторичном амилоидозе. В ряде публикаций показано, что САА может лучше, чем СРБ, отражать острое воспаление и является более чувствительным показателем активности РА, чем СРБ [74]. Возможно, повышенная концентрация САА является предиктором развития вторичного амилоидоза у больных РА [42, 147].
ММПЗ — фермент, ответственный за деградацию многих компонентов экстрацеллюлярного матрикса, при РА его высокая концентрация обнаруживается как в синовиальной жидкости, так и в периферической крови. Уровень МППЗ коррелирует с активностью заболевания, рентгенологическими проявлениями, СОЭ и концентрацией СРБ. Обсуждается роль ММПЗ как показателя, позволяющего мониторировать эффективность лечения РА [74]. РФ — аутоантитела IgM, IgA и IgG классов, реагирующие с Fc-фрагментом IgG. РФ — чувствительный, но недостаточно специфичный показатель, так как они могут обнаруживаться в сыворотках при других ревматических заболеваниях, хронических инфекциях, болезнях легких, злокачественных новообразованиях, первичном билиарном циррозе и в пожилом возрасте [165]. Положительные результаты определения IgM РФ в сыворотке крови служат диагностическим критерием РА, определение его в высоких титрах полезно для прогнозирования быстропрогрессирующего деструктивного поражения суставов и системных проявлений при РА [158]. IgA РФ часто обнаруживаются при РА с полиартикулярным вариантом начала заболевания и внесуставными (системными) проявлениями, при IgA-нефропатии, синдроме Шегрена, пурпуре Шенлейна—Геноха и инфекционном эндокардите. Обнаружение IgA РФ может обладать определенной прогностической ценностью в отношении развития тяжелой деструкции суставов [60].
Семейство антител к цитруллинсодержащим белкам включает в себя антиперинуклеарный фактор (АПФ), антикератиновые антитела (АКА), антифилаггриновые антитела (АФА), антитела к циклическому цитруллинированному пептиду (АЦЦП), антитела к Sa антигену/цитруллинированому виментину (АЦВ) и антитела к цитруллинированному фибриногену (АЦФ).
АЦЦП имеют большое значение как прогностический маркер тяжести течения РА. Предсказательная ценность положительных результатов и предсказательная ценность отрицательных результатов данных антител для прогнозирования тяжелого эрозивного поражения суставов, по данным разных авторов, составляют 63—88 и 58—90% соответственно, что превышает прогностическую ценность таких показателей, как РФ, СОЭ, СРБ, мужской пол, курение и других [60, 135]. В данный момент активно обсуждается роль АЦЦП как предиктора развития более выраженной степени суставной деструкции и гораздо более тяжелой клинической картины заболевания, при этом доказано, что его прогностическая ценность в отношении развития тяжелого эрозивного процесса значительно возрастает при совместном определении с "shared epitope" (SE) HLA DRB 1 0101, 0104, 0404 [47, 184]. Комбинированное определение АЦЦП и РФ является оптимальным для прогнозирования характера течения РА в группе пациентов с ранним синовитом [140].
Сравнительный анализ концентрации цитокинов в сыворотке крови у больных ревматоидным артритом и здоровых лиц
Доказательством ведущей роли дисбаланса провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в патогенезе РА служит исследование уровня цитокинов у больных РА и здоровых доноров.
При оценке цитокинового профиля у пациентов с РА исследовали сывороточные уровни провоспалительных (TNF-a, IFN-y, IL-2, IL-12 (p70), GM-CSF) и противовоспалительных (IL-4, IL-10, IL-13, IL-5) цитокинов. Наряду с изменениями основных лабораторных параметров, отражающих активность воспалительного процесса (таблица 4), у больных РА отмечено преимущественно повышение сывороточного уровня цитокинов с провоспалительной активностью (таблица 5, рисунок 1), тогда как уровни цитокинов с противовоспалительной активностью у многих больных остаются на минимальных значениях (таблица 5, рисунок 2).
Обращает внимание, что среди пациентов с РА для всех цитокинов выявлена очень широкая вариабельность индивидуальных значений, особенно TNF-a, IFN-y, IL-2, GM-CSF (от 0,02 до 1500-3000 пг/мл). Максимальные уровни цитокинов превышают соответствующие уровни цитокинов здоровых доноров в десятки и сотни раз. В результате данные не отражают нормальный характер распределения в исследуемой группе, а выявленная гетерогенность значительно затрудняет оценку. Следует отметить, что сравнительный анализ уровней цитокинов в группе здоровых доноров и больных РА может быть несколько искажен из-за более низкой границы чувствительности метода измерения в опытной группе.
При проведении корреляционного анализа установлено наличие прямой взаимосвязи между уровнями исследуемых цитокинов - при высоких концентрациях провоспалительных цитокинов определяются высокие концентрации противовоспалительных. Выявлена достоверная прямая зависимость между уровнями IL-2, GM-CSF и степенью активности РА, основанной на индексе DAS28, основными провоспалительными цитокинами и оценкой функциональной активности согласно опроснику HAQ. Участие цитокинов в основных патологических процессах при РА обуславливает и сопряжено с повышением острофазовых показателей и других маркеров воспаления, тромбоцитозом, анемией. Достоверные прямые корреляции установлены между IL-5, IL-12 и уровнем гемоглобина, IL-12 и Е-селектином. Показатель ревматоидного фактора в сыворотке больного РА напрямую коррелирует с сывороточными уровнями IL-2, IL-4, IL-10, GM-CSF, TNF-a. Проведенный корреляционный анализ также показал наличие прямой достоверной взаимосвязи между возрастом дебюта РА и концентрации в сыворотке GM-CSF, IFN-y, TNF-a, что может отражать общую тенденцию к усилению наработки интерлейкинов с возрастом.
Не было обнаружено каких-либо значимых различий в уровне цитокинов в подгруппах больных РА мужчин и женщин.
Для того чтобы оценить возрастные особенности исследуемых параметров, среди пациентов РА выделены две оппозитные группы до и старше 52 лет (показатель определен как средний возраст в исследуемо й группе). Старшая возрастная группа характеризовалась большей длительностью заболевания при более позднем дебюте суставного синдрома, поздней рентгенологической стадией, высокой интенсивностью боли по ВАШ и низким уровнем тромбоцитов при сопоставимых остальных клинико-лабораторных показателях (таблица 6). В отличие от данных по здоровым донорам, при сравнительном анализе установлено, что у больных РА старшей возрастной группы достоверно определяются более высокие уровни IL-5, IFN-y, TNF-a и имеется тенденция к высоким уровням IL-4 и IL-10 (таблица 7). Выявленный факт позволяет предположить достаточную выработку цитокинов, участвующих в регуляции иммунных реакций, даже у пожилых пациентов с РА, вероятно в связи с большей длительностью и прогрессированием патологического аутоиммунного процесса. В подгруппе пациентов с большой длительностью заболевания, определяемой как выше среднего значения 9,08 лет, выявлены достоверно более высокие титры GM-CSF (р=0,048), что может отражать роль данного цитокина в дифференцировке остеокластов и активации макрофагов.
Высокая индивидуальная вариабельность количественных значений, зависимость уровня цитокинов от ряда факторов (возраст пациента, длительность заболевания) затрудняют их оценку, требует дальнейших исследований и свидетельствует в пользу максимальной информативности динамического наблюдения у конкретного больного с РА.
Оценка значимости исследования сывороточного уровня цитокинов и полиморфизма генов цитокинов в прогнозе эффективности терапии ревматоидного артрита
Прогнозирование варианта течения и эффективности терапии РА является актуальной задачей современной клинической медицины. Анализ литературы показал, что установленные клинические, лабораторные, иммунологические и генетические критерии способствуют достаточно точной верификации диагноза РА, но зачастую, особенно при изолированном определении, имеют малую прогностическую ценность. Учитывая вышесказанное, необходим поиск новых биологических маркеров тяжести РА и эффективности его терапии. Одним из перспективных подходов является комплексный анализ клинических, лабораторных, иммунологических и иммуногенетических признаков для оценки варианта течения РА и эффективности лечения, чему посвящена и представленная работа.
Первоначально в исследовании проведен анализ уровня цитокинов в сыворотке крови у пациентов с различной эффективностью БПВТ. Установлено, что гиперпродукция про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови до начала лечения с преобладанием IFN-y, TNF-a, GM-CSF ассоциирована с благоприятным прогнозом эффективности иммуносупрессивной терапии. Быстрый и стойкий эффект на БПВТ формируется у больных РА со значительным преобладанием содержания провоспалительных цитокинов над противовоспалительными в сыворотке крови. Эффект не развивается или утрачивается в срок до 24 недель от начала лечения у пациентов с низким содержанием про- и противовоспалительных цитокинов с их равным соотношением. В динамике при положительном эффекте иммуносупрессивной терапии отмечается снижение всех групп цитокинов, а значительное повышение концентрации провоспалительных цитокинов IFN-y, TNF-a, GM-CSF в сыворотке крови на фоне проводимой БПВТ у больных РА в состоянии клинической и лабораторной стабильности является ранним и чувствительным показателем формирования резистентности и предшествует обострению.
В то же время результаты исследования показали, что высокая индивидуальная вариабельность количественных значений, зависимость уровня цитокинов от ряда факторов (длительность заболевания, возраст, предшествующая терапия) затрудняет их оценку. Попытки расчета диагностических коэффициентов не дали должных результатов, отличаются низкой чувствительностью и специфичностью, не позволяя использовать указанный параметр в прогностических целях. С другой стороны, в комплекс со стандартными клинико-лабораторными показателями оценки эффективности назначенной терапии показано включение динамичного исследования сывороточного уровня цитокинов.
Цитокиновый геном индивида является конституционально стабильным базисом, формирующим баланс факторов регуляции воспалительного процесса, поэтому в первую очередь рассматривается в качестве кандидатного биологического маркера. В ходе проведенного исследования было дополнительно подтверждено, что эффекты отдельных полиморфизмов генов цитокинов, обнаруживаемые при анализе ассоциаций, как правило, невелики и могут быть связаны не с самим изучаемым маркером, а со сцепленным с ним функционально значимым вариантом. Исходя из этого, применен метод комплексного анализа выявления в геноме пациента одновременно целого набора аллельных вариантов генов цитокинов, полиморфизм которых сосредоточен в регуляторных промоторных участках, содержащих сайты связывания транскрипционных факторов. Проанализирована частота встречаемости всех одно-, двух-, трех-, четырех-, пяти-, шести- и семилокусных комбинаций генотипов в группах с различными эффектами БПВТ по результатам 24-недельного наблюдения.
В практической ревматологии вполне реально использовать полученные данные в качестве прогностических признаков, позволяющих до назначения терапии БПВП предвидеть ее результаты и внести заранее необходимые коррективы, не используя напрасно ограниченное во времени «окно терапевтических возможностей». Для реализации таких возможностей необходимо обратиться к величинам прогностических коэффициентов, представленным в таблицах 1-3 (приложение Б), в которых после сплошного анализа всех возможных комбинаций представлены лишь достоверно различающиеся комбинации генотипов цитокинов. Достоверность прогноза предполагаемого эффекта от назначаемого лечения напрямую связана с величиной диагностического коэффициента (DK). Необходимо также обратить внимание на высокие (доходящие до 100 %) показатели специфичности выявления ряда генетических комбинаций при сопоставлении анализируемых выборок. Столь редкие в ревматологии и в медицинской иммунологии в целом показатели специфичности позволяют после проведения многоцентровых исследований рассчитывать на их высокую клиническую значимость.
Для оценки результатов предполагается использовать широко известную в медицине последовательную процедуру Вальда, описанную выше [9]. В нашем исследовании положительное значение DK будет отмечаться в случае преобладания вероятности состояния А1 (положительный эффект БПВТ), отрицательное значение в случае преобладания вероятности состояния А2 (отсутствие эффекта БПВТ). Математические преобразования в данном способе анализа позволяют суммировать логарифмированные значения величин прогностических коэффициентов и при использовании расширенных генетических комплексных показателей суммировать их значения для одного пациента и получать индивидуальные показатели с гораздо более высокими значениями.
Учитывая, что охват комбинаций генотипов не достигает 100%, разброс частот иммуногенетических комплексов колеблется от 0 до 50%, то далее сочли возможным включить в диагностическую процедуру такие хорошо известные лабораторные маркеры, как СРБ и РФ. По данным литературы высокие уровни СРБ и РФ ассоциированы с худшим прогнозом, быстропрогрессирующим течением РА [46, 59, 120, 128, 141,142]. В нашем исследовании охват данными серологическими маркерами составил 100%. Используя вышеописанный метод квартильного анализа, были выделены низкие и высокие уровни СРБ, РФ и рассчитаны диагностические коэффициенты эффективности БПВТ в зависимости от полученных показателей, представленные в таблице 23.
Суммация диагностических коэффициентов комбинаций генотипов с диагностическими коэффициентами по СРБ и РФ может сдвигать коэффициент в сторону положительного или отрицательного ответа, тем самым с большей вероятностью прогнозировать эффективность БПВТ.
Заключая вышеизложенное, следует отметить, что комплексный анализ клинических, лабораторных, иммунологических и иммуногенетических признаков способствует прогнозированию течения РА и эффективности его терапии. Проиллюстрируем данное заключение клиническими примерами.
Пример 1. Больная Я., 44 лет, диагноз: Ревматоидный артрит, серопозитивный (М05.8), поздняя стадия, активность умеренная (DAS28=4,06), эрозивный (рентгенологическая стадия 3), АЦЦП-позитивный, ФК 2 (HAQ=1,25). На момент включения в исследование длительность заболевания 5 лет, на фоне БПВТ (метотрексат 10 мг/неделя) уровень боли по ВАШ 70 мм, утренняя скованность 60 мин, СОЭ 20 мм/ч по Вестергрену, в.ч. СРБ 10,0 мг/л, РФ 486,2 Ед/мл, DAS28 (по СОЭ)=4,06. По данным рентгенографии кистей и стоп множественные эрозии.
Исследование полиморфизма генов цитокинов: IL1B-31TT/IL6-174GC/TNF-238GG/TNF-308GG/TNF-863CC/IL4-590CC/IL10-592CC
Согласно таблице 3 (приложение Б) указанная комбинация 6 генотипов (IL6-174GC/IL10-592CC/TNF-238GG/TNF-308GG/TNF-863CC/IL1B-31TT) характерна для пациентов с отсутствием эффекта БПВТ (DK=-11,6).
Уровни лабораторных показателей в.ч. СРБ 10,0 мг/л (DK=-1,0), РФ 486,2 Ед/мл (DK=-3,2).
