Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Визуализация внутренней структуры биотканей
1.1. Современное состояние методов биомедицинской томографии 18
1.1.1. Традиционные методы томографии 21
1.1.2. Оптическая томография биотканей 23
1.2. Флуоресцентная визуализация внутренней структуры биотканей 29
1.2.1. Методы флуоресцентного имиджинга 31
1.2.2. Диффузионная флуоресцентная томография 34
1.3. Заключение 37
ГЛАВА 2. Диффузионная флуоресцентная томография с плоскопараллельной геометрией сканирования
2.1. Восстановление пространственного распределения флуорофора по томографическим измерениям 39
2.2. Моделирование светового поля в мутной среде 42
2.2.1. Диффузионное приближение уравнения переноса излучения 43
2.2.2. Вычисление малоугловой компоненты светового поля 46
2.2.3. Гибридная модель распространения света в мутной среде 48
2.3. Численные методы решения задачи томографии 50
2.3.1. Метод сопряженных градиентов 51
2.3.2. Методы алгебраической реконструкции 52
2.4. Восстановление пространственного распределения флуорофора на основе проекционного имиджинга 53
2.5 Апробация диффузионной флуоресцентной томографии в численном эксперименте 57
2.6. Заключение 59
ГЛАВА 3. Спектрально-разрешенная диффузионная флуоресцентная томография с плоскопараллельной геометрией сканирования
3.1. Восстановление пространственного распределения флуорофора по спектроскопическим измерениям 61
3.1.1. Метод симметрично-направленных измерений 65
3.1.2. Оценка оптических свойств исследуемого объекта 69
3.2. Апробация спектрально-разрешенной диффузионной флуоресцентной томографии в численном эксперименте 71
3.2.1. Решение задачи томографии в автофлуоресцирующей среде 74
3.2.2. Оценка устойчивости решения задачи томографии относительно точности определения оптических свойств среды 75
3.3. Заключение 77
ГЛАВА 4. Экспериментальная апробация методов флуоресцентной визуализации биотканей
4.1. Описание экспериментальной установки для флуоресцентного имид-жинга лабораторных животных 80
4.2. Апробация проекционного имиджинга и диффузионной томографии... 84
4.2.1. Мониторинг биологических процессов в реальном времени 85
4.2.2. Локализация флуоресцирующего объекта 87
4.3. Апробация спектрально-разрешенной томографии 91
4.4. Заключение 98
Заключение 1 00
Библиографический список использованной литературы
- Традиционные методы томографии
- Диффузионное приближение уравнения переноса излучения
- Апробация спектрально-разрешенной диффузионной флуоресцентной томографии в численном эксперименте
- Мониторинг биологических процессов в реальном времени
Введение к работе
Актуальность работы
На сегодняшний день известно большое количество методов измерений, достаточно полно и достоверно описывающих исследуемые объекты и процессы, однако задача томографии для визуализации внутренней структуры, скрытой от внешнего наблюдателя, остается одной из основных в различных областях науки. Особое место томографические исследования занимают в современной биомедицине, где они стали незаменимым инструментом для фундаментальных исследований процессов канцерогенеза в живых системах, ранней диагностики онкологических заболеваний и разработки терапевтических методов лечения. В биологии и медицине применяются различные типы томографов (компьютерные, магнитно-резонансные, ультразвуковые и др.), каждый из которых занимает свою нишу в исследованиях. В последнее десятилетие появились мощные и компактные источники света, а также высокочувствительные охлаждаемые фотоприемники, поэтому создание новых флуоресцентных маркеров, которые могут быть встроены в раковые клетки или доставлены к опухоли, привело к развитию флуоресцентного имиджинга и появлению диффузионной флуоресцентной томографии (ДФТ).
Диффузионная флуоресцентная томография является практически идеальным методом для исследования процессов канцерогенеза в организме лабораторных животных. Например, раковые клетки можно трансфициро-вать флуоресцентным белком и привить животному, после чего появляется возможность наблюдать развитие опухоли, процессы метастазирования и результаты лечения. При этом данный метод обладает рядом преимуществ перед традиционной томографией: полная неинвазивность воздействия зондирующего излучения на биоткани, чувствительность к молекулярным событиям для функциональной диагностики, высокая контрастность и хорошее пространственное разрешение изображений, а также относительно низкая стоимость оборудования и компактная конструкция томографа.
Развитием методов ДФТ занимается большое число научных групп по всему миру. Однако вопрос оптимальной реализации ДФТ – систем остается открытым. Наибольший интерес представляют томографы с плоскопараллельной геометрией измерений благодаря максимальной компактности и широкой вариативности конструкции. Однако, вне зависимости от конфигурации ДФТ – системы, существующие методы требуют увеличения точности восстановления пространственного распределения флуорофора в теле животных, поскольку сильное рассеяние света приводит к плохой обусловленности обратной задачи томографии. Другой актуальной проблемой диффузионной флуоресцентной томографии является собственная флуоресценция биотканей, которая существенно снижает точность восстановления послойных флуоресцентных изображений животного и ограничивает максимальную чувствительность данного метода.
Цель работы
Целью диссертационной работы является развитие диффузионной флуоресцентной томографии лабораторных животных и разработка методов томографических измерений с плоскопараллельной геометрией измерений.
Для достижения поставленной цели были разработаны: метод томографических измерений на основе проекционной флуоресцентной визуализации, и метод симметрично-направленных спектроскопических измерений, который основан на спектрально-разрешенной диффузионной флуоресцентной томографии с экспериментальной оценкой оптических свойств объекта. Для технической реализации предложенных методов была разработана и создана экспериментальная установка для флуоресцентного ими-джинга мелких лабораторных животных с плоскопараллельной геометрией измерений. В целях апробации разработанных методов была проведена серия экспериментальных исследований модельных объектов и животных.
Научная новизна
-
Впервые разработан и реализован метод томографических измерений на основе проекционной флуоресцентной визуализации, который позволяет сократить общее число экспериментальных измерений по сравнению с традиционной диффузионной флуоресцентной томографией и оптимизировать процесс сканирования объекта в плоскопараллельной геометрии с использованием направленного источника света и точечного приемника флуоресценции.
-
Впервые разработан и реализован метод симметрично-направленных спектроскопических измерений на основе спектрально-разрешенной диффузионной флуоресцентной томографии с плоскопараллельной геометрией измерений, который позволяет выделять собственную флуоресценцию освещенной поверхности биоткани при отсутствии данных о спектрах поглощения и эмиссии источников автофлуоресценции.
-
Впервые показано, что оценка спектра показателя поглощения света в биоткани по измеренному спектру ослабления света при прохождении через объект в области флуоресценции обеспечивает устойчивость решения задачи спектрально-разрешенной диффузионной флуоресцентной томографии относительно погрешности аппроксимации спектра транспортного показателя рассеяния по литературным данным.
-
Впервые разработана и создана установка для имиджинга лабораторных животных, которая позволяет получать флуоресцентные изображения с использованием отражательной и проекционной конфигурации источника и приемника света, а также реализует в себе методы стандартной и спектрально-разрешенной диффузионной флуоресцентной томографии для восстановления пространственного распределения флуоресцентного маркера.
5. Впервые проведен мониторинг накопления и выведения фотосенсибилизатора в органах мышей с использованием проекционного флуоресцентного имиджинга.
Практическая значимость работы
Результаты представленной диссертационной работы имеют как научное, так и практическое значение. Разработанный метод томографических измерений на основе проекционного флуоресцентного имиджинга позволяет определять положение и размеры маркированной опухоли в организме мелких лабораторных животных с использованием простой конструкции томографа, которая отличается сравнительно низкой стоимостью оборудования. Предложенный метод симметрично-направленных спектроскопических измерений и применение оценки оптических свойств исследуемого объекта по измеренному спектру показателя ослабления света в области флуоресценции повышают обусловленность обратной задачи спектрально-разрешенной диффузионной флуоресцентной томографии и точность восстановления пространственного распределения флуоресцентного маркера в присутствии выраженной автофлуоресценции биотканей. Созданная установка для флуоресцентного имиджинга реализует разработанные методы измерений и позволяет проводить современные биомедицинские исследования, которые имеют отдельное научное и практическое значение.
Положения, выносимые на защиту
-
Метод томографических измерений на основе проекционной визуализации позволяет определять положение и размеры маркированной опухоли в теле мелких животных по набору проекций, полученных в ходе многократного синхронного сканирования объекта в плоскопараллельной геометрии при различных смещениях источника света относительно оси точечного приемника флуоресценции.
-
Использование синхронного сканирования направленным источником света и точечным приемником флуоресценции позволяет оптимизировать томографические измерения в плоскопараллельной геометрии и значительно сократить количество неинформативных измерений по сравнению со стандартной диффузионной флуоресцентной томографией, в которой применяется CCD камера.
-
Использование симметрично-направленных спектроскопических измерений позволяет решить задачу спектрально-разрешенной диффузионной флуоресцентной томографии в присутствии автофлуоресценции среды с неизвестным спектром эмиссии, даже когда ее уровень сравним с уровнем флуоресценции маркера.
-
Оценка оптических свойств биоткани по измеренному спектру ослабления света в исследуемом объекте обеспечивает устойчивость решения
задачи спектрально-разрешенной диффузионной флуоресцентной томографии относительно ошибок аппроксимации спектра транспортного показателя рассеяния по литературным данным при отсутствии априорной информации о спектре поглощения света. 5. Экспериментальная установка для флуоресцентного имиджинга позволяет проводить мониторинг эволюции маркированных областей в теле лабораторных животных с использованием отражательной и проекционной конфигурации источника и приемника света, а также определять положение и размеры маркированных областей на основе разработанных методов томографических измерений.
Публикации и апробация результатов
По результатам, вошедшим в диссертационную работу, опубликовано 42 работы: 1 глава в книге, 9 статей в отечественных и зарубежных рецензируемых журналах, 16 статей в сборниках трудов конференций, 12 тезисов докладов и 4 патента на изобретения. Результаты представленной диссертации обсуждались на семинарах Института прикладной физики РАН и докладывались на российских и международных конференциях:
XIII научная школа «Нелинейные волны», Н. Новгород, Россия, 2006
XII нижегородская сессия молодых ученых, Н. Новгород, Россия, 2007.
International symposium «Topical problems of biophotonics», Н. Новгород – Москва – Н. Новгород, Россия, 2007.
XI International school for junior scientists and students on optics, laser physics and biophysics «Saratov Fall Meeting», Саратов, Россия, 2007.
XIII нижегородская сессия молодых ученых, Н. Новгород, Россия, 2008.
XIV нижегородская сессия молодых ученых, Н. Новгород, Россия, 2009.
IV International graduate summer school «Biophotonics», Швеция, 2009.
International symposium «Topical problems of biophotonics», Н. Новгород – Самара – Н. Новгород, Россия, 2009.
SPIE Photonics west, Сан-Франциско, США, 2010.
European conference on biomedical optics, Мюнхен, Германия, 2011.
International symposium «Topical problems of biophotonics», С.-Петербург – Н. Новгород, Россия, 2011.
V троицкая конференция «Медицинская физика и инновации в медицине», Троицк, Россия, 2012.
International symposium «Topical problems of biophotonics», Н. Новгород – Ярославль – Казань – Н. Новгород, Россия, 2013.
SPIE Photonics west, Сан-Франциско, США, 2014.
Личный вклад автора
Все научные и практические результаты, представленные в настоящей диссертационной работе, получены либо лично автором, либо при его непо-6
средственном участии. Он активно участвовал в теоретической разработке, технической реализации и экспериментальной апробации опубликованных методов. Автору лично принадлежат идеи и реализации метода симметрично-направленных спектроскопических измерений для выделения автофлуоресценции биотканей и метода оценки оптических свойств биоткани по спектру показателя ослабления света в области флуоресценции. Он является полноправным соавтором метода томографических измерений с применением направленного источника и точечного приемника света, а также конструкции экспериментальной установки для флуоресцентного ими-джинга. Автор принимал непосредственное участие в экспериментальных исследованиях на животных, а большинство модельных экспериментов были поставлены и проведены им лично.
Структура и объем диссертации
Традиционные методы томографии
В эмиссионной томографии зондирующее излучение не используется, поскольку искомая функция ( ) характеризует распределение источников излучения внутри исследуемого объекта. Однако проекции характеристиче ской функции в эмиссионной томографии также определяются выражением (1.1). При этом в некоторых случаях отдельно выделяют томографию сме шанного класса, в которой зондирующее излучение играет вспомогательную роль, а искомая функция ( ) описывает пространственное распределение вторичных источников излучения внутри исследуемого объекта.
Стационарная проекция функции имеет меньшую размерность, нежели сама функция (проекции двумерных распределений – одномерные, проекции трехмерных распределений – двумерные), поэтому восстановить функцию по одной проекции невозможно. Однако регистрация проекций для различных направлений позволяет получить набор данных, достаточный для восстановления. При этом процесс восстановления представляет собой численное решение интегрального уравнения (1.1). На сегодняшний день разработаны строгие математически подходы к постановке и решению обратной задачи, позволяющие получать практически полезные решения [6].
Важный частный случай обратной задачи томографии реализуется при прямолинейном распространении излучения. В этом случае выражение (1.1) представляет собой преобразование Радона. И. Радон доказал возможность восстановления функции ( ) по набору интегралов ( ) и вывел фор 21 мулы обращения [7]. Восстановление функции по ее проекциям, основанное на обратном преобразовании Радона, легко иллюстрируются простыми построениями (рис. 1.1) [8]. На сегодняшний день, данный метод применяется во всех традиционных методах биомедицинской томографии.
Применение томографии в биологии и медицине напрямую связано с возможностью зондирования биологических тканей проникающим излучением. В настоящее время известны томографические системы, позволяющие определять пространственное распределение множества физических величин внутри широкого класса объектов при самых различных видах воздействия на них. Наибольшее распространение получили рентгеновская, ультразвуковая, магнитно-резонансная и позитронно-эмиссионная томографии, которые стали незаменимым диагностическим инструментом в биомедицине.
Компьютерная томография (KT) [9, 10] – отображение пространственного распределение поглощения рентгеновского излучения в биотканях. С помощью КТ можно исследовать практически любой орган. Однако КТ не является неинвазивным методом диагностики вследствие сильного ионизирующего действия рентгеновского излучения.
Магнитно-резонансная томография (МРТ) [11, 12] – визуализация магнитных свойств биотканей и их насыщенности водородом, основанная на явлении ядерно-магнитного резонанса. Преимущество МРТ перед КТ состоит в высокой разрешающей способности, большей контрастности изображений и полной неинвазивности воздействия. Основным недостатком МРТ является очень высокая стоимость оборудования.
Ультразвуковая томография (УЗТ) [13, 14] – отображение пространственного распределения акустических неоднородностей биотканей. УЗТ безвредно для человека и применяется для диагностики мягких тканей. При этом УЗТ является удобным инструментом наблюдения движущихся объектов, благодаря использованию эффекта Доплера. Однако пространственное разрешение в УЗТ существенно меньше чем в МРТ. Позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) [15, 16] – визуализация пространственного распределения биологически активных соединений, меченных радиоизотопами. ПЭТ позволяет выявлять функциональные нарушения до появления морфологических изменений и считается неинвазивным методом диагностики. Однако возможности данного метода ограничены низким пространственным разрешением, высокой стоимостью оборудования и сложностью диагностической процедуры.
В современной биомедицине томографические исследования используются для своевременной диагностики опасных заболеваний и наблюдения эффективности лечения пациента. Кроме того, томография занимает особое место при ранней диагностике онкологических заболеваний, которые являются самой распространенной причиной смертности после сердечнососудистых болезней. По данным Всемирной Организации Здравоохранения (World Health Organization) в 2012 году из 14 миллионов выявленных случаев онкологических заболеваний 8 миллионов привели к летальному исходу [17].
Ключевой аспект в лечении онкологических заболеваний – раннее обнаружение биохимических и функциональных изменений в организме пациента, поскольку вероятность успешного лечения значительно возрастает при терапии на ранних стадиях развития рака. Различные методы томографии отличаются друг от друга, прежде всего тем, что они обеспечивают измерение различных физических свойств биотканей. Таким образом, все томографические методы являются взаимодополняющими, а не заменяющими друг друга (рис. 1.2) [18]. Однако традиционные методы томографии, обладающие высоким пространственным разрешением (КТ, МРТ), в состоянии выявить только морфологические изменения биотканей. ПЭТ позволяет обнаружить функциональные нарушения до появления морфологических изменений, но данный метод обладает низким пространственным разрешением.
Диффузионное приближение уравнения переноса излучения
В биологии и медицине применяются различные методы флуоресцентного имиджинга. Наибольшее распространение получили методы локальной визуализации: микроскопия и спектроскопия. Флуоресцентная микроскопия [49, 50] используется для исследования гистологических срезов биотканей, поскольку данный метод имеет существенные ограничения на глубину видения (0.01 – 0.5 мм для обычных срезов и до 10 мм для просветленных образ 32 цов). При этом микроскопия позволяет получать изображения биотканей с субклеточным пространственным разрешением (0.3 – 0.5 мкм для конфокальной микроскопии и 10 – 40 нм для наноскопии [50]). Флуоресцентная спектроскопия [51, 52] используется при эндоскопических исследованиях и не является методом визуализации в строгом смысле, поскольку в данном методе диагностическая информация содержится не в изображении флуоро-фора, а в спектральной интенсивности регистрируемого излучения. Для визуализации флуоресценции на уровне отдельных органов и целого организма используются специальные методы флуоресцентного имиджинга.
Методы флуоресцентного имиджинга на уровне организма позволяют получать двумерные изображения пространственного распределения флуо-рофора на поверхности и в глубине исследуемого объекта (молочная железа, мозг, лабораторные животные и др.). Основными элементами таких систем являются: источник света, который возбуждает флуоресценцию, приемник излучения (регистратор флуоресценции) и фильтр, отделяющий флуоресценцию от зондирующего излучения.
Для визуализации флуорофора на поверхности биоткани используются системы с отражательной геометрией (поверхностный имиджинг) [53, 54]. В данной конфигурации источник и приемник излучения расположены по одну сторону исследуемого объекта (рис. 1.6 A). Источник излучения, как правило, освещает исследуемый объект целиком, а флуоресценция регистрируется CCD камерой. Устройства поверхностного имиджинга отличаются простой конструкцией и обеспечивают хорошее пространственное разрешение при высокой скорости визуализации. Основным недостатком отражательной геометрии является низкая контрастность изображений, вследствие выраженной автофлуоресценции поверхности биоткани, что значительно затрудняет обнаружение флуорофора в глубине исследуемого объекта. Кроме того, чем дальше от поверхности находится флуоресцирующая область, тем сильнее размывается ее изображение. Поэтому отражательная конфигурация не используется для исследования глубинной флуоресценции. Рисунок 1.6. Отражательная (A) и проекционная (B) геометрии флуоресцентного имиджинга на уровне организма животного, а также изображения мыши, полученные в соответствующих конфигурациях [54]. Для визуализации распределения флуорофора в глубине исследуемого объекта используются системы с проекционной геометрией (проекционный имиджинг) [54 – 56]. В данной конфигурации исследуемый объект находится между источником и приемником излучения (рис. 1.6 B). При этом исследуемый объект, как правило, сканируется коллимированным излучением, а для регистрации флуоресценции используется CCD камера или точечный фотоприемник, который может сканировать исследуемый объект. Основным преимуществом проекционной геометрии перед отражательной является более высокая контрастность изображений флуорофора, поскольку автофлуоресценция освещенной поверхности существенно ослабляется после прохождения через исследуемый объект, что позволяет визуализировать глубинную флуоресценцию. Кроме того, размытие изображений в проекционном ими-джинге меньше зависит от положения флуоресцирующей области. При этом данный метод позволяет проводить нормировку на проходящий свет для сглаживания неоднородностей исследуемого объекта и корректной количественной оценки концентрации флуорофора. Недостатками проекционного имиджинга являются: повышенная сложность и стоимость оборудования, а также низкая скорость визуализации, обусловленные необходимостью регистрации и накопления слабых сигналов.
Однако поверхностный имиджинг и проекционная визуализация не дают полной информации о пространственном распределении флуорофора внутри исследуемого объекта, поскольку данные методы позволяют получать только суммарные двумерные изображения. Для восстановления пространственного распределения флуорофора и трехмерной визуализации применяется диффузионная флуоресцентная томография.
Диффузионная флуоресцентная томография (ДФТ) [57 – 63] – метод отображения пространственного распределения флуорофора внутри исследуемого объекта, основанный на решении обратной задачи томографии в условиях многократного рассеяния излучения. ДФТ является методом оптической томографии смешанного класса. Как и любой другой метод вычислительной томографии, ДФТ включает в себя два этапа исследований. Сначала проводятся томографические измерения: исследуемый объект многократно просвечивается зондирующим излучением для различных положений источника, а возбужденная флуоресценция регистрируется при всевозможных положениях приемника излучения. Далее решается обратная задача томографии по проведенным измерениям.
Основными элементами ДФТ систем являются: источник зондирующего излучения, который возбуждает флуоресценцию внутри исследуемого объекта, приемник, который регистрирует возбужденную флуоресценцию, фильтр, отделяющий флуоресценцию от зондирующего излучения, система сканирования для томографических измерений, а также система обработки данных для восстановления пространственного распределения флуорофора и отображения результатов. При этом для томографических измерений применяются две геометрии сканирования: круговая и плоскопараллельная (рис. 1.7).
Апробация спектрально-разрешенной диффузионной флуоресцентной томографии в численном эксперименте
Спектрально-разрешенная диффузионная флуоресцентная томография – метод восстановления пространственного распределения флуорофора в мутной среде по спектроскопическим измерениям для различных положений источника и приемника излучения. Идея СДФТ заключается в регистрации искажений спектра флуоресценции, которые позволяют определить расстояние флуоресцирующей области от источника и приемника света при известной зависимости ослабления оптического излучения от длины волны. Задача СДФТ сводится к системе линейных уравнений, при этом методы расчета весовой матрицы и алгоритмы решения СЛАУ переносятся из ДФТ.
Основным преимуществом СДФТ перед ДФТ является улучшение обусловленности обратной задачи томографии. При этом метод СДФТ позволяет проводить селекцию флуорофоров по спектру эмиссии. Однако спектральная селекция позволяет разделить только 2 или 3 флуоресцентных маркера. В частности, данный метод позволяет восстановить пространственное распределение флуорофора в мутной среде с выраженной автофлуоресценцией.
Задача выделения собственной флуоресценции биотканей является одной из основных научных проблем СДФТ, поскольку автофлуоресценция приводит к существенной ошибке при восстановлении пространственного распределения флуорофора. Спектральная селекция позволяет выделять собственную флуоресценцию среды, однако требует априорной информации о спектре автофлуоресценции и существенного увеличения количества томографических измерений. Для сокращения числа измерений и выделения автофлуоресценции с неопределенным спектром эмиссии можно использовать оригинальный метод симметрично-направленных измерений.
Разработанный метод симметрично-направленных спектроскопических измерений основан на регистрации спектра возбужденной флуоресценции до и после взаимной перестановки источника и приемника в каждой точке сканирования исследуемого объекта. При этом полагается, что собственная флуоресценция среды вносит одинаковые искажения в симметричные проекции, поскольку основным источником автофлуоресценции является освещенная поверхность исследуемого объекта. Соответственно, данный метод не позволяет полностью выделить собственную флуоресценцию исследуемого объекта, однако исключает наиболее выраженные источники автофлуоресценции. Кроме того, симметрично-направленные измерения улучшают обусловленность обратной задачи томографии.
Основным недостатком метода симметрично-направленных измерений и других модификаций СДФТ является необходимость экспериментального измерения спектров поглощения и рассеяния света в исследуемом объекте для корректного вычисления функции размытия точки, поскольку полная аппроксимация этих параметров по литературным данным может приводить к существенной ошибке при восстановлении пространственного распределения флуорофора. Однако транспортный показатель рассеяния света в биотканях, как правило, имеет простую степенную зависимость от длины волны, поэтому допускает эвристическую аппроксимацию. В этом случае спектр показателя поглощения можно восстановить по измеренному ослаблению белого света для заданного положения источника и приемника. Предложенный метод оценки оптических свойств мутной среды не позволяет восстановить исходные спектры поглощения и рассеяния света, однако обеспечивает аппроксимацию этих показателей таким образом, чтобы они соответствовали исходному спектру ослабления света в исследуемом объекте.
В целях апробации разработанного метода симметрично-направленных измерений был проведен численный эксперимент по сканированию автофлу-оресцирующей биоткани источником лазерного излучения и спектрометром, а также дополнительное измерение ослабления белого света в исследуемом объекте для оценки спектров показателей поглощения и рассеяния. Результаты решения обратной задачи томографии по симметрично-направленным спектроскопическим измерениям показали возможность определения положения и размеров 2 – 4 мм флуоресцирующей области в мутной среде толщиной 10 – 14 мм с точностью 0.5 мм даже в том случае, когда уровень собственной флуоресценции среды сравним с уровнем флуоресценции маркера, а спектр автофлуоресценции неизвестен. Кроме того, полученные результаты показали, что использование оценки оптических свойств объекта по измеренному спектру ослабления света в области флуоресценции приводит лишь к незначительному размытию восстановленного распределения флуо-рофора даже при высокой погрешности аппроксимации транспортного показателя рассеяния света.
Мониторинг биологических процессов в реальном времени
Результаты локализации маркированной опухоли в теле лабораторного животного с использованием стандартной СДФТ (рис. 4.13 B) и метода симметрично-направленных измерений (рис. 4.13 C) подтвердили результаты экспериментальных исследований модельных объектов и продемонстрировали существенное увеличение точности восстановления пространственного распределения флуоресцентного маркера при использовании симметричных проекций, которые позволяют выделять автофлуоресценцию исследуемого объекта. При этом проведенная верификация полученных результатов после хирургического удаления опухоли показала, что погрешность определения положения и размеров маркированной опухоли не превысила линейный размер вокселя восстановления [90, 107]. Таким образом, результаты апробации разработанного метода симметрично-направленных измерений на лабораторных животных демонстрируют эффективность данного метода для проведения биомедицинских исследований in vivo.
Для апробации разработанных методов томографических измерений в задаче восстановления пространственного распределения флуоресцентного маркера в биотканях была создана экспериментальная установка для флуоресцентного имиджинга лабораторных животных, которая комбинирует отражательную и проекционную конфигурацию источника и приемника света, а также реализует системы для ДФТ и СДФТ.
Для реализации метода проекционной флуоресцентной визуализации в экспериментальной установке используется синхронное сканирование исследуемого объекта источником лазерного излучения и ФЭУ. При этом многократное синхронное сканирование флуоресцирующей области для различных смещений лазера относительно оси ФЭУ позволяет реализовать разработанный метод томографических измерений на основе проекционного имиджин-га. Апробация данного метода на биологических фантомах и лабораторных животных показала, что проекционная визуализация является превосходным инструментом для мониторинга различных процессов, которые сопровождаются изменением флуоресценции исследуемого объекта, однако полученные изображения будут размытыми вследствие рассеяния света, поэтому для корректной локализации флуоресцирующей области необходимо использовать томографические измерения и учитывать функцию размытия точки. Результаты восстановления пространственного распределения флуоресцентного маркера показали эффективность реализованного метода ДФТ для биомедицинских исследований и продемонстрировали высокую точность решения обратной задачи томографии при хорошем пространственном разрешении флуоресцентных изображений.
Для реализации метода СДФТ, в экспериментальной установке используется синхронное сканирование исследуемого объекта источником лазерного излучения и спектрометром. В ходе сканирования источник излучения и спектрометр располагаются соосно, при этом спектроскопические измерения проводятся до и после разворота исследуемого объекта на 180 вокруг вертикальной оси для получения симметричных проекций. При этом для измерения спектра ослабления света в исследуемом объекте и последующей оценки его оптических свойств к экспериментальной установке подключается ксеноновая лампа. Результаты апробации метода СДФТ на модельных средах и лабораторных животных показали существенное увеличение точности восстановления пространственного распределения флуоресцентного маркера при использовании симметричных проекций, которые позволяют выделять автофлуоресценцию исследуемого объекта и продемонстрировали эффективность разработанного метода симметрично-направленных спектроскопических измерений для биомедицинских исследований.
Основные результаты, полученные в ходе выполнения настоящей диссертационной работы, могут быть сформулированы следующим образом:
1. Разработан метод томографических измерений на основе проекционной флуоресцентной визуализации для восстановления пространственного распределения флуорофора в биотканях по набору двумерных проекций, полученных в ходе многократного синхронного сканирования области флуоресценции в плоскопараллельной геометрии при различных смещениях направленного источника света относительно оси точечного приемника флуоресценции. Результаты апробации разработанного метода показали возможность определения положения и размеров 2 – 4 мм флуоресцирующей области с точностью 0.5 – 1 мм в мутной среде толщиной 10 – 14 мм, если дисперсия шума не превосходит 10% от уровня сигнала на каждой проекции. Использование данного метода для исследования лабораторных животных позволяет оптимизировать томографические измерения и сократить количество неинформативных данных по сравнению со стандартной диффузионной флуоресцентной томографией.
2. Разработан метод симметрично-направленных спектроскопических измерений на основе спектрально-разрешенной диффузионной флуоресцентной томографии с плоскопараллельной геометрией сканирования, который улучшает обусловленность обратной задачи и позволяет восстановить распределение флуоресцентного маркера в присутствии автофлуоресценции исследуемого объекта с неизвестным спектром эмиссии. Результаты апробации разработанного метода в численном эксперименте продемонстрировали возможность локализации маркированной области размером от 2 мм с точностью до 0.5 мм в мутной среде толщиной 10 – 14 мм, когда уровень собственной флуоресценции среды сравним с интенсивностью флуоресценции маркера, а дисперсия шума не превосходит 10% от уровня флуоресцентного сигнала.
