Содержание к диссертации
Стр.
ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 6
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 10
ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ГЕНЕТИЧЕСКИХ
ЭФФЕКТАХ НИЗКИХ ДОЗ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ 17
-
Медико-генетические эффекты малых доз ионизирующего излучения 17
-
Особенности биологического действия малых доз 18
-
Оценка диапазона малых доз 18
-
Зависимость «доза-эффект» для цитогенетических эффектов 19
-
Нестохастические эффекты малых доз 21
-
Стохастические эффекты малых доз 25
1.3. Цитогенетический статус детей, проживающих в условиях низкодозовых
радиационных воздействий 28
1.3.1. Онтогенетические эффекты у новорожденных 28
-
Онтогенетические эффекты у детей, родители которых подверглись радиационному воздействию 30
-
Цитогенетические эффекты у детей, проживающих на загрязненных территориях 32
-
Радиационно-индуцированная нестабильность генома 36
-
Апоптоз и его роль в поддержании гомеостаза организма 40
-
Мутантные Т-хелперы 45 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 51
-
Объекты исследования 51
-
Цитогенетические методы исследования 53
-
Классический цитогенетический анализ 53
-
TCR-тест 56
-
Анализ экспрессии антигена FAS/AP0-1 58
-
Микроядерный тест 58
2.3. Методы антропометрических исследований 60
-
Оценка частоты «малых стигм» 60
-
Соматотипирование 61
-
Клинико-лабораторные методы исследования 63
-
Методы статистической обработки данных 64
-
Характеристика мест проживания обследованного контингента 64 ГЛАВА 3. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОГО СТАТУСА ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ, ПРОЖИВАЮЩИХ В РАЙОНАХ С РАЗНОЙ РАДИОЭКОЛОГИЧЕСКОЙ ОБСТАНОВКОЙ 68
-
Частота аберраций хромосом у детей и подростков, проживающих в условно экологически благополучных районах Беларуси 69
-
Зональные особенности цитогенетического статуса детей и подростков Беларуси 72
-
Временные особенности цитогенетического статуса детей и подростков, проживающих в районах Брестской области с особыми климато-географическими характеристиками 78
-
Состояние генетического аппарата соматических клеток и некоторые характеристики радиационной обстановки 84 ГЛАВА 4. УРОВЕНЬ СОМАТИЧЕСКИХ МУТАЦИЙ У ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ, ПРОЖИВАЮЩИХ НА РАДИОАКТИВНО ЗАГРЯЗНЕННЫХ ТЕРРИТОРИЯХ 90
-
Уровень мутантных Т-хелперов у детей и подростков, проживающих на радиоактивно загрязненных территориях 90
-
Уровень FAS/APO-1 экспрессирующих клеток у детей и подростков, проживающих в радиоактивно загрязненных районах 98
ГЛАВА 5. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИИ СТАТУС ДЕТЕЙ И
ПОДРОСТКОВ, ПРОЖИВАЮЩИХ В УСЛОВИЯХ ХРОНИЧЕСКОГО
НИЗКОДОЗОВОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ. 102
-
Молекулярно-генетические характеристики периферической крови детей и подростков, проживающих в населенном пункте Ольманы 102
-
Молекулярно-генетические характеристики периферической крови детей и подростков, проживающих в населенном пункте Вулька-2 111 ГЛАВА 6. АНТРОПОМЕТРИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ, ПРОЖИВАЮЩИХ В УСЛОВИЯХ ПОВЫШЕННОГО МУТАГЕННОГО ДАВЛЕНИЯ 123
-
Особенности фенотипа детей и подростков, проживающих в зонах с разным уровнем радиоактивного загрязнения 123
-
Особенности распределения соматотипов у пациентов, проживающих в районах с повышенной антропогенной нагрузкой 126 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 134 ВЫВОДЫ 138 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 149 ПРИЛОЖЕНИЕ 159
5 ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
АК - аберрантные клетки;
АлАт - аланинаминотрансфераза;
АсАт- аспартатаминотрансфераза;
ACT - астенический соматотип;
АХ - атипичные хромосомы;
ДНР - двунитевые разрывы;
ДСТ - дигистивный соматотип;
КХ - кольцевые хромосомы;
ЛПЭ - линейная энергия передачи;
МСТ - мышечный соматотип;
ОБЭ - относительная биологическая эффективность;
ОФ — одиночные фрагменты;
ПП - полиплоидные клетки;
ПФ — парные фрагменты;
TCR - Т-клеточный рецептор;
ТСТ - торакальный соматотип;
ФГА - фитогемааглготинин;
ХА — хромосомные аберрации;
ЧАЭС - Чернобыльская атомная электрическая станция;
ЩЖ - щитовидная железа.
Введение к работе
Человек живет в постоянном взаимодействии с окружающей средой. Как правило, на него одновременно действует множество разных факторов (физические, химические, социально-психологические и пр.), которые в сочетании могут существенно менять биологический эффект друг друга [30,68]. Установлено [24,98], что хроническое воздействие многих широко распространенных токсикантов модифицирует эффект ионизирующих излучений. Поэтому даже малые интенсивности этих факторов при сочетанном действии могут привести к значимым эффектам. Генетический статус, модифицирующее влияние ряда генотипических и экологических факторов корректируют характер и степень биомедицинских последствий лучевого, химического и комбинированного поражений.
Помимо значительного техногенного химического загрязнения территории республики, при ликвидации последствий Чернобыльской аварии в большом количестве использовался свинец, который при высокой температуре в реакторе, возгоняясь, поступал в воздух и разносился на большие территории. Это привело к повышенному региональному загрязнению свинцом атмосферного воздуха и почвы и более высокому, по сравнению с фоновым, содержанию свинца в биосубстратах детей и взрослого населения в Могилевской, Гомельской и Брестской областях Беларуси [24]. Все это привело к усложнению экологической ситуации, степень выраженности которого варьирует в широких пределах. Таким образом, в настоящее время мы имеем дело с комплексным воздействием на организм человека, включающим физические, химические, психосоциальные компоненты, суммарно обозначаемые как «чернобыльский фактор».
Нормальное функционирование всех клеточных систем обеспечивается за счет целостности генома и поддерживается балансом обновления и гибели клеток посредством апоптоза. Мутагенные факторы, дестабилизируя геном, способны существенно изменить его состояние и, тем самым, привести к срыву этих процессов. Вызванное нарастающим антропогенным давлением нарушение стабильности генома подразумевает сохранение в ряду клеточных генераций повышенного уровня альтераций. Предполагается возможность передачи нестабильности генома потомкам у человека [17]. При быстро меняющейся экологической ситуации, как это имело место в случае Чернобыльской катастрофы, организм не успевает адаптироваться к новым условиям. Следствием этого может быть срыв адаптации и формирование патологии.
Детская часть популяции является наиболее чувствительной в отношении мутагенных эффектов группой населения, что обусловлено, с одной стороны, высокой пролиферативной активностью растущего организма, с другой - несбалансированностью его формирующихся систем и органов [3,4,17,55]. Ухудшение здоровья детей, проживающих в условиях хронического техногенного давления (включающего и повышенный фон ионизирующего излучения), выявляется на разных уровнях организации от состояния ядерного и мембранного аппарата клетки до соматического статуса целостного организма.
Цитогенетические исследования детей и подростков, проживающих на загрязненных территориях Беларуси, России и Украины показывают, что и через достаточно большой период времени после аварии на ЧАЭС сохраняется повышенный уровень маркеров радиационного воздействия (дицентрические и кольцевые хромосомы), а также регистрируется общая нестабильность генома [18,83].
В то же время, в ряде работ указывается, что у детей, подвергшихся низкодозовому радиационному воздействию, отмечаются изменения некоторых биохимических показателей крови. Так, наблюдается достоверное снижение прямого и увеличение свободного билирубина в сыворотке по отношению к контролю, что может быть вызвано наблюдаемыми достоверными изменениями некоторых показателей функции печени и минерального обмена по отношению к контролю. Выявлена статистически достоверная обратная корреляционная связь между уровнем общего билирубина, аспаратаминотрансферазы (АсАТ), аланинаминотрансферазы (АлАТ) в сыворотке относительно контроля [91,112]. Среди сдвигов основных биохимических показателей у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС наблюдается увеличение активности аминотрансфераз АсАТ и АлАТ [94]. Кроме того, у детей и подростков, проживающих в условиях повышенного мутагенного давления, отмечаются изменения функционального состояния системы крови, некоторых параметров гормонального статуса, а также морфосоматического статуса организма.
Для контроля состояния организма человека при изменениях в среде его обитания, в качестве одного из информативных методов может быть использована оценка состояния гемопоэза. Это связано с тем, что кроветворение, являясь функциональной системой, объединяющей работу многих систем организма, прямо или косвенно реагирует на воздействие неблагоприятных факторов окружающей среды. Ранняя реакция системы крови на ухудшающиеся экологические условия среды обитания человека может оказаться полезной для констатации факта существования экологического неблагополучия еще до формирования тех или иных заболеваний и быть одним из индикаторов адаптации организма к меняющейся экологической ситуации. Так, ряд авторов указывает на значительную частоту эозинофилий у детей, проживающих на территориях Гомельской и Могилевской областей с уровнем загрязнения почвы радионуклидами 5-15 и 15-40 Ки/км , с их явным преобладанием даже в зоне с малым уровнем загрязнения [26].
Несмотря на то, что в настоящее время накоплено много данных о вредных эффектах, связанных с антропогенным давлением на человека, они требуют дальнейшего анализа и систематизации. Важной проблемой является также оценка сочетанных эффектов радиационно-химических взаимодействий, а также оценка их стабильности в отдаленные сроки. Взаимосвязь и взаимозависимость цитогенетических, молекулярно-
9 генетических, а также фенотипических изменений, вызванных мутагенными воздействиями (за исключением онкопатологии), в настоящее время являются неизученными. В связи с этим целью работы явилось изучение цитогенетического и молекулярно-генетического статуса детей и подростков, проживающих на территориях с разным уровнем радиационного загрязнения, а также выявление его взаимосвязи с изменением некоторых параметров функционально-физиологического статуса обследованных.
10 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы диссертации
Одним из следствий аварии на Чернобыльской АЭС стало радиоактивное загрязнение обширных территорий, на которых проживают, и, следовательно, подвергаются постоянному хроническому радиационному воздействию, миллионы людей. Проведенные ранее исследования свидетельствуют о повышенном уровне цитогенетических нарушений в соматических клетках людей, проживающих на загрязненных в результате аварии на Чернобыльской АЭС территориях. Дети - наиболее радиочувствительная часть населения, поэтому изучение особенностей цитогенетического и молекулярно-генетического статуса проживающих на загрязненных территориях Беларуси детей и подростков является особенно актуальным. В ходе проведения эпидемиологических исследований установлено, что население радиоактивно загрязненных территорий Беларуси, Украины и России характеризуется повышенным уровнем общей заболеваемости. И хотя пока отсутствуют прямые доказательства связи повышенного уровня мутагенеза в соматических клетках с состоянием здоровья населения, накапливается все больше данных о вкладе соматических мутаций в развитие таких заболеваний, как диабет, болезни сердца, атеросклероз, эмфизема легких, онкологические заболевания и др. Активность адаптационно-регуляторных механизмов также определяется состоянием генетического аппарата клетки. Компенсаторные механизмы организма обеспечивают его адаптацию в меняющихся экологических условиях в пределах нормы реакции. В случае ее срыва, развитие дезадаптационного синдрома ведет к нарушению целостности всех систем организма и послужить основой формирования патологии. В то же время, по данным ВОЗ, до 60% населения на протяжении жизни приобретают заболевания с выраженной генетической компонентой. Обусловленное нарушением экологического равновесия нарастание мутационного давления увеличивает риск такого рода патологий. Отсюда следует, что данные о состоянии генома связаны с состоянием здоровья населения, подвергшегося или продолжающего подвергаться воздействию хронического низкодозового облучения, и имеют важное значение для долгосрочного прогнозирования возможного влияния этого комплекса факторов на состояние здоровья населения.
Связь работы с крупными научными программами, темами
Настоящая работа выполнена на кафедре биологии человека Международного Государственного экологического университета имени А.Д, Сахарова и в лаборатории радиационной цитогенетики Научно-исследовательского клинического института радиационной медицины и эндокринологии МЗ РБ в рамках НИР: «Изучение генетической нестабильности в условиях низкодозового радиационного воздействия», 15.03. - 15.12.1999 г., № Госрегистрации 19993530, «Цитогенетические механизмы хронического радиационного воздействия», 15.03. - 15.12.1999 г., № Госрегистрации 19993529.
Цель исследования
Целью диссертационной работы являлось изучение цитогенетического и молекулярно-генетического статуса детей и подростков, проживающих на территориях с разным уровнем радиационного загрязнения, а также * выявление его взаимосвязи с изменением некоторых параметров функционально-физиологического статуса обследованных.
Задачи исследования
1. Оценить частоту цитогенетических нарушений, а также уровень генных мутаций на примере локуса TCR у детей и подростков, проживающих на территориях, загрязненных в результате аварии на ЧАЭС.
Определить уровень экспрессии FAS/APO-1 антигена как показателя активности апоптоза на лимфоцитах периферической крови у детей и подростков, проживающих в районах с разным уровнем радиационного загрязнения.
Выявить взаимосвязь цитогенетических нарушений в лимфоцитах периферической крови с гематологическими и биохимическими характеристиками системы крови.
Исследовать взаимосвязь между генетической и фенотнпической компонентами у обследованной группы детей.
Объект и предмет исследования
Объект исследования — дети и подростки, проживающие в условиях мутагенного давления с выраженной радиационной компонентой и в условно чистой в радиоэкологическом отношении среде.
Предмет исследования - состояние цитогенетического аппарата соматических клеток (лимфоцитов) и его взаимосвязь с изменениями некоторых гематологических и биохимических показателей системы крови, а также фенотипические особенности лиц, подвергшихся воздействию хронического низкодозового облучения.
Гипотеза
Повышенный уровень цитогенетических нарушений в соматических клетках проживающих на радиоактивно загрязненных в результате аварии на ЧАЭС территориях детей и подростков связан с рядом фенотипических изменений, включая сдвиги популяционных средних в отношении гемато-биохимических показателей. ІЗ Методология и методы исследования
Методологическую основу работы составил подход, основанный на сочетании цитогенетических, молекулярно-генетических, клинико-биологических и антропогенетических методов.
Для решения поставленных задач использовались следующие методики:
Классический цитогенетический анализ [99].
Микроядерный тест [177].
Проточная цитофлуориметрия (TCR-тест, определение уровня экспрессии FAS/APO-1 антигена) [172].
Анализ частоты малых стигм [13].
Антропометрические исследования [14,27,81].
Статистический анализ результатов осуществлялся с помощью программ "Microsoft ЕхсеГ2000", "Statistica 6.0.'*. Собранные результаты суммированы в базы данных с помощью программы Microsoft Access [11,84].
Научная новизна и значимость полученных результатов
Проведенные исследования впервые позволили выделить генетические и фенотипические маркеры, отражающие степень мутационного давления в постчернобыльской Беларуси, обусловленного в значительной степени радиационным фактором, а также оценить его влияние на индивидуальную радиочувствительность.
Впервые показана стабильность цитогенетических изменений у детей и подростков в отдаленный период после аварии на ЧАЭС, а также дана оценка связанных с ними фенотипических эффектов, выражающихся, в частности, в изменении частоты стигм обследованных и своеобразии формирования соматотипов.
14 Впервые выявлена взаимозависимость состояния цитогенетического аппарата и гормональных и биохимических особенностей системы крови обследованных детей и подростков.
Практическая значимость полученных результатов
Выявленные изменения состояния цитогенетического аппарата могут быть использованы в качестве критериев безопасной жизнедеятельности человека в условиях нарастающего мутагенного давления. Учитывая сложную экологическую обстановку, сложившуюся на территории Республики Беларусь в постчернобыльский период, представляется важным выявить наиболее пострадавший контингент, который подлежит углубленному обследованию и постоянному контролю.
Отмеченные изменения фенотипа могут быть использованы при формировании групп экологического риска.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
Анализ изменения во времени частоты цитогенетических нарушений у детей и подростков, проживающих на загрязненных в результате аварии на ЧАЭС территориях, свидетельствует о длительном сохранении повышенной частоты аберраций хромосом (повышение частоты радиационных маркеров, а также общего числа аберраций и аберрантных клеток), особенности которых определяются факторами внешней среды.
У обследованного контингента обнаружена повышенная частота мутаций по TCR-генам, а также повышенная частота экспрессии индикатора апоптоза FAS/APO-1 антигена. Это, вероятно, указывает на взаимосвязь между радиационно индуцируемыми мутациями и активацией деструктивных процессов в популяциях соматических клеток.
Интегральная оценка влияния хронического радиационного воздействия на детей и подростков позволила выявить наличие комплекса морфо-функциональных изменений, которые могут рассматриваться как
15 адаптационно-компенсаторные сдвиги на молекулярно-биохимическом и клеточном уровнях, проявляющихся на соматическом (организменном) уровне в нарастании количества стигм и своеобразии формирования соматотипов.
Личный вклад соискателя
Личный вклад соискателя выразился в выполнении основной экспериментальной части диссертации, создании компьютерной базы данных, статистическом анализе полученных данных. Научными руководителями была оказана помощь в выборе темы диссертации, ее методическом решении, обработке и обсуждении результатов исследования.
Апробация результатов диссертации
Основные результаты исследования были апробированы на следующих научных конференциях:
IX Международная научно-практическая конференция «Экология человека в постчернобыльский период», 27-29 сентября 2001 г., Минск; X Международная научно-практическая конференция «Экология человека в постчернобыльский период», 25-27 сентября 2002 г., Минск;
Международная , конференция «Генетические последствия чрезвычайных радиационных ситуаций», Российская Федерация, Москва, 10-13 июня 2002 года;
Международная конференция ведущих специалистов, молодых ученых и студентов «Сахаровские чтения 2002 года: экологические проблемы XXI века», Минск 17-21 мая 2002 года;
Международная конфе
III Съезд по радиационным исследованиям (радиобиология и радиоэкология). Киев, 21-25 мая 2003 года;
II Международная научно-практическая конференция «Медицинские и экологические эффекты ионизирующего излучения». Северск-Томск, 20-21 мая 2003 года;
Международная конференция ведущих специалистов, молодых ученых и студентов «Сахаровские чтения 2005 года: экологические проблемы XXI века», Минск 20-21 мая 2005 года.
Опубликованность результатов
По материалам диссертации опубликовано 10 статей, из них 4 в журналах, 3 в сборниках статей, 3 в материалах конференций и съездах и 7 тезисов докладов. Всего 17 публикаций, общее количество страниц опубликованных материалов - 40. Из них статей без соавторов - 2.
Струїсгура и объем диссертации
Диссертация состоит из перечня условных сокращений, введения, общей характеристики работы, аналитического обзора литературы, методики исследования, четырех глав собственных исследований, заключения, списка литературы и приложения. Диссертация изложена на 161 страницах машинописного текста, иллюстрирована 18 рисунками, 26 таблицами. Приложение включает 3 бланка, занимает 3 страницы. Список использованных источников включает 179 работ (115 отечественных и 64 зарубежных).
