Введение к работе
Актуальность темы. Эволюция млекопитающих и, в наибольшей степени, самых интеллектуальных представителей этого касса - гоминид была сопряжена с быстрым структурно-функциональным усложнением головного мозга, особенно его высших отделов, в частности неокортек-са. Следствием этого усложнения явилось то, что функциональное развитие мозга не ограничивается периодом онтогенеза, а продолжается и после рождения, причем длительность этого периода находится в прямой зависимости от сложности и разнообразия функций ЦНС конкретного вида. Головной мозг взрослых особей млекопитающих в высшей степени радиорезистентен, тогда как мозг эмбриона является одной из наиболее радиочувстительных тканей организма и даже небольшие дозы ионизирующего излучения приводят к тяжелым поражениям ЦНС. У млекопитающих сформировалась пожалуй наиболее совершенная система защиты развивающегося эмбриона от факторов окружающей среды в виде внутриутробного развития. Однако, эта система оказывается совершенно неэффективной в отношении ионизирующего излучения, с которым млекопитающим не приходилось сталкиваться в ходе их эволюции до середины нынешнего века, когда радиация стала одним из новых антропогенных факторов, обладающим выраженным генетическим, цитотоксиче-ским, тератогеным и канцерогенным действием (Mole, 1990).
Пренатальный период развития млекопитающих характеризуется активным протеканием процессов клеточной пролиферации и диффе-ренцировки, нарушение равновесия между которыми может приводить к тяжелым последствиям для организма (Ярмоленко, 1988). Характер эффекта пренатального облучения существенно зависит от стадии развития организма и каждой конкретной ткани в момент облучения. В результате радиационного воздействия на плод после рождения развивается дефицит массы головного мозга, сопровождающийся широким спектром нарушений высшей нервной деятельности и поведения (Right, 1959; Пи-онтковсий, 1964). Несмотря на высокую пластичность и способность к восстановлению ЦНС, функциональные нарушения в облученном мозге приматов сохраняются в течение длительного времни (Brizze, 1986). Степень поражения мозга зависит от вида излучения, его дозы и от периода внутриутробного развития. Нейробласты в нервной системе эмбриона крысы появляются на 9-й день внутриутробного развития (у че-
ловека - с 25-го дня) и сохраняются еще некоторое время после рождения. Именно в этот период нервная система чувствительна к воздействию радиации (Пионтковский, 1964). У грызунов наиболее серьезные последствия наблюдаются после обучения 15-18-дневных эмбрионов, а у человека в течение 8-15 недель беременности (Kopermann, 1980). При этом, почти все врожденные аномалии, возникающие в результате пренатального облучения грызунов, можно выявить и в случае облучения человека, если учитывать эмбриологически сравнимые периоды беременности (Rugh, 1965). Так, у крыс, облученных в плодный период, после рождения выявляются тяжелые дефекты переднего мозга: микроцефалия, гетеротопия, отсутствие мозолистого тела (Hicks, 1966), подавление двигательной активности (Werboff, 1961) и отставание в способности к обучению (Куопо, 1981). У человека, микроцефалия и задержка умственного развития возникали у большинства детей, получивших относительно высокие дозы рентгеновского излучения на ранних стадиях внутриутробного развития (Dobbing, 1973). Наиболее часто встречающимися последствиями внутриутробного облучения детей в результате атомной бомбардировки Хиросимы и Нагасаки также являются микроцефалия и умственная отсталость (Otake, 1984; Schull, 1986). Показано, что частота умственной отсталости у людей, облученных в период 8-15 недель беременности линейно увеличивается с ростом дозы излучения (Otake, 1984; Schull, 1986). При этом, максимальная радиочувствительность мозга соответствует периоду внутриутробного развития, когда у человека происходит формирование и дифференцировка переднего мозга, а содержение ДНК этого отдела увеличивается логарифмически параллельно пролиферации нейробластов (Dobbing, 1973; Mole, 1987).
В основе структурно-функциональных нарушений эмбрионального мозга лежит пострадиационная гибель клеток и, в первую очередь, нейробластов. В мозге пренатально облученных (ПНР) животных наблюдается опустошение слоев коры, нарушение колоночной организации нейронов, а также хаотическое и избыточное ветвление их отростков. Так, через 6 часов после рентгеновского облучения эмбрионов грызунов на 18-й день беременности наблюдалось значительное количество пикноти-ческих ядер нейробластов в коре переднего мозга и наружном гранул-лярном слое мозжечка (Bruckner, 1980). Аналогичные данные получены и в случае нейтронного облучения крыс, причем пикнотические клетки обыли отмечены уже через 2 ч после облучения (Antal, 1986). У низших
приматов, облученных во втором триместе беременности, также отмечено значительное уменьшение числа нейронов, а также отростков дендри-тов в гнппокампе (Brizze, 1980). После рождения, во всех отделах ПНО животных отмечены нарушения показателей, характеризующих процессы созревания мозга - потеря плотности тифоидного вещества, снижение плотности миелина, дезориентация клеток и отростков (Konermann, 1987). Глубина этих нарушений зависит от дозы облучения.
Биохимические исследования мозга ПНО животных свидетельствуют о наличии тонких функциональных нарушений. Прежде всего показано, что у облученных грызунов и приматов после рождения в коре и мозжечке отмечено повышение содержания ацетилхолина (Valcana, 1974), а также активности холинэргических и ряда других ферментов (Weber 1979; Kaack, 1980). Возможно, что этот феномен, также как и кратковременный всплеск метаболизма дезоксиглюкозы (Heinzmann, 1986), носит компенсаторный характер. Вместе с тем, в мозге 3-х недельных ПНО мышей синтез кислоторастворимой фракции ядериных белков оказался подален на 40%, а с помощью двумерного электрофореза у них было выявлено существенное снижение содержания гистоновых и ряда негастоновых белков (Fonagy, 1985). При этом оказалось, что способность синтезировать белки в бесклеточной системе и аминокислотный пул в мозге 3-х недельных ПНО мышей существенно не отличаются от контроля, тогда как аминоацилирование тРНК у них снижено на 40% по сравнению с контролем и является, по-видимому, лимитирующей стадией белкового синтеза в этой ткани. Эти данные находятся в соответствии с наблюдениями о параллельном угнетении белкового синтеза и аминоацилирования тРНК в облученных тимоцитах крыс (Smith, 1964).
Имеются лишь единичные наблюдения о характере генной экспрессии у ПНО животных. Так, синтез суммарной ядерной РНК в мозге 3-х недельных крыс, подвергнутых гамма-нейтронному ПНО, не отличался от контроля (Fonagy, 1985). Усиление экспрессии гена теплового шока hps70, а также прото-онкогенов c-fos и с-тус наблюдали в течение нескольких часов после гамма облучения 8-дневных эмбрионов мыши (Higo, 1989).
Таким образом, феноменология нарушений головного мозга на структурно-функциональном и клеточно-биохимическом уровнях у пренатально облученных животных описана достаточно полно. Однако,
вплоть до настоящего времени практически отсутсвуют работы, в которых бы направленно и комплексно исследовались молекулярно-биологи-ческие аспекты пострадиационных поражений мозга. В частности, остается невыясненным вопрос являются ли выжившие после облучения нервные клетки функционально полноценными, то есть способны ли они обеспечить нормальный уровень экспрессии генов, продукты которых участвуют в процессах дифференцировки и функционирования нервных клеток.
Цель и задачи иследования.
Целью настоящего исследования явилось изучение молекулярных механизмов радиационной гибели эмбриональных нейробластов и ее роли в нарушениях функциональной активности головного мозга пренатально облученных крыс.
Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:
-
Изучить изменения динамики клеточных популяций отделов головного мозга в пострадиационный период и оценить структурно-функциональное состояние головного мозга крыс, подвергнутых пренатальному гамма и гамма-нейтронному облучению на 17-й день внутриутробного развития.
-
Охарактеризовать пострадиационный тип клеточной гибели облученных нейробластов (апоптоз, некротический, смешанный).
-
В период массовой гибели облученных нейробластов головного мозга изучить динамику экспрессии известных генов, участвующих в реализации программы клеточной гибели по типу апоптоза в тканях млекопитающих.
-
Конструировать клонотеки кДНК головного мозга 17-дневных эмбрионов контрольных и in utero облученных крыс и с помощью истощающей гибридизации получить в клонированной форме последовательности генов, экспрессия которых активируется в период массовой гибели облученных нейробластов.
-
На основании анализа изменений экспрессии генов в облученных нейробластах в период их массовой гибели, оценить гомологию с известными генетическими программами реализации гибели полученными на других клеточных системах.
'6. Изучить нарушения динамики экспрессии основных групп клеточных генов (тканеспецифических, кодирующих ферменты основных метаболических путей клетки, прото-онкогенов) в головном мозге и его
отделах у пренатально облученных крыс в период 1 день - 1.5 года после рождения.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Пренаталыюе облучение вызывает массовую гибель эмбриональных нейробластов по типу агюнтоза.
-
Радиационная индукция апоптоза в эмбриональных нейробластах сопровождается снижением уровня мРНК генов, кодирующих структурные белки и ферменты основных метаболических путей, и активацией экспрессии широкого спектра регуляторных генов.
-
Апоптоз в пренатально облученных нейробластах реализуется по р53-зависимому пути, характерному для радиационной гибели тимоцитов.
-
В ранний постнатальный период, соответствующий завершению функционального созревания головного мозга (2-4 недели после рождения), в мозге облученных крыс происходит компенсаторное усиление экспрессии всех исследованных групп клеточных генов.
-
В отдаленные сроки после облучения (1.5 года) в коре головного мозга in utero облученных крыс экспрессия ряда ключевых генов существенно снижена по сравнению с контрольными животными.
Научная новизна работы.
Впервые использован комплексный подход для изучения структурно-функциональных и молекулярно-биологических нарушений в головном мозге пренатально облученных крыс. Временной интервал наблюдений охватывает продолжительный период жизни животных с 17-го дня эмбрионального развития до 1.5 лет после рождения. Доказано, что пібель in utero облученных клеток головного мозга реализуется по типу апоптоза. Изучены пострадиационные нарушения экспрессии более 30 видов мРНК, являющихся транскриптами основных классов клеточных генов. У в мозге in utero облученных крыс в ранний постнатальный период описан феномен компенсаторного усиления экспрессии большой группы клеточных генов. Клонированы последовательности новых, ранее неизвестных генов, экспрессия которых активируется в период массовой гибели облученных нейробластов.
Научно-практическая значимость работы.
Исследование относится к разряду теоретических работ. В настоящее время значимость исследований в области последствий облучения in utero особенно велика в связи с широким клиническим исполь-
зованием различных видов излучений, увеличением радиационного фона в результате антропогенной деятельности, а также испытаний ядерного оружия и аварий на реакторах.
Форма выполнения диссертационной работы.
Работа выполнялась в рамках финансирования по программе ГКНТ 0.74.05 - "Молекулярная биология и молекулярная генетика в медицине", по гранту Международного Научного Фонда J4W100 и проектам РФФИ 93-04-20253 и 95-04-136276.
Апробация работы.
Материалы, представленные в диссертации, докладывались на 1-м Всесоюзном радиобиологическом съезде (Москва, 1989), XII Всесоюзном съезде рентгенологов и радиологов (Ленинград, 1990), XV международном раковом конгрессе (Гамбург, ФРГ, 1990), 1-й Международной конференции "Биологические и радиоэкологические аспекты последствий аварии на Чернобыльской атомной станции" (Зеленый мыс, 1990), 23-й ежегодной конференции нейрохимического общества (Вашингтон, США, 1993), симпозиуме ASBMB "Генетические и биохимические подходы к изучению клеточной гибели" (Lake Tahoe, США, 1994), Международном симпозиуме "Физиолого-биохимические основы жизнедеятельности мозга" (С-Петебург, 1994) и на ежегодных заседаниях нейрохимического и иммунологического обществ Санкт-Петербурга (1995, 1996).
Основное содержание работы отражено в 30 научных публикациях.
