Введение к работе
Актуальность темы. Одной из основных проблем радиобиологии является изучениэ сравнитольноз радиоустойч-лвоета растительных организмов. Многочисленно научные данные по этому вопросу свидетельствуют о том, что растения являются чрезвычайно полиморфными по уровню естественной радиорезистентности. Наибольшие различия по этому признаку обнаруживаются между крупными таксономическими группами, менее значительные - дайке между отдельными сортами и растительными организмами. Известно также, что различные
Радиорезистентность является комплексным явлением, детерминированным разнообразными факторами. К их числу относятся объем ядра и хромосом, число хромосом, плоидность,-т.е. факторы, отражающие различия в структурной организации генома, а также содержание в клетках сульфгидрильных соединений, антиоксидантов и физиологически активных веществ. Одной из составляющих, играющих важную роль в формировании устойчивости к действию ионизирующей радиации является способность клеток к пострадиационному восстановлению.
Необходимыми компонентами пострадиационного восстановления и генетической стабильности клетки являются репарация ДНК и хромосом. Репарация ДНК играет важную роль в реализации онтогенетического повреждения, которое является одним из наиболее выраженных проявлений биологического действия излучения на клетки и служит причиной репродуктивной гибели соматических клеток, определяющей поражение критических систем организма. Учитывая важность процессов репарации ДНК в формировании устойчивости клеток к действию ионизирующей радиации, в последние годы проявляется значительный интерес к изучению этого феномена. Изучение механизмов репарации ДНК, а также ее роли в мутационном процессе и обеспечении надежности генетического .аппарата живых организмов вышло далеко за пределы радиобиологии и стало одним из центральных разделов молекулярной генетики. Генетический контроль и молекулярные механизмы
J-WSf6
НАУЧНАЯ 6.'-.'5Л' .ОТЕКА
Моск. сєльсіюхоз. академии
им Н, А. Тимирязева
Инв. №
- э -
различных репарационных путей в настоящее время детально изучены у бактерий. С помощью большого набора радиочувствительных мутантов произведены идентификация, клонирование и секвенирование генов репарации ДНК. Изучение механизмов репарации ДНК у эукариот исследовано существенно менее полно. Наибольшее число данных о репарации ДНК в клетках высших организмов получено при работе с мутантами, дефектными по эксциэионной репарации, в основном, на линиях грызунов. Некоторые из мутантных клеточных линий были использованы для идентификации и картирования генов человека, комплементарных дефектным по репарации ДНК генам грызунов.
Принимая во внимание, что для эукариот не существует такого хорошо идентифицированного и обширного набора генетически измененных штаммов, который позволил бы иэучитьучастие индивидуальных генов в функционировании отдельных этапов репарации ДНК, основной акцент делается на исследования с использованием различных метаболических ядов, блокирующих определенные ферментативные системы в клетке. Набор таких ингибиторов репарации достаточно разнообразен, но для многих из них строго не идентифицирован молекулярный механизм действия. В целом же следует отметить, что роль различных путей репарации в формировании феномена радиоустойчивости высших организмов, а равно в реализации цитогенетического повреждения исследована далеко недостаточно.
Удобным объектом для изучения механизмов радиоустойчивости высших растений является модель контрастных по радиорезистентности сортов гексаплоидной пшеницы, с помощью которой на основе мор-фометричесного и биохимического анализов установлена генетическая природа внутривидового полиморфизма /Корнеев и др., 1985, Сара-пульцев и др., 1989/. Изучение действия ингибиторов пострадиационного восстановления у контрастных по радиорезистентности сортов гексаплоидной пшеницы открывает возможность определить вклад отдельны^ ^тапов репарации в формирование их дифференциальной реак-циїг^'^из лучения.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключает^ ся в изучении действия ингибиторов репарации на пострадиационные процессы у контрастных по радиорезистентности сортов гексаплоидной пшеницы. Для достижения указанной цели были поставлены следующие конкретные задачи:
I. Провести радиобиологическую характеристику б контрастных по радиорезистентности сортов гексаплоидшй пшеницы на основе радиационной депрессии ростовых процессов и цитогенетического повреждения хромосом в корневой меристеме прорастающих семян.
-
С помощью ингибитора пострадиационного восстановления кофеина оценить активность репарационных процессов в прорастающих семенах радиоустойчивых и радиочувствительных сортов.
-
Провести сравнительный анализ действия ингибиторов синтеза ДНК оксимочевины и афидиколина на образование цитогенетического поврелщения в первом пострадиационном митозе у радиорезистентного сорта Янус и радиочувствительного сорта Московская 35.
4. Исследовать вклад репарационных процессов, связанных с функционированием ДНК-топоизомеразы П, в реализацию радиационного поражения хромосом у контрастных по радиорезистентности сортов гек-саплоидной пшеницы Янус и Московская 35.
5. Изучить роль поли-АДФ-рибоэилирования в формировании структурных повреждений хромосом у контрастных по радиорезистентности сортов гексашюидной пшеницы.
Научная новизна работы. Впервые с использованием модели контрастных по радиорезистентности сортов гексаплоидной пшеницы проведено исследование действия ингибиторов различных этапов репарации ДНК на эффективность восстановления после действия ^излучения.
На модели контрастных по устойчивости к действию ^излучения сортов гексаплоидной пшеницы с помощью ингибитора пострадиационного восстановления кофеина установлено, что их дифференциальная реакция обусловлена повышенной активностью репарационных процессов у радиореэистентных генотипов.
При исследовании комбинированного действия оксимочевины и афи-диколина показано, что частота клеток с аберрациями хромосом в корневой меристеме J^-облученных семян после обработки ингибиторами синтеза ДНК возрастает в большей степени у радиорезистентного сорта Янус по сравнению с радиочувствительным сортом Московская 35, Впервые на растительных объектах проведено изучение влияния ингибитора ДНК-толоиэомеразы П (налидиксовой кислоты) на образование аберраций хромосом. Установлено, что налидиксовая кислота не влияет на выход клеток с а'беррациями хромосом у радиорезистентного сорта Янус после 1^-облучения семян в дозах 25 и 50 Гр в от-
личие от радиочувствительного сорта Московская 35, в корневой меристеме которого обработка налидиксовой кислотой ослабляет радиационное поражение хромосом после ^облучения семян в дозе 25 Гр и усиливает его после облучения в дозе 50 Гр.
При исследовании роли поли-АДФ-рибозилирования в процессах, при-водящих к фиксации аберраций хромосом, показано, что ингибирование никотинамидом приводит к ослаблению цитогенетического повреждения, индуцированного ^"-облучением, как у радиочувствительного, так и у радиорезистентного сорта гексаплоидной пшеницы.. Действие няко-тикамида зависит от уровня радиационного повреждения меристемы и наблюдается при облучении семян радиочувствительного сорта Московская 35 в доз 25 Гр, а семян радиорезистентного сорта Янус - в дозе 50 Гр.
Теоретическая и практическая ценность работы. Представленные в диссертации экспериментальные данные по анализу действия ингибиторов репарации ДНК и сопряженных с ней процессов - кофеина, ок-симочевины и афидиколина, налидиксовой кислоты и нинотинамида -на ростовые процессы и формирование структурных повреждений хромосом в клетках корневой меристемы ^-облученных семян контрастных по радиорезистентности сортов гексаплоидной пшеницы свидетельствуют о важной роли репарации при формировании радиобиологических реакций растений. Изучение действия широкого набора ингибиторов репарации ДНК на модели контрастных по радиорезистентности сортов гексаплоидной пшеницы открывает принципиально новуя возможность исследования роли различных ферментов и путей репарации в реализации цитогенетического повреждения и, следовательно, в формировании феномена радиорезистентности. В целом, при отсутствии для растительных организмов необходимого набора дефектных ло репарации мутантов, единственным способом изучения участия отдельных ферментов и путей репарации в процессе реализации цитогенетичес-ких нарушений является ингибиторный анализ, применение которого весьма перспективно. Исследованные в работе соединения - оксимо-чевина, афидиколин, налидиксовая кислота и никотинамид - могут быть использованы как для усиления, так и для ослабления радиационного поражения хромосом, что может найти применение в практике для целенаправленного воздействия на радиоустойчивость организмов в целях радиационного мутагенеза и радиостимуляции.
- о -
Апробация работы. ,;Ьтор;;яли* диссертации долсї:,: ml: па З^-зсс:^-но:л научно-координационном совещании "ІЬкегіііто-биокімиїїсгк'.-'г ас~ ' пекты рацпсуо'і?"ч;іЕоот:і культурных растений" (Обилие:?, 1985), на Всесоюзном совещании "Применение физического и :;:іиичес;;^го :,г,-,га-генеза и сельском хэзяЗство" 'Кишинев, 1957), конкурсе ндумнмх работ, посвященном паг-інги Е.І.Ї.Юіечкоізскогс (Обнинск, 19371, ^-I Всесоюзном радиобиологическом съезде (Мсеква, 1939).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных раоот.
Структура и объем работы. Диссертационная работа эклкызот в себя введение, аналитическпЯ обзор, материал и методы исследования, экспериментальную часть и обсувденпе результатов, заключение, выводы и список цитируемой литературы. Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 7 рисунков. Список литературы включает 236 наименований, в т.ч. 164 иностранных.
