Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 7
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14
Апоптоз, его роль в организме и регуляция 14
Апоптоз и воспаление при бронхиальной астме 27
Изучение функциональной активности лимфоцитов на основе оценки активности ядрышковых организаторов 39
Цитоскелет и поверхностная архитектоника эриторцитов 48
Роль дисфункции эндотелия в развитии аллергического воспаления .... 57
Роль эпителия дыхательных путей в развитии аллергического воспаления 68
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 77
2.1. Клиническая характеристика обследованных больных 77
Исследование экспрессии СБ95/Ра8/АРО-1 рецепторов на лимфоцитах периферической крови 100
Определение экспрессии фосфатидилсерина на лимфоцитах периферической крови с помощью Аппехт У-ИТС/Р1 окрашивания 102
Определение активности каспазы 3 в лимфоцитах периферической крови 103
Оценка морфологических признаков спонтанного и индуцированного дексаметазоном, адреналином, пероксидом водорода апоптоза мононуклеаров и гранулоцитов периферической крови с помощью суправитального флюо- рохромирования акридиновым оранжевым 104
Серебрение ядрышек лимфоцитов периферической крови 105
Исследование поверхностной архитектоники эритроцитов в условиях модулирующего влияния адреналином, фитогемагглютинином, экзогенным циклическим аденозинмонофосфатом 106
Метод определения циркулирующих в крови десквамированных эндо- телиоцитов 108
Определение экспрессии Вс1-2, Вах, активности каспазы 3 в бронхиальных эпителиальных клетках методом иммуногистохимического исследования 109 2.3. Методы статистической обработки 111
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ПРОВЕДЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 113
Характеристика Fas-опосредованного апоптоза по активности спонтанной экспрессии CD95/Fas/APO-l рецепторов на лимфоцитах периферической крови 113
Результаты исследования апоптоза лимфоцитов периферической крови с помощью Annexin V-FITC/PI окрашивания 122
Характеристика апоптоза лимфоцитов периферической крови на основе оценки активности эффекторной каспазы 3 136
Результаты исследования апоптоза мононуклеаров и гранулоцитов периферической крови методом суправитального флюорохромирования акридиновым оранжевым 150
Оценка активности ядрышковых организаторов лимфоцитов периферической крови 173
Характеристика адренореактивной, ФГА-реактивной и цАМФ-реактив- ной систем на основе оценки поверхностной архитектоники эритроцитов 184
Исследование эндотелиальной дисфункции на основе оценки количества циркулирующих эндотелиальных клеток 198
Оценка активности генов-регуляторов апоптоза по экспрессии Вс1-2, Вах, активности каспазы 3 в бронхиальных эпителиальных клетках у больных
бронхиальной астмой 211
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 224
ВЫВОДЫ 259
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 261
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 262
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
иГКС
сГКС
лпвп лпнп лпонп лпс
МАЛТ ванная со слизистыми
МОС 50 50% ФЖЕЛ МОС 75 75% ФЖЕЛ НАБА ООЛ ОФВ1 кунду ПКА ПКГ ПКС ПОЛ ПОС РНК
Аллергическая бронхиальная астма Антигенпрезентирующие клетки Активные формы кислорода Бронхиальная астма Биологически активные вещества Бронхоальвеолярный лаваж Глюкокортикостероиды Дезоксирибонуклеиновая кислота Жизненная емкость легких Ингаляционные глюкокортикостероиды Системные глюкокортикостероиды Липопротеиды высокой плотности Липопротеиды низкой плотности Липопротеиды очень низкой плотности Липополисахарид
Мукозно-ассоциированная ткань, ассоцииро-
Максимальная объемная скорость выдоха при
Максимальная объемная скорость выдоха при
Неаллергическая бронхиальная астма Остаточный объем легких
Объем форсированного выдоха за первую се- Протеинкиназа А
Программированная клеточная гибель Протеинкиназа С Перекисное окисление липидов Пиковая объемная скорость выдоха Рибонуклеиновая кислота
ЕЬАМ
Раз(СВ95/Ра8/АРО-1)
Раэ1
Р1ТС
в\у
мулирующий фактор
Е-селектин Раэ рецептор Раэ лиганд
Флюоресцеинизотиоционат Глицин
Ag-гpaнyлы Аргентофильные гранулы
СЗа, С5а Анафилотоксины, компоненты комплемента,
активированные третий и пятый компоненты комплемента
Гранулоциторно-макрофагальный колониести-
фагальный хемотаксический фактор
NEP Нейтральная эндопептидаза
NO Оксид азота
PCNA Антиген, связанный с пролиферацией
(Proliferating cell nuclear antigen)
РЕ Фикоэритрин
PI Пропидиум иодид
RANTES Цитокин из семейства интерлейкина 8 молекула,
появляющаяся при активации и экспрессируемая Т-лимфоцитами (Regulation upon activation, novel T-cell expressed and presumably secreted)
Raw Удельное бронхиальное сопротивление
sFas Растворимая форма Fas рецептора
Sgaw Удельная проводимость бронхов
TGF(P) Трансформирующий фактор роста ((3)
TNF (а, (3) Фактор некроза опухолей (а, (3)
VLA "Очень" поздний антиген (Very late antigen)
Введение к работе
Актуальность темы
Бронхиальная астма (БА) является одной из важнейших проблем пульмонологии, что связано со значительной распространенностью заболевания, причем результаты эпидемиологических исследований свидетельствуют, к сожалению, об увеличении заболеваемости (Чучалин А.Г., 1997; Илькович М.М., Игнатьев В.А., 2002; Симаненков В.И., 2002). Вызывает обоснованную тревогу большой процент инвалидности, включая смертность больных бронхиальной астмой, а также размеры экономического ущерба, связанного с заболеваемостью бронхиальной астмой (Федосеев Г.Б., 2001).
Повышение эффективности лечения и профилактики бронхиальной астмы связывается с необходимостью глубокого знания патогенетических особенностей заболевания. При этом центральным дефектом, составляющим основу патогенеза, как предполагают (Минеев В.Н. и др., 2003), является изменение функций клеточного мембрано-рецепторного аппарата. Это вполне естественно, ибо каждая клетка находится под постоянным воздействием потока разнообразных информационных сигналов (аллергенов, микроорганизмов, гормонов, биологически активных веществ).
К настоящему времени патогенез бронхиальной астмы и атопии в целом становится все более и более понятным, однако понимание этиологии бронхиальной астмы во многом еще остается неполным, несмотря на прогресс, достигнутый в области генетических исследований этого заболевания (Трофимов В.И., 1998). Одним из важных ген-регулируемых процессов является апоптоз. Актуальность исследования апоптоза обусловлена прежде всего тем, что этот процесс тесно связан с целым рядом тех сигнал-проводящих систем (аденилатциклазная, фосфоинозитидная и др.), изменение которых имеет большое патогенетическое значение для бронхиальной астмы. Кроме того, сигналы, ингибирующие и, напротив, индуцирующие апоптоз, являются ключевыми в патогенезе заболевания (интерлейкины, интерфероны, глю- кокортикостероиды, внеклеточный матрикс и т.д.).
Нельзя не сказать, что разрабатываемая нами концепция недодифферен- цировки, выдвинутая С.С. Жихаревым (1984), которая связывает развитие атопии с онтогенетической незрелостью клеток, несомненно, нуждается в той доказательности (морфологической, биохимической и прочей), которая может быть предоставлена исследованиями феномена апоптоза, хотя и в исследованиях механизмов апоптоза и его роли при различных заболеваниях остается много неясного.
Динамика развития бронхиальной астмы от этапа врожденных или приобретенных биологических дефектов (Федосеев Г.Б., 2001) до этапа присоединения атеросклероза и связанных с ним заболеваний, когда БА "уходит" на второй план (Батагов С.Я., 1999; Федосеев Г.Б., 2001), диктует необходимость рассмотрения данного заболевания в рамках единого континуума формирования бронхиальной астмы.
Цель работы
Выявить особенности апоптоза клеток-мишеней в патогенетическом и клиническом аспектах при бронхиальной астме и установить связь нарушений апоптоза с особенностями и выраженностью воспалительного процесса и ремоделирования в бронхах у больных бронхиальной астмой.
Основные задачи исследования
Исследовать особенности спонтанного апоптоза лимфоцитов периферической крови на основе оценки уровня экспрессии С095/Ра8/АР0-1 рецепторов и фосфатидилсерина, а также оценки активности каспазы 3 у больных с различными вариантами бронхиальной астмы.
Изучить особенности спонтанного и индуцированного дексамета- зоном, адреналином, пероксидом водорода апоптоза мононуклеаров и грану- лоцитов периферической крови у больных с различными вариантами бронхиальной астмы.
Дать характеристику воспалительного процесса и ремоделирования бронхов, а также оценить особенности регуляции апоптоза бронхиальных эпителиальных клеток у больных бронхиальной астмой на основе оценки
активности генов-регуляторов апоптоза Вс1-2, Вах, каспазы 3.
Исследовать активность ядрышковых организаторов в лимфоцитах периферической крови у больных бронхиальной астмой.
Оценить особенности адренореактивной, фитогемагглютинин(ФГА)-реактивной и цАМФ-реактивной систем эритроцитов на основе оценки их поверхностной архитектоники у больных бронхиальной астмой.
Исследовать уровень циркулирующих в крови десквамированных эндотелиоцитов у больных бронхиальной астмой.
Охарактеризовать континуум развития бронхиальной астмы с этапа внелегочных проявлений аллергии до этапа присоединения заболеваний, связанных с атеросклерозом, на основе изучения апоптоза клеток-мишеней, активности ядрышковых организаторов, поверхностной архитектоники эритроцитов и циркулирующих эндотелиоцитов.
Научная новизна работы
Впервые проведено комплексное исследование спонтанного апоптоза клеток-мишеней - мононуклеаров и гранулоцитов периферической крови, эпителиоцитов бронхов — у больных аллергической (АБА), неаллергической (НАБА) бронхиальной астмой и у больных, получающих системные глюко- кортикостероиды (сГКС), и показана патогенетическая значимость нарушений апоптоза в персистенции воспаления.
Впервые проведено исследование индуцированного дексаметазоном, адреналином, пероксидом водорода апоптоза лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови у больных с разными вариантами бронхиальной астмы.
Впервые проведено сопоставление апоптоза в клетках периферической крови и в органе-мишени - бронхах - у больных бронхиальной астмой и выявлена универсальность механизмов регуляции процесса апоптоза, а также показана взаимосвязь апоптоза клеток-мишеней с особенностями ремодели- рования бронхов.
Впервые проведено исследование спонтанного апоптоза мононуклеаров и гранулоцитов периферической крови у больных с внелегочными проявлениями аллергии и проведено сопоставление активности ядрышковых организаторов лимфоцитов с процессом апоптоза.
Впервые показаны особенности эндотелиальной дисфункции у больных с различными вариантами бронхиальной астмы и у больных с внелегочными проявлениям аллергии (ВЛА).
Впервые исследованы особенности поверхностной архитектоники эритроцитов в условиях модулирующего влияния ФГА и экзогенного цАМФ у больных бронхиальной астмой.
Впервые выявлены особенности спонтанного и индуцированного апоптоза клеток периферической крови, активности ядрышковых организаторов, поверхностной архитектоники эритроцитов у больных с атеросклерозом (ИБС, гипертонической болезнью) и показано влияние атеросклероза на характер изменений исследуемых процессов у больных бронхиальной астмой.
Впервые охарактеризован континуум развития бронхиальной астмы с этапа внелегочных проявлений аллергии до этапа присоединения заболеваний, связанных с атеросклерозом, и выявлены альтернативные феномены, связанные с апоптозом клеток-мишеней, активностью ядрышковых организаторов, уровнем циркулирующих эндотелиоцитов.
Практическая ценность работы
Разработан простой, но достаточно информативный в отношении клинических особенностей бронхиальной астмы подход к оценке апоптоза клеток периферической крови на основе суправитального флюорохромирования акридиновым оранжевым, что позволяет рекомендовать его для применения в клинической практике как аллергологам, так и пульмонологам.
Выявленные особенности апоптоза клеток-мишеней, активности ядрышковых организаторов лимфоцитов, уровня циркулирующих эндотелиоцитов могут быть рекомендованы для дифференциальной диагностики вариантов бронхиальной астмы.
Выявленные маркерные для атопического состояния особенности спонтанного и индуцированного апоптоза мононуклеаров и гранулоцитов периферической крови, а также особенности, характеризующие активность ядрыш- ковых организаторов и уровень циркулирующих эндотелиоцитов, позволяют диагностировать атопическое состояние не только на этапе клинических проявлений бронхиальной астмы, но и на доклиническом этапе.
Положения, выносимые на защиту
Для бронхиальной астмы характерны изменения спонтанного и индуцированного- апоптоза клеток-мишеней, зависящие от варианта заболевания. Характерной особенностью аллергической бронхиальной астмы являлось торможение спонтанного апоптоза клеток-мишеней, что прослеживается на разных этапах программированной клеточной гибели. При этом как моно- нуклеары, так и гранулоциты больных аллергической бронхиальной астмой отличались высокой чувствительностью к агентам, используемым для- индукции апоптоза (дексаметазону, адреналину, пероксиду водорода). Клетки- мишени больных неаллергической бронхиальной астмой характеризовались повышением спонтанного апоптоза. У больных бронхиальной астмой, получающих системные глюкокортикостероиды, наблюдалась наиболее выраженная активация разных этапов спонтанного апоптоза лимфоцитов, кроме этого, мононуклеары и гранулоциты периферической крови данной группы больных характеризовались низкой чувствительностью к апоптогенным.стимулам.
У больных бронхиальной астмой выявлены особенности регуляции апоптоза бронхиальных эпителиальных клеток, зависящие от варианта заболевания. Больные аллергической бронхиальной астмой характеризовались повышением экспрессии Вс1-2 и снижением экспрессии Вах в эпителиальных клетках бронхов по сравнению с больными неаллергической бронхиальной астмой и больными, получающими системные глюкокортикостероиды. Наиболее частыми признаками ремоделирования бронхов у больных аллергической бронхиальной астмой являлись шеддинг эпителия, утолщение и ги- алинизация базальной мембраны; особенностью воспаления являлась лимфо- цитарно-эозинофильная инфильтрация ткани бронхов. При гистологическом исследовании биоптатов бронхов у больных неаллергической бронхиальной астмой чаще выявлялись признаки метаплазии эпителия, коррелирующие с активностью каспазы 3 в эпителии бронхов.
Торможение апоптоза у больных аллергической бронхиальной астмой, характеризующееся снижением экспрессии С095/Раз/АР0-1 рецепторов и фосфатидилсерина на поверхности лимфоцитов, а также снижением активности эффекторной каспазы 3, тесно связано со степенью эозинофиль- ной и лимфоцитарной инфильтрации стенки бронхов, что указывает на роль нарушений апоптоза в персистенции аллергического воспаления. Кроме этого, устойчивость к апоптозу мононуклеаров и гранулоцитов периферической крови коррелирует с показателями бронхиальной проходимости.
У больных с внелегочными проявлениями аллергии обнаружены изменения спонтанного и индуцированного апоптоза клеток периферической крови, характерные для больных аллергической бронхиальной астмой. Данная группа больных характеризовалась повышенной устойчивостью к спонтанному апоптозу, при этом клетки-мишени больных с внелегочными проявлениями аллергии отличались высокой чувствительностью к агентам, используемым для индукции апоптоза.
Больные аллергической и неаллергической бронхиальной астмой, а также больные с внелегочными проявлениями аллергии, характеризовались повышением активности ядрышковых организаторов в лимфоцитах периферической крови, что коррелирует с показателями апоптоза. Активность ядрышковых организаторов лимфоцитов больных, получающих системные глюкокортикостероиды, снижена, что заключается в снижении количества аргентофильных гранул в лимфоцитах.
При характеристике континуума развития бронхиальной астмы с этапа внелегочных проявлений аллергии до этапа присоединения заболеваний, связанных с атеросклерозом, четко прослеживается наличие альтернативных феноменов, характеризующих апоптоз клеток периферической крови, активность ядрышковых организаторов, уровень циркулирующих эндоте- лиоцитов. Больные с внелегочными проявлениям аллергии характеризуются торможением апоптоза клеток-мишеней, повышением активности ядрышковых организаторов лимфоцитов и повышением уровня десквамированных эндотелиоцитов. На этапе присоединения атеросклероза и его клинических проявлений в виде ИБС, гипертонической болезни у больных бронхиальной астмой происходят активация процесса апоптоза, существенное нарастание уровня десквамированных эндотелиоцитов и снижение активности ядрыш- ковых организаторов лимфоцитов периферической крови, коррелирующие с нарастанием апоптоза.
Реализация и апробация работы
Результаты исследования внедрены в практическую работу клиники госпитальной терапии СПбГМУ имени академика И.П. Павлова, городского Аллергологического Центра.
Материалы диссертации докладывались на научной конференции "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины" (М., 1998); на 9-м и 13-м Национальных конгрессах по болезням органов дыхания (М., 1999; СПб, 2003); на Международной конференции, посвященной 75-летию со дня рождения A.M. Уголева (СПб, 2001); на научно-практической конференции "Актуальные вопросы пульмонологии и клинической аллергологии", посвященной 100-летию кафедры госпитальной терапии им. акад. М.В. Черноруцкого СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова (СПб, 2001); на VII Всероссийском форуме с международным участием им. акад. В.И. Иоффе "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (СПб, 2004); на IV Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 80-летию Института физиологии им. акад. И.П. Павлова РАН (СПб, 2005); на 12-м, 13-м, 15-м конгрессах Европейского Респираторного Общества (Stockholm, 2002; Vienna, 2003; Copenhagen, 2005).
По материалам диссертации опубликовано 38 печатных работ. Из них 15 статей, 9 работ в зарубежной литературе; 1 патент на изобретение.
По результатам Санкт-Петербургского конкурса грантов для молодых кандидатов наук, проводимого Министерством образования РФ, Российской Академией наук и Администрацией Санкт-Петербурга, конкурсный проект "Проблемы мембрано-рецепторных нарушений при донозологической диагностике бронхиальной астмы" стал победителем конкурса 2001 года. Шифр гранта: М01-4.0П-22.
