Введение к работе
Актуальность работы. Корневые гнили относятся к числу весьма вредоносных болезней ягодных культур. Среди патогенов, поражающих корневую систему, известны возбудители ризоктониозной гнили Rhizoctonia spp., питиозной гнили Pythium spp., виды из родов Verticillium и Fusarium. В последнее время особое внимание уделяется гнилям корней малины и земляники, вызываемым оомицетами рода Phytophthora. Это, в первую очередь, связано с высокой вредоносностью данных возбудителей, которые способны вызывать гибель от 40% до 78% растений за вегетационный период (Abad et al., 2008; Kroon, 2010). Также фитофторозы влияют на производство здорового посадочного материала, ухудшая его фитосанитарное качество. Около 13 видов Phytophthora описаны как возбудители корневых гнилей ягодных культур (Cooke et al., 2000). Среди них серьезную угрозу представляет карантинный объект - биотип Ph. fragariae Hickman, вызывающий гниль корней малины и земляники.
Основной источник распространения фитофторозов - зараженный посадочный материал, где возбудитель может сохраняться долгое время в покоящихся стадиях. Поэтому фитосанитарный контроль продукции растениеводства, особенно импортируемого посадочного материала, играет важную роль (Александров, 2004).
Для предотвращения проникновения возбудителей фитофторозов из других стран и их распространения на территории России требуется применять достоверные и чувствительные методы диагностики. Традиционные методы для выявления оомицетов рода Phytophthora не являются достаточно надежными. При выделении в культуру фитофторозы быстро подавляются сопутствующими микромицетами, а также имеют схожую симптоматику проявления болезни с другими возбудителями корневых гнилей (Новотельнова, 1974). Идентификация Phytophthora spp. по форме спорангиев представляется сложной, поскольку многие виды, в том числе и карантинные, имеют практически сходное строение. Кроме того, классические методы, применяемые для рутинной диагностики растительных образцов, весьма длительны и трудоемки.
В последние десятилетия во многих странах получил распространение метод выявления фитопатогенов с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод ПЦР отличается высокой точностью и специфичностью и позволяет выявлять возбудителей Phytophthora spp. в растительных и почвенных образцах (Bonants et al., 1997; Cooke et al., 2000). Разработка новых высокочувствительных и специфичных методов для идентификации оомицетов Phytophthora spp. на малине и землянике является приоритетной задачей, т.к. между странами происходит широкий обмен посадочным материалом. Поскольку в России фитофторозные корневые гнили двух широко распространенных ягодных культур - малины и земляники остаются слабо исследованными, а молекулярно-генетические методы их диагностики не разработаны, то настоящее исследование представляется актуальным.
Цель и задачи исследований. Целью проводимых исследований являлось усовершенствование методов диагностики возбудителей фитофторозных корневых гнилей малины и земляники.
Для достижения этой цели предстояло решить следующие задачи:
-
Уточнить видовой состав и распространенность оомицетов рода Phytophthora-возбудителей гнилей корней земляники и малины.
-
Оптимизировать методы пробоподготовки при молекулярно-генетической идентификации возбудителей фитофторозных корневых гнилей малины и земляники.
-
Разработать и оптимизировать мультиплексную ПЦР «в реальном времени» для выявления и идентификации основных возбудителей фитофторозов.
-
Разработать метод диагностики фитофторозов в почве комбинацией метода биоприманок и ПЦР.
Научная новизна. Впервые в России проведено изучение видового разнообразия фитофторозных корневых гнилей малины и земляники с применением молекулярных методов диагностики. Оптимизированы методы пробоподготовки исследуемого материала при идентификации оомицетов Phytophthora spp. методом классической ПЦР и ПЦР «в реальном времени». Впервые в посадочном материале малины идентифицирован вид Phytophthora tentaculata Krber & Marwitz, ранее не выявляемый в РФ. На основе подобранных праймеров и зондов разработана диагностика возбудителей фитофторозов малины и земляники методом мультиплексной ПЦР «в реальном времени», которая позволяет идентифицировать в одной пробирке Ph. cactorum, Ph. nicotianae, Ph. citricola и карантнинный вид Ph. fragariae. Разработана диагностика почвы на присутствие видов Phytophthora сочетанием метода биоприманок и ПЦР.
Практическая значимость и реализация результатов исследований. Проведенные исследования позволили разработать систему внутреннего положительного контроля (ВПК), которую возможно применять не только для молекулярной диагностики фитофторозов, но и других фитопатогенов.
Предложены оптимальные методы выделения ДНК из чистых культур оомицетов рода Phytophthora и пораженной растительной ткани биоприманок при молекулярно-генетической диагностике этих фитопатогенов.
Впервые в России разработан метод мультиплексной ПЦР «в реальном времени» для выявления и идентификации основных фитофторозных корневых гнилей малины и земляники.
Определена возможность изучения видового разнообразия фитофторозов в растительных и почвенных образцах сочетанием метода биоприманок с классической ПЦР, ПЦР «в реальном времени», а также секвенированием гена Ypt1 возбудителей рода Phytophthora.
Разработанные методы диагностики успешно применяются при проведении фитосанитарной экспертизы в ФГБУ «ВНИИКР».
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Видовой состав и распространенность возбудителей фитофторозных корневых гнилей в насаждениях и посадочном материале малины и земляники;
-
Оптимизация молекулярно-генетических методов идентификации фитофторозов (методы экстракции ДНК; разработка внутреннего положительного контроля (ВПК)
-
Мультиплексная ПЦР «в реальном времени» для диагностики основных видов возбудителей фитофторозов малины и земляники.
-
Диагностика почвы на присутствие видов Phytophthora, комбинацией метода биоприманок и ПЦР.
Апробация работы. Основные положения и результаты исследований диссертационной работы доложены на Междисциплинарном микологическом форуме (г. Москва, 14-15 апреля 2010 г.), международной научно-практической конференции «Инновационные направления и проблемы в защите садовых культур от вредных организмов на современном этапе» (г. Москва, ВСТИСП, 12-14 июля 2010 г.), всероссийском научно-практическом семинаре «Современные методы защиты плодовых и ягодных насаждений от болезней и вредителей» (г. Москва, ВСТИСП, 20 апреля 2011 г.), 3 съезде микологов России (г. Москва, 10-12 октября 2012г.), научно-практической конференции ЕОКЗР и Проекта QBOL «ДНК баркодирование и методы диагностики» (г. Гарлем, Нидерланды, 21-25 мая 2012 г), 6 международной конференции IUFRO «Фитофторозы в лесах и природных экосистемах» (г. Кордоба, Королевство Испания, 9-15 сентября 2012 года), международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы защиты садовых культур от вредных организмов» (г. Москва, ВСТИСП 19 марта 2013 г.), заседаниях Ученого совета и секции ягодных культур ГНУ ВСТИСП, заседаниях Ученого совета ФГБУ «ВНИИКР».
Публикации. По материалам диссертации опубликовано девять печатных работ, в том числе 5 в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК.
Объём и структура работы. Диссертационная работа изложена на 132 страницах и состоит из введения, 7 глав, общих выводов, рекомендаций по практическому применению, списка использованной литературы из 124 источников (из них 91- зарубежных авторов). В диссертации содержится 13 рисунков, 26 таблиц и 8 приложений.
Автор выражает благодарность заместителю директора ФГБУ «ВНИИКР», к.б.н. Мазурину Е.С. за полезные советы на протяжении всех этапов исследований и постоянное внимание к работе. Признателен сотрудникам лаборатории микологии ФГБУ «ВНИИКР»: зав. лабораторией, к.б.н. Скрипка О.В., ст. научн. сотруднику Дудченко И.П. за помощь на начальных этапах исследований. А также зав. лабораторией, к.б.н. Камаеву И.О. за помощь в статистической обработке данных.
