Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. современные представления о патогенетических закономерностях развития и прогрессирования стероид-резистентного нефротического синдрома 16
1.1. Патогенетические механизмы и факторы риска прогрессирования стероид-резистентного нефротического синдрома 16
1.2. Клиническое значение мутаций и полиморфных вариантов подоцитарных генов в развитии и прогрессировании стероид-резистентного нефротического синдрома у детей 26
1.3. Клиническое значение полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой
системы и эндотелиальной дисфункции в развитии предрасположенности к прогрессированию стероид-резистентного нефротического синдрома 48
1.4. Иммуносупрессивная терапия стероид-резистентного нефротического синдрома у детей 53
Глава 2. Характеристика обследованных детей, методы исследования и лечения 59
2.1. Организация и дизайн исследования 59
2.2. Клиническая характеристика обследованных детей 61
2.3. Общее клиническое, лабораторное и функциональное обследование 63
2.4. Специальные методы обследования 68
2.4.1. Морфологическое исследование ткани почки 68
2.4.2. Молекулярно-генетические методы исследования 69
2.5. Статистическая обработка результатов 78
Глава 3. Клинические и морфологические предикторы прогрессирования стероид-резистентного нефротического синдрома у детей 81
3.1. Клинические предикторы прогрессирования стероид-резистентного нефротического синдрома у детей 81
3.2. Морфологические предикторы прогрессирования стероид-резистентного нефротического синдрома у детей 123
Глава 4. Анализ ассоциаций мутаций и полиморфных аллелей генов NPHS2, NPHS1 И TRPC6 с развитием и прогрессированием стероид-резистентного нефротического синдрома у детей 154
4.1. Анализ ассоциаций мутаций и полиморфных аллелей гена NPHS2 с развитием и прогрессированием стероид-резистентного нефротического синдрома у детей 154
4.2. Анализ ассоциаций мутаций и полиморфных аллелей гена NPHS1 с развитием и прогрессированием стероид-резистентного нефротического синдрома у детей 159
4.3. Анализ ассоциаций дигенного носительства мутаций и полиморфных аллелей генов NPHS2 и NPHS1 с прогрессированием стероид-резистентного нефротического синдрома у детей 177
4.4. Анализ ассоциаций мутаций и полиморфных аллелей гена TRPC6 с развитием и прогрессированием стероид-резистентного нефротического синдрома у детей 183
4.5. Анализ ассоциаций дигенного носительства полиморфных аллелей генов TRPC6 и NPHS1 с прогрессированием стероид-резистентного нефротического синдрома у детей 208
Глава 5. Анализ ассоциаций полиморфизма генов АСЕ (I/D), AGT (М235Т), AGTR1 (А1166С), eNOS (4а/4Ъ), PAI-1 (4G/5G), MTHFR (С677Т) с предрасположенностью к прогрессированию стероид-резистентного нефротического синдрома у детей 216
5.1. Анализ ассоциаций полиморфизма гена АСЕ (I/D) с предрасположенностью к прогрессированию стероид-резистентного нефротического синдрома у детей 217
5.2. Анализ ассоциаций полиморфизма гена AGT (М235Т) с предрасположенностью к прогрессированию стероид-резистентного нефротического синдрома у детей 230
5.3. Анализ ассоциаций полиморфизма renaAGTRl (А1166С) с предрасположенностью к прогрессированию стероид-резистентного нефротического синдрома у детей 242
5.4. Анализ ассоциаций полиморфизма гена eNOS (4a/4b) с предрасположенностью к прогрессированию стероид-резистентного нефротического синдрома у детей 251
5.5. Анализ ассоциаций полиморфизма гена PAI-1 (4G/5G) с предрасположенностью к прогрессированию стероид-резистентного нефротического синдрома у детей 263
5.6. Анализ ассоциаций полиморфизма гена MTHFR (С677Т) с предрасположенностью к прогрессированию стероид-резистентного нефротического синдрома у детей 271
Глава 6. Эффективность иммуносупрессивнои терапии стероид-резистентного нефротического синдрома у детей 277
6.1. Эффективность циклофосфана внутривенно при стероид-резистентном нефротическом синдроме у детей 277
6.2. Эффективность циклоспорина А при стероид-резистентном нефротическом синдроме у детей 281
6.3. Эффективность микофенолата мофетила при стероид-резистентном нефротическом синдроме у детей 286
6.4. Эффективность такролимуса при стероид-резистентном нефротическом синдроме у детей 290
6.5. Сравнительная эффективность иммуносупрессивной терапии стероид-резистентного нефротического синдрома у детей 293
Заключение 312
Выводы 334
Практические рекомендации 336
Указатель литературы 338
- Клиническое значение мутаций и полиморфных вариантов подоцитарных генов в развитии и прогрессировании стероид-резистентного нефротического синдрома у детей
- Клиническая характеристика обследованных детей
- Морфологические предикторы прогрессирования стероид-резистентного нефротического синдрома у детей
- Анализ ассоциаций мутаций и полиморфных аллелей гена NPHS1 с развитием и прогрессированием стероид-резистентного нефротического синдрома у детей
Введение к работе
Актуальность проблемы. Предупреждение прогрессирования хронических болезней почек (ХБП) и поиск эффективных превентивных терапевтических подходов являются острейшей медико-социальной проблемой, относящейся к приоритетам национальных систем здравоохранения большинства стран мира [Игнатова М.С., 2011; National Kidney Foundation Kidney Disease Outcomes Quality Initiatives, 2002].
По данным эпидемиологических исследований, ежегодная заболеваемость нефротическим синдромом составляет 2-7 случаев на 100 000 детей, кумулятивная распространенность - 12-16 на 100 000 детского населения [Eddy A.A. et al., 2003]. Стероид-резистентный нефротический синдром (СРНС) наблюдается у 10-20% детей с нефротическим синдромом [McKinney PA. et al., 2001]. Проблемы прогрессирования СРНС у детей остаются одними из актуальных вопросов в мировой педиатрической нефрологии, что определяется высокой частотой развития хронической почечной недостаточности (ХПН), отмечаемой более чем у 50% пациентов в течение 5-10 лет [Ehrich J.H.H. et al., 2007]. По данным международных регистров, СРНС составляет 1529% в структуре терминальной ХПН у детей, являясь ведущим приобретенным заболеванием почек [McTaggart S. et al., 2009; Lewis M.A. et al., 2009; ESPN/ERA-EDTA Registry, 2010].
Изучение закономерностей прогрессирования СРНС у детей приобретает особую значимость в связи с высоким риском возврата заболевания после трансплантации почки с последующей потерей трансплантата у 50-80% пациентов [Nathanson S. et al., 2005]. Учитывая отмечаемое увеличение частоты СРНС с фокально-сегментарным гломерулосклерозом (ФСГС) у детей [Chesney R. et al., 2004; Del Rio M. et al., 2008; Banaszak B. et al., 2012], с клинических позиций чрезвычайно важным является поиск клинических и морфологических предикторов неблагоприятного почечного исхода, позволяющих прогнозировать течение заболевания с индивидуальной оценкой риска развития ХПН.
Исследования в области молекулярной генетики продемонстрировали генетическую гетерогенность СРНС, обусловленную мутациями в генах щелевой диафрагмы и подоцитарного цитоскелета гломерул: NPHS1, NPHS2, ACTN4, CD2AP, TRPC6, PLCE1, INF2, MYO1E [Kestila M. et al., 1998; Boute N. et al., 2000; Kaplan J.M. et al., 2000; Kim J.M. et al., 2003; Winn M.P. et al., 2005; Hinkes B. et al., 2006; Brown E.J. et al., 2010; Mele C. et al., 2011]. Учитывая увеличивающееся количество идентифицированных в последние годы генов-кандидатов, мутации которых ответственны за развитие СРНС у детей, представляется актуальным изучение потенциальных ассоциаций мутаций и аллельного полиморфизма подоцитарных генов с клиническими проявлениями, морфологическими вариантами патологии, а также с прогрессированием заболевания и эффективностью иммуносупрессивной терапии.
Важную роль в патогенезе прогрессирования ХБП играет ренин-ангиотензиновая система и основной ее компонент - ангиотензин II, активность которого в значительной степени определяется генами ACE (I/D), AGT (M235T) и AGTR1 (A1166C). Основными патофизиологическими проявлениями активации ангиотензина II являются системная артериальная гипертензия (АГ) с интрагломерулярной гипертензией и гиперфильтрацией, что приводит к протеинурии, развитию гломерулосклероза и интерстициального фиброза [Vaughan D.E. et al., 1995; Taal M.W. et al., 2000; Sethi A.A. et al., 2003]. В последние годы проводится поиск потенциальных ассоциаций полиморфных аллелей генов ренин- ангиотензиновой системы и эндотелиальной дисфункции с предрасположенностью к прогрессированию нефротического синдрома у детей [Шарнова Ж.П. и др., 2007; Zhou T.B. et al., 2011]. Однако результаты проведенных исследований достаточно противоречивы, а исследования генетических ассоциаций с прогрессированием СРНС немногочисленны, что явилось обоснованием для изучения роли аллельного полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой системы и эндотелиальной дисфункции с предрасположенностью к прогрессированию СРНС у детей.
Достижение ремиссии СРНС, индуцируемой иммуносупрессивной терапией, является предиктором благоприятного почечного исхода заболевания [Cattran D.C. et al., 1998; Ehrich J.H.H. et al., 2007]. В этом аспекте чрезвычайно важным является поиск эффективной патогенетической иммуносупрессивной терапии различных морфологических вариантов СРНС у детей. В научной литературе недостаточно освещены клинические и морфологические предикторы отсутствия эффекта иммуносупрессивной терапии 1-й линии у детей со СРНС, изучение которых представляет несомненный научный интерес и определяет клиническую значимость.
Таким образом, актуальной проблемой современной медицины является комплексное изучение закономерностей прогрессирования СРНС у детей с оценкой вклада клинических, морфологических и генетических факторов риска, что позволит прогнозировать течение заболевания с учетом индивидуальной генетической предрасположенности пациентов и оптимизировать тактику иммуносупрессивной терапии, направленной на предупреждение развития ХПН.
Цель исследования. Определение закономерностей прогрессирования стероид- резистентного нефротического синдрома у детей на основе клинических и морфологических характеристик патологии, мутаций и аллельного полиморфизма генов - кандидатов для разработки системы индивидуального прогнозирования течения заболевания и обоснования эффективной терапии. Задачи исследования:
-
Определить клинические и морфологические предикторы неблагоприятного почечного исхода и разработать алгоритм, определяющий индивидуальный риск прогрессирования стероид-резистентного нефротического синдрома у детей.
-
Установить частоту мутаций и ассоциации полиморфных аллелей подоцитарных генов NPHS2, NPHS1 и TRPC6 с развитием и прогрессированием стероид- резистентного нефротического синдрома у детей и с эффективностью иммуносупрессивной терапии 1-й линии.
-
Выявить полиморфные аллели генов ренин-ангиотензиновой системы - ACE (I/D), AGT (М235Т), AGTR1 (А1166С) и генов эндотелиальной дисфункции - eNOS (4а/4Ь), PAI-1 (4G/5G), MTHFR (C677T), ассоциированные с предрасположенностью к прогрессированию стероид-резистентного нефротического синдрома у детей.
-
Оценить сравнительную эффективность иммуносупрессивной терапии циклофосфаном внутривенно, циклоспорином А, микофенолатом мофетила и такролимусом в зависимости от морфологических вариантов стероид-резистентного нефротического синдрома у детей.
-
Определить клинические и морфологические предикторы отсутствия эффекта иммуносупрессивной терапии 1-й линии у детей со стероид-резистентным нефротическим синдромом.
-
Оценить эффективность гипотензивной терапии ингибиторами ангиотензин- превращающего фермента в зависимости от аллельного полиморфизма генов ренин- ангиотензиновой системы - ACE (I/D), AGT (М235Т), AGTR1 (А1166С) у детей со стероид-резистентным нефротическим синдромом.
Научная новизна. Сформулирована патогенетически обоснованная концепция прогрессирования стероид-резистентного нефротического синдрома у детей, определяемая преимущественным вкладом фокально-сегментарного гломерулосклероза, ассоциированного с аллельным полиморфизмом подоцитарных генов и генов ренин- ангиотензиновой системы, а также значимым влиянием эффекта иммуносупрессивной терапии 1-й линии.
Впервые в педиатрии с использованием подходов доказательной медицины систематизированы известные и выделены новые информативные клинические и морфологические предикторы неблагоприятного почечного исхода, на основании которых разработан алгоритм индивидуального прогноза, позволивший количественно оценить вероятность прогрессирующего течения стероид-резистентного нефротического синдрома у детей.
Показано, что риск прогрессирования стероид-резистентного нефротического синдрома ассоциирован с малой массой тела при рождении (менее 2500 г) детей и обусловлен развитием фокально-сегментарного гломерулосклероза и отсутствием эффекта иммуносупрессивной терапии 1-й линии.
Установлена низкая частота мутаций в подоцитарных генах NPHS2, NPHS1 и TRPC6, что не позволяет рассматривать данные гены в качестве основных генов - кандидатов, участвующих в развитии стероид-резистентного нефротического синдрома у детей обследованной выборки.
Впервые в нефрологии показано, что риск развития стероид-резистентного нефротического синдрома у детей ассоциирован с комбинацией из 3-х полиморфных аллелей гена TRPC6 (c.1683T>C, c.1211C>T, c.43C>T), что свидетельствует о генетической предрасположенности к развитию заболевания.
Получены новые данные, свидетельствующие о повышенном риске развития фокально-сегментарного гломерулосклероза у детей со стероид-резистентным нефротическим синдромом при наличии дигенного носительства полиморфных аллелей подоцитарных генов TRPC6 (c.1683T>C, c.1211C>T, c.43C>T) и NPHS1 (c.349G>A, c.1223G>A), а также генотипа Т/Т гена AGT (М235Т).
Установлено, что риск прогрессирования стероид-резистентного нефротического синдрома у детей не ассоциирован с отдельными полиморфными аллелями подоцитарных генов: NPHS2 (c.873+ 7A>G), NPHS1 (c.349G>A, c.791C>G), TRPC6 (c.1683T>C, c.43C>T).
Определены клинические и морфологические предикторы отсутствия эффекта иммуносупрессивной терапии 1 -й линии у детей со стероид-резистентным нефротическим синдромом.
Эффективность иммуносупрессивной терапии 1-й линии у детей со стероид- резистентным нефротическим синдромом не зависит от аллельного полиморфизма подоцитарных генов: NPHS2 (c.873+ 7A>G), NPHS1 (c.349G>A), TRPC6 (c.1683T>C), а также их генотипических комбинаций и дигенного носительства.
Практическая значимость. Разработан алгоритм прогнозирования течения стероид-резистентного нефротического синдрома у детей, защищенный патентом Российской Федерации, который основан на выявлении клинических и морфологических предикторов прогрессирования заболевания и позволяет с высокой вероятностью определять индивидуальный риск развития хронической почечной недостаточности.
Показана целесообразность выявления малой массы тела при рождении (менее 2500 г) у детей со стероид-резистентным нефротическим синдромом для прогнозирования риска прогрессирования заболевания с быстрыми темпами снижения почечных функций в год, развитием фокально-сегментарного гломерулосклероза и отсутствием эффекта иммуносупрессивной терапии 1-й линии.
Установлена возможность раннего прогнозирования развития стероид-резистентного нефротического синдрома у детей при определении комбинации из 3-х полиморфных аллелей гена TRPC6 (c.1683T>C, c.1211C>T, c.43C>T), что является важным до подтверждения резистентности к стероидной терапии.
Продемонстрирована целесообразность определения дигенного носительства полиморфных аллелей подоцитарных генов TRPC6 (c.1683T>C, c.1211C>T, c.43C>T) и NPHS1 (c.349G>A, c.1223G>A) и генотипа Т/Т гена AGT (М235Т) для прогнозирования развития фокально-сегментарного гломерулосклероза у детей со стероид-резистентным нефротическим синдромом.
Обосновано включение в обследование пациентов со стероид-резистентным нефротическим синдромом определение аллельного полиморфизма гена ACE (I/D) для прогнозирования развития артериальной гипертензии и выраженной протеинурии более 5 г/1,73м724ч, являющихся независимыми клиническими предикторами неблагоприятного почечного исхода заболевания.
Своевременное назначение патогенетической иммуносупрессивной терапии стероид-резистентного нефротического синдрома у детей после подтверждения стероидной резистентности и определения морфологического варианта патологии существенно повышает вероятность развития ремиссии заболевания, что способствует улучшению исхода болезни и снижению инвалидизации пациентов.
Определение аллельного полиморфизма гена AGT (M235T) позволяет прогнозировать эффективность гипотензивной терапии ингибиторами ангиотензин- превращающего фермента у детей со стероид-резистентным нефротическим синдромом, что дает возможность индивидуализировать лечение больных в зависимости от данных генетического тестирования.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Разработанная система прогнозирования риска прогрессирования стероид- резистентного нефротического синдрома у детей включает 13 клинических и 7 морфологических предикторов неблагоприятного почечного исхода с оценкой суммарного вклада значений каждого из них и позволяет с 95% вероятностью выявлять пациентов с высоким риском развития хронической почечной недостаточности.
-
Риск развития стероид-резистентного нефротического синдрома у детей ассоциирован с комбинацией из 3-х полиморфных аллелей гена TRPC6 (c.1683T>C, c.1211C>T, c.43C>T), что свидетельствует о генетической предрасположенности к формированию заболевания.
-
В основе патогенетических механизмов прогрессирования стероид-резистентного нефротического синдрома у детей ключевая роль принадлежит фокально- сегментарному гломерулосклерозу, развитие которого ассоциировано с дигенным носительством полиморфных аллелей подоцитарных генов TRPC6 (c.1683T>C, c.1211C>T, c.43C>T) и NPHS1 (c.349G>A, c.1223G>A), а также с генотипом Т/Т гена AGT (М235Т).
-
Прогрессирование стероид-резистентного нефротического синдрома у детей не ассоциировано с отдельными полиморфными аллелями подоцитарных генов: NPHS2 (c.873+ 7A>G), NPHS1 (c.349G>A, c.791C>G), TRPC6 (c.1683T>C, c.43C>T).
-
Риск развития артериальной гипертензии и выраженной протеинурии более 5 г/1,73 /24ч у детей со стероид-резистентным нефротическим синдромом ассоциирован с генотипом D/D гена ACE (I/D), который рассматривается в качестве маркера предрасположенности к развитию клинических предикторов неблагоприятного почечного исхода.
-
Эффективность иммуносупрессивной терапии 1-й линии у детей со стероид- резистентным нефротическим синдромом не ассоциирована с отдельными полиморфными аллелями подоцитарных генов: NPHS2 (c.873+ 7A>G), NPHS1 (c.349G>A), TRPC6 (c.1683T>C).
Решение поставленных задач осуществлялось в отделении наследственных и приобретенных болезней почек (руководитель - доктор медицинских наук, профессор Длин В.В.) ФГБУ «МНИИ педиатрии и детской хирургии» Минздравсоцразвития России (директор - доктор медицинских наук, профессор Царегородцев А.Д.) и в лаборатории ДНК - диагностики (руководитель - доктор биологических наук, профессор Поляков А.В.)
ФГБУ «Медико-генетический научный центр» РАМН (директор - академик РАМН, доктор биологических наук, профессор Гинтер Е.К.).
Внедрение в практику. Результаты диссертационной работы внедрены в клиническую практику нефрологических отделений ФГБУ «МНИИ педиатрии и детской хирургии» Минздравсоцразвития России и Тушинской детской городской больницы, используются в материалах лекций и практических занятий для студентов, интернов и ординаторов ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова» Минздравсоцразвития России и ординаторов ФГБУ «МНИИ педиатрии и детской хирургии» Минздравсоцразвития России.
По результатам исследований получен патент РФ на изобретение «Способ прогнозирования прогрессирующего течения стероид-резистентного нефротического синдрома при гломерулонефрите у детей» № 2414852 (зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ 27 марта 2011 г.).
Получено разрешение на применение новой медицинской технологии «Прогнозирование течения стероид-резистентного нефротического синдрома у детей на основании полиморфных вариантов гена ингибитора активатора плазминогена-1» ФС № 2011/034 от 11 марта 2011 г.
Апробация материалов диссертации. Результаты исследования и основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X Российских Конгрессах «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2004, 2005, 2006, 2007, 2008, 2009, 2010, 2011); Всемирных Конгрессах нефрологов (Берлин, Германия, 2003; Сингапур, 2005; Милан, Италия, 2009); Конгрессах Международной ассоциации педиатров-нефрологов (Будапешт, Венгрия, 2007; Нью-Йорк, США, 2010), Конгрессах Европейского общества педиатров-нефрологов (Стамбул, Турция, 2005; Палермо, Италия, 2006; Лион, Франция, 2008; Бирмингем, Великобритания, 2009; Дубровник, Хорватия, 2011), Конгрессах Европейской нефрологической ассоциации и Европейского общества диализа и трансплантации (ERA-EDTA) (Стамбул, Турция, 2005; Париж, Франция, 2012), V, VI, XI Российских конгрессах детских нефрологов (Воронеж, 2006; Москва, 2007, 2011), V, VI, VII Конференциях Российского диализного общества (Москва, 2009, 2010, 2011), VI, VII Съездах научного общества нефрологов России (Москва, 2005, 2010), XIV, XV, XVI Российских Национальных Конгрессах «Человек и лекарство» (2007; 2008; 2009), Международной школе по детской нефрологии (Оренбург, 2010), V Съезде Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005), заседаниях нефрологической секции московского общества детских врачей (2006; 2007), научных конференциях ФГБУ «МНИИ педиатрии и детской хирургии» Минздравсоцразвития России (2005; 2007; 2008; 2009; 2011).
Работа отмечена поощрительными грантами Всемирных Конгрессов нефрологов (Сингапур, 2005; Милан, Италия, 2009); Конгресса Международной ассоциации педиатров-нефрологов (IPNA) (Будапешт, Венгрия, 2007), Конгресса Европейского общества педиатров-нефрологов (ESPN) (Стамбул, Турция, 2005), Европейской нефрологической ассоциации и Европейского общества диализа и трансплантации (ERA- EDTA) (2006), VII Конференции Российского диализного общества (Москва, 2011).
Публикации по теме работы. По теме диссертации опубликовано 75 работ в отечественной и зарубежной печати, включая 2 монографии, 8 глав в монографиях и руководствах, 11 статей в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 375 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Диссертация иллюстрирована 144 таблицами и 118 рисунками. Указатель литературы содержит 450 работ, включая 12 отечественных и 438 иностранных источников.
Клиническое значение мутаций и полиморфных вариантов подоцитарных генов в развитии и прогрессировании стероид-резистентного нефротического синдрома у детей
Исследования последних лет существенно изменили понимание патогенетических механизмов прогрессирования гломерулопатий. Достижения молекулярной генетики продемонстрировали генетическую гетерогенность СРНС, обусловленную мутациями в генах, кодирующих белки щелевой диафрагмы и подоцитарного цитоскелета гломерул (49; 167; 204; 211; 423).
Выраженность протеинурии, являющейся характерным проявлением СРНС, как правило, отражает степень дисфункции гломерулярного фильтрационного барьера, который в норме обладает высокоселективной проницаемостью и состоит из нескольких элементов: фенестрированный эндотелий капилляров, 3-х слойная гломерулярная базальная мембрана (ГБМ) и подоциты - высокоспециализированные эпителиальные клетки, которые взаимосвязаны своими отростками с щелевой диафрагмой мультибелковым структурным и сигнальным комплексом, обеспечивающим селективную ультрафильтрацию белков плазмы (155; 291; 326; 417).
Основными функциями подоцитов являются регуляция гломерулярной проницаемости (391), структурная поддержка гломерулярных капилляров, противостояние избыточному растяжению под действием внутрикапиллярного гидравлического давления за счет взаимосвязи с мезангиальными клетками, ремоделирование ГБМ совместно с эндотелиальными и мезангиальными клетками, а также эндоцитоз профильтрованных белков и продукция факторов роста и медиаторов воспаления (187; 197; 226; 353; 377).
Структурные элементы щелевой диафрагмы (нефрин, подоцин, CD2AP) и актинового цитоскелета (а-актинин-4) контролируют дифференцировку и выживаемость подоцитов, клеточную полярность и подвижность их цитоскелета (252) (рис. 2). Эмбриональное развитие подоцитов и гломерул регулируется фактором транскрипции -WT1 и фосфолипазой Сє 1, участвующих в передаче клеточных сигналов (167). Кальциевый канал TRPC6, который локализуется в липидных комплексах мембраны подоцитов, регулирует механовосприятие щелевой диафрагмы, в то время как структурный компонент ГБМ - ламинин-Р2, необходим для клеточно-матриксных взаимодействий подоцитов (107; 327).
Выраженные морфологические изменения подоцитов в виде диффузной редукции малых отросков, снижении дифференцировки и фокальной отслойки, наблюдаемые при НС, имеют обратимый характер при отсутствии первичного подоцитарного дефекта, то есть дисфункция гломерулярного фильтрационного барьера может быть вторичной вследствие иммунных нарушений или наследственного дефекта подоцитов (252).
В течение последнего десятилетия было предложено несколько гипотез развития НС, основанных на экспериментальных, клинических и молекулярно-генетических исследованиях, которые включают два, нередко, взаимосвязанных механизма:
1) иммунная дисрегуляция в виде нарушения созревания и дифференцировки Т- и В-лимфоцитов с индукцией патогенных циркулирующих факторов проницаемости, которая клинически проявляется стероид-чувствительным нефротическим синдромом и реже СРНС с НСМИ, с положительным ответом на иммуносупрессивную терапию и подтверждается возвратом протеинурии после трансплантации почки, положительным эффектом плазмафереза и иммуноабсорбции (27; 84; 351);
2) первичный патологический дефект подоцитарных белков вследствие мутаций кодирующих их генов, которые приводят к модификации цитоскелета подоцитов, что проявляется в виде СРНС (спорадического или семейного) с ФСГС или диффузным мезангиальным склерозом, резистентного к иммуносупрессивной терапии и поледующим прогрессированием в ХПН с отсутствием возврата заболевания после трансплантации почки (339; 413; 423).
В последние годы достижения в области молекулярной генетики убедительно продемонстрировали генетическую гетерогенность СРНС, обусловленную мутациями в генах, кодирующих белки щелевой диафрагмы и подоцитарного цитоскелета (NPHS1, NPHS2, CD2AP, TRPC6, ACTN4), а также в генах, экспрессируемых в гломерулярной базальной мембране (ГБМ) (LAMB2), в митохондриях (COQ2) и генах факторов транскрипции (WT1), необходимых для нормального развития и функционирования подоцитов (табл. 3).
Пристальное внимание исследователей обращено на изучение гена NPHS2, который включает 8 экзонов и кодирует мембранный интегральный белок - подоцин (М=42 кДа), состоящий из 383 аминокислотных остатков. Ген NPHS2 экспрессируется исключительно в гломерулярных подоцитах, локализуясь на наружной поверхности ГБМ, а подоцин взаимодействует с внутриклеточными доменами нефрина и CD2-ассоциированным протеином (CD2AP), являясь ключевым функциональным компонентом щелевой диафрагмы ГБМ (182; 200; 364; 335).
Наличие неповрежденного подоцина обеспечивает внутриклеточную передачу сигналов через нефрин в ГБМ (183). В экспериментальных моделях было установлено, что повреждение структуры щелевой диафрагмы приводит к возникновению протеинурии (207; 336). Интересно, что у NPHS2T мышей отмечалось внутриутробное появление протеинурии и развитие ХПН через несколько дней после рождения (183). При этом морфологическим вариантом являлся не ФСГС, а диффузный мезангиальный склероз с дилатациеи канальцев и вакуолизацией эпителия, напоминающей патологические изменения, обусловленные мутациями в гене NPHS1, кодирующем нефрин. При электронной микроскопии (ЭМ) у NPHS2T мышей выявлена диффузная редукция малых отростков подоцитов и нарушение распределения нефрина и подоцина, что является основной причиной протеинурии у пациентов с первичным приобретенным СРНС (90; 219; 356).
Большинство мутаций в гене NPHS2 приводит к структурным изменениям синтезируемого белка подоцина с измененной внутриклеточной локализацией, реже отмечены мутации, изменяющие функциональные свойства белка, что приводит к нарушениям его взаимосвязи с нефрином и другими подоцитарными белками с последующим нарушением структуры щелевой диафрагмы (63; 298; 336). На основании анализа экспрессии подоцина продемонстрировано, что даже у носителей простых гетерозиготных полиморфных NPHS2 вариантов, как и комбинаций компаунд-гетерозиготных мутаций и полиморфных вариантов, отмечалось нарушение равномерного распределения подоцина с преимущественной локализацией только в теле подоцитов или вдоль ГБМ (443). Выявленные изменения указывают на выраженные изменения структуры щелевой диафрагмы ГБМ и предоставляют основы для обоснования появления протеинурии даже у носителей гетерозиготных мутаций и полиморфных вариантов гена NPHS2.
Клиническая характеристика обследованных детей
Распределение обследованных 120 детей (52 мальчика, 68 девочки) со СРНС по возрасту к моменту первого обследования и полу представлено в таблице 8. Более половины (69,2%) выборки составили пациенты школьного возраста от 7 до 15 лет. Отягощенная наследственность по патологии ОМС (ГН, пиелонефрит, мочекаменная болезнь) выявлена у 53 из 114 (46,5%) пациентов со СРНС, отягощенная наследственность по АГ - у 63 из 114 (55,3%) больных. Манифестация СРНС отмечалась у детей в возрасте 9,5 (5,3; 13,0) лет, в том числе: в возрасте от 1 до 6 лет - у 25% больных (п=30), от 6 до 13 лет - у 45% (п=54), от 13 до 17 лет - у 30% пациентов (п=36). При манифестации заболевания повышение уровня креатинина в крови более 100 ммоль/л наблюдалось у 30,8% (п=37) детей, АГ - у 60,8% (п=73), микрогематурия различной степени выраженности - у 74,2% (п=89) пациентов. Длительность СРНС на момент первого обследования детей в отделении наследственных и приобретенных болезней почек составила 10,0 (4,0; 24,8) месяцев, в том числе: 2-6 месяцев - у 37,5% пациентов, 7-12 месяцев - у 19,2%, 13-24 месяцев- у 18,3%, более 24 месяцев - у 25% больных. Протеинурия 5 г/1,73м /24ч отмечалась у 36,7% детей при первом обследовании, отечный синдром отмечался у 51,7%, гипоальбуминемия 25 г/л - у 33,3%), повышение уровня холестерина в крови более 6,7 ммоль/л - у 67,5%, а также АГ 1-й и 2-й степени - у 55,8% пациентов. При морфологическом исследовании почечной ткани, проведенном у всех 120 пациентов со СРНС, выявлены следующие морфологические варианты: ФСГС у 53 (44,2%) больных, МзПГН у 28 (23,3%), МбПГН у 19 (15,8%), НСМИ у 14 (11,7%), МН у 6 (5%) детей. Повторная нефробиопсия была выполнена у 12 (10%) детей со СРНС, включая 9 (75%) с ФСГС и 3 (25%) - с МзПГН через 58,0 (23,3; 90,5) месяцев от манифестации заболевания перед назначением ингибиторов кальцинейрина при длительном течении заболевания или при лечении циклоспорином А более 24 месяцев. При повторной нефробиопсии морфологический диагноз не был изменен ни у одного пациента со СРНС. Медиана значений СКФ у пациентов со СРНС при первой госпитализации составляла 125,1 мл/мин/1,73м , в том числе: 1-я стадия ХБП (СКФ 90 мл/мин/1,73 Г) отмечена у 82,5% пациентов (п=99), 2-я стадия ХБП (СКФ 60-89 мл/мин/1,73м2) - у 13,3% (п=16), 3-я стадия ХБП (СКФ 30-59 мл/мин/1,73м2) - у 3,3% (п=4), 4-я стадия ХБП (СКФ 15-29 мл/мин/1,73м2) - у 0,8% (п=1), 5-я стадия ХБП (СКФ 15 мл/мин/ 1,73м2) не наблюдалась ни у одного больного.
Медиана значений темпов изменений СКФ в год у детей со СРНС составляла 5,4 (-1,7; 14,6) мл/мин/1,73м /год. В динамике наблюдения функциональное состояние почек оставалось стабильным у 38 (31,7%) детей, снижение СКФ менее 15 мл/мин/1,73м2/год отмечено у 53 (44,2%) и снижение СКФ более 15 мл/мин/1,73м2/год - у 29 (24,2%) больных. Длительность СРНС к моменту последнего обследования больных со СРНС составила 48,0 (28,2; 72,0) месяцев. Катамнестическое наблюдение за пациентами осуществлялось в течение 30,0 (18,0; 48,0) месяцев. Кумулятивная почечная выживаемость у обследованных больных со СРНС снижалась с увеличением длительности заболевания и составляла: 5-летняя - 84% и 10-летняя - 60%, что свидетельствует о прогрессирующем течении заболевания (рис. 12). С целью определения клинических и морфологических предикторов прогрессирования СРНС все пациенты были разделены на 2 группы в зависимости от уровня СКФ при последней госпитализации: 1) прогрессирующее течение СРНС определялось при снижении СКФ 60 мл/мин/1,73м в течение не менее 3 месяцев, что соответствовало 3-5 стадиям ХБП по классификации K/DOQI (п=26); 2) непрогрессирующее течение СРНС отмечалось при СКФ 60 мл/мин/1,73м2, что соответствовало 1 -2 стадиям ХБП по классификации K/DOQI (п=94). Определение эффективности иммуносупрессивной терапии 1-й линии проведено у 87 пациентов со СРНС, включая использование циклофосфана в/в («Лэнс Фарм ООО», Россия) (п=64), циклоспорина А (Сандиммун Неорал, «Новартис Фарма АГ», Швейцария) (п=36), ММФ (СеллСепт, «Ф.Хоффманн - Ля Рош Лтд.», Швейцария) (п=18), такролимуса (Програф, «Астеллас Фарма Юроп Б.В.», Нидерланды) (п=8). Использование ММФ и такролимуса у детей со СРНС разрешено этическим комитетом ФГБУ «МНИИ педиатрии и детской хирургии» Минздравсоцразвития России. Оценка эффективности иммуносупрессивной терапии 2-й линии выполнена у 21 больного со СРНС. Определение эффективности гипотензивной терапии и-АПФ выполнено у 116 детей со СРНС, в том числе проведен анализ в зависимости от полиморфных вариантов генов РАС - АСЕ (I/D), AGT (М235Т), AGTR1 (А1166С) у 89 пациентов. Для установления вклада наследственной отягощенности по патологии ОМС в развитие и прогрессирование СРНС проводили клинико-генеалогическое исследование, которое включало составление и анализ родословных всех пациентов с детальной оценкой сведений о наличии заболеваний ОМС и АГ у родственников пробандов I и II степени родства. Особое внимание обращалось на акушерский анамнез матерей, течение беременности и родов, состояние здоровья детей в период новорожденности и раннем возрасте. Малая масса тела при рождении пациентов со СРНС определялась, в соответствии с рекомендациями ВОЗ, при значениях менее 2500 г, что обусловлено внутриутробной задержкой развития плода с массой тела при рождении менее 10 перцентиля для гестационного возраста или недоношенностью (387). Нефротический синдром определялся как симптомокомплекс в виде протеинурии более Зг/24ч ( 50 мг/кг/24ч или 40 мг/час/м2, что соответствует 1 г/м2/24ч), гипоальбуминемии ( 25 г/л), гиперлипидемии и отеков (295). СРНС характеризовался сохраняющейся протеинурией после 6-8 недель терапии преднизолоном в дозе 2 мг/кг/24ч (максимум 60 мг/24ч) (77; 188).
Гематурия определялась при выявлении более 5 эритроцитов в поле зрения при микроскопическом исследовании мочевого осадка детей со СРНС (400). У всех пациентов определяли клинико-лабораторные особенности манифестации СРНС, в том числе возраст детей, функциональное состояние почек, наличие и выраженность экстраренальных проявлений. Большое внимание уделялось изучению анамнестических данных течения заболевания, длительности и режима дозирования стероидной терапии, а также оценке эффективности иммуносупрессивной терапии 1-й и 2-й линий, осложнений основного заболевания и побочных эффектов проводимого лечения. При клиническом обследовании пациентов со СРНС оценивалось физическое развитие ребенка с использованием центильных таблиц (387). Нормальная масса тела больных определялась при массо-ростовом индексе (МРИ) 5 85 перцентили, избыточная масса - при повышении МРИ 85 95 перцентили, ожирение - при МРИ 95 перцентили для соответствующего возраста и пола ребенка (34; 69). Всем пациентам со СРНС определяли уровень АД при 3-х кратном измерении аускультативным методом в зависимости от возраста, пола и роста ребенка. Нормальное АД определялось при средних значениях систолического артериального давления (САД) и/или диастолического артериального давления (ДАД) 90 перцентили (288). В соответствии с рекомендациями Европейского Общества Гипертензии и Европейского Общества кардиологии высокое нормальное АД определялось при повышении средних значений САД и/или ДАД 90 и 95 перцентиля (247; 255). АГ определялась при повышении средних значений САД и/или ДАД 95 перцентили (288). Выраженность АГ определялась по стадиям: 1 стадия - при АД 95 99 перцентили плюс 5 мм рт ст; 2 стадия - при АД 99 перцентили плюс 5 мм рт ст (255; 288).
Морфологические предикторы прогрессирования стероид-резистентного нефротического синдрома у детей
При морфологическом исследовании почечной ткани, проведенном у всех 120 пациентов со СРНС, выявлены следующие морфологические варианты: ФСГС - у 53 (44,2%) больных, МзПГН - у 28 (23,3%), МбПГН - у 19 (15,8%), НСМИ - у 14 (11,7%), МН у - 6 (5%) детей. Повторная нефробиопсия была выполнена у 12 (10%) детей со СРНС, включая 9 (75%) с ФСГС и 3 (25%) - с МзПГН через 58,0 (23,3; 90,5) месяцев от манифестации заболевания перед назначением ингибиторов кальцинейрина или при лечении циклоспорином А более 24 месяцев. При повторной нефробиопсии морфологический диагноз не был изменен ни у одного пациента со СРНС. Сравнительный анализ функционального состояния почек у пациентов со СРНС при последнем катамнестическом наблюдении в зависимости от морфологического варианта заболевания выявил, что ХБП 1-й стадии статистически значимо чаще отмечалась у пациентов с МзПГН, НСМИ и МН (р 0,0001), а снижение СКФ более 60 мл/мин/1,73м2, соответствующее ХБП 3-5 стадиям, выявлено у 39,6% больных с ФСГС (р=0,0007) (табл. 39). У пациентов с ФСГС при динамическом наблюдении отмечались статистически значимо быстрые темпы снижения СКФ в год по сравнению с больными с МзПГН (р=0,0004) и НСМИ (р=0,003) (рис. 50). Отсутствие снижения ежегодного СКФ в динамике наблюдения отмечалось статистически значимо чаще у больных с МзПГН и НСМИ: 46,4% и 50% (р=0,043), а быстрые темпы снижения СКФ более 15 мл/мин/1,73м2/год выявлены чаще у больных с ФСГС - 39,6% (р=0,007) (табл. 40). Анализ структуры морфологических вариантов СРНС выявил статистически значимое превалирование ФСГС у пациентов с прогрессирующим течением СРНС по сравнению с детьми с сохранными функциями почек: 80,9% и 34%, соответственно (р 0,0001) (табл. 41). При этом, у больных с МзПГН статистически значимо чаще отмечалось непрогрессирующее течение СРНС: 28,7% и 3,8% (р=0,004). Установлена статистически значимая большая длительность СРНС до проведения нефробиопсии у детей с прогрессирующим течением заболевания по сравнению с детьми с сохранными функциями почек: 16,0 (10,3; 32,8) и 11,0 (5,0; 23,0) месяцев, соответственно (р=0,008) (рис. 51). Кумулятивная почечная выживаемость статистически значимо различалась у больных с прогрессирующим и непрогрессирующим течением СРНС с различными морфологическими вариантами (р=0,0034). 5-летняя почечная выживаемость составила: 100% - при НСМИ и МН, 94,1% - при МзПГН, 85,2% - при МбПГН и 73,2% - при ФСГС. 10-летняя почечная выживаемость составила: 100% - при НСМИ и МН, 94,1% при МзПГН, 42,6% при МбПГН и 38,8% при ФСГС (рис. 52). Анализ выраженности склеротических изменений в почечной ткани больных показал, что у детей с прогрессирующим течением СРНС по сравнению с больными с сохранными функциями почек статистически значимо чаще отмечались сегментарный склероз более 25% гломерул: 53,9% и 12,8% (р 0,0001), склероз мезангиального матрикса, отражающий степень вовлечения гломерул: 57,7% и 28,7% (р=0,001), диффузный фиброз интерстиция: 46,2% и 5,3% (р 0,0001) и гипертрофия мышечного слоя внутрипочечных артериол: 46,2% и 17% (р 0,003), а также артериолосклероз: 26,9% и 12,8% (р=0,078) (табл. 42). Кумулятивная почечная выживаемость статистически значимо была ниже у больных с сегментарным склерозом 25% гломерул по сравнению с пациентами с меньшей выраженностью сегментарного гломерулосклероза (р=0,000001): 5-летняя почечная выживаемость - 56,5% и 91,5%; 10-летняя почечная выживаемость - 15,9% и 74%, соответственно (рис. 53). Кумулятивная почечная выживаемость статистически значимо была ниже у больных со склерозом мезангиального матрикса по сравнению с пациентами без мезангиального склероза: 5-летняя почечная выживаемость - 73,1% и 89,7%; 10-летняя почечная выживаемость - 34,2% и 76,4%, соответственно (р=0,001) (рис. 54).
Анализ ассоциаций мутаций и полиморфных аллелей гена NPHS1 с развитием и прогрессированием стероид-резистентного нефротического синдрома у детей
Исследование ассоциаций мутаций и вариантных аллелей в гене NPHS1, кодирующем белок щелевой диафрагмы - нефрин, с развитием и прогрессированием СРНС выполнено у 53 детей (22 мальчиков и 31 девочек) в возрасте 16,0 (12,0; 17,0) лет из различных регионов России. У 51 (96,2%) обследованных пациентов со СРНС проведено молекулярно-генетическое исследование гена NPHS1, кодирующего подоцин, в результате которого мутации не были идентифицированы.
Медиана возраста манифестации СРНС у больных составляла 9,5 (6,0; 13,0) лет. У 11 (20,7%) пациентов манифестация заболевания отмечена в возрасте 1-5 лет, у 26 (49,1%) - в 6-12 лет, у 16 (30,2%о) - в 13-17 лет. При гистологическом исследовании нефробиоптатов ФСГС выявлен у 26 (49,1%) больных, МзПГН - у 12 (22,6%), МбПГН - у 8 (15,1%), МН - у 4 (7,5% ), НСМИ - у 3 (5,7%). Длительность заболевания составила 60,0 (36,0; 84,0) месяцев. Катамнестическое наблюдение за пациентами осуществлялось в течение 42,0 (24,0; 60,0) месяцев.
В результате проведенного молекулярно-генетического исследования у пациентов со СРНС не выявлено мутаций в гене NPHS1, ассоциированных с развитием врожденного нефротического синдрома финского типа: Fin-major - с. 121 (dell2) (L41fsX90) и Fin-minor -c.3325OT(R1109X).
У одного (1,9%) ребенка с ФСГС идентифицирована нуклеотидная замена не описанная ранее в гетерозиготном состоянии c.l218G A (p.Ala406Ala) в экзоне 10 гена NPHS1, которая рассматривается в качестве мутации, так как изменяет вероятность сайта сплайсинга на 10%. В контрольной группе, состоящей из 100 человек, не выявлено данной нуклеотидной замены: 1/53 (1,9%) и 0/100 (0%), соответственно (р=0,35). У пациента с выявленной NPHS1 мутацией манифестация заболевания наблюдалась в возрасте 12 лет с повышением уровня креатинина в крови, АГ и гематурией, СКФ оставалась сохранной 90 мл/мин/1,73м при длительности заболевания 66 месяцев.
В результате проведенного анализа 29 экзонов и прилегающих регуляторных областей гена NPHS1 у 33 (62,3%) пациентов со СРНС было выявлено 4 вида замен нуклеотидных последовательностей, ранее описанных в генетической базе данных SNP NCBI (табл. 59).
Суммарная частота полиморфных аллелей гена NPHS1 у детей со СРНС статистически значимо не отличалась от группы контроля: 31/53 (58,5%) и 34/50 (68%), соответственно (р=0,47); 0111=0,66 (95%ДИ: 0,3-1,5). Распределение аллельных частот и генотипов по полиморфизмам гена NPHS1 у детей со СРНС в сравнении с группой контроля и популяционными данными находилось в соответствии с равновесием Харди Вайнберга, что свидетельствует об отсутствии ассоциации исследуемых вариантных аллелей c.349G A, c.791C G, с.1175С Т и C.1223G A с развитием СРНС в изучаемой выборке (табл. 60).
Сравнительный анализ клинических характеристик больных со СРНС в зависимости от наличия полиморфных аллелей гена NPHS1 не выявил статистически значимых различий возраста манифестации патологии, выраженности протеинурии, длительности заболевания и сроков катамнестического наблюдения (табл. 61).
При сравнительном анализе распределения морфологических вариантов СРНС у детей не установлено ассоциаций с наличием полиморфных аллелей гена NPHS1 (табл. 62).
Медиана значений СКФ при последнем катамнестическом наблюдении статистически значимо не различалась у пациентов с наличием и отсутствием полиморфных аллелей гена NPHS1: 135,4 (75,4; 168,5) и 123,6 (73,0; 149,4) мл/мин/1,73м2 (р=0,17). Снижение СКФ менее 60 мл/мин/1,73м2 наблюдалось с одинаковой частотой у детей с наличием и отсутствием полиморфных аллелей гена NPHS1:1 (22,6%) и 4 (19,1%) (р=0,52),ОШ=1,2 (0,3-4,9).
При динамическом наблюдении темпы изменения СКФ в год статистически значимо не различались у детей со СРНС в зависимости от наличия полиморфных аллелей гена NPHS1 (табл.63).
Похожие диссертации на Клинические и генетические закономерности прогрессирования стероид-резистентного нефротического синдрома у детей и эффективность иммуносупрессивной терапии
