Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Эпидемиология инфекции H.pylori 10
1.2. Методы выявления инфекции H.pylori 11
1.3. Генетические особенности H.pylori и их роль в развитии хеликобактер-ассоциированной гастродуоденальной патологии 14
1.4. Особенности иммунного ответа на инфекцию H.pylori у детей 23
1.5. Особенности полиморфных вариантов генов 1ЫВ и IL10 у детей с хронической //.ру/оп-ассоциированной гастродуоденальной патологией 26
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 30
2.1. Материалы исследования 30
2.2. Методы исследования
2.2.1. Общеклинические методы исследования 47
2.2.2. Методы диагностики H.pylori
2.2.2.1. Дыхательный Хелик-тест 49
2.2.2.2. Цитологический метод 50
2.2.2.3. ПЦР биоптатов слизистой оболочки желудка 51
2.2.3. Определение полиморфизма генов интерлейкинов 54
2.2.4. Определение концентрации про- и противовоспалительного интерлейкинов в сыворотке крови 55
2.2.5. Статистические методы исследования 58
ГЛАВА 3. Характеристика диагностических методов выявления H.pylori при хронической патологии гастродуоденальной области у детей 59
ГЛАВА 4. Клинико-морфологические особенности хронической гастродуоденальной патологии у детей, инфицированных cagA+ и cagA - штаммами H.pylori
ГЛАВА 5. Цитокиновый статус и полиморфизм генов интерлейкинов у детей с различными клиническими проявлениями и течением хронической Я./ту/оп -ассоциированной патологии гастродуоденальной области 84
Заключение 98
Выводы 110
Практические рекомендации 112
Список сокращений 113
Список литературы
- Методы выявления инфекции H.pylori
- Общеклинические методы исследования
- Определение концентрации про- и противовоспалительного интерлейкинов в сыворотке крови
- Клинико-морфологические особенности хронической гастродуоденальной патологии у детей, инфицированных cagA+ и cagA - штаммами H.pylori
Введение к работе
Актуальность исследования. Одним из основных этиологических факторов возникновения и развития хронической гастродуоденальной патологии у детей в настоящее время является инфекция H. pylori [Корниенко Е.А. 2011, Хомерики С.Г. и соавт., 2011, Каганов Б.С. и соавт., 2012, . et al., 2013, . et al., 2013]. У больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки она встречается в 87% случаев, а у детей с хроническим гастродуоденитом – в 42% [Корниенко Е.А., 2011, Graham D.Y. et al., 2000].
Высокая распространенность H.pylori не всегда коррелирует с частотой гастродуоденальной патологии, ассоциированной с данным микроорганизмом. В настоящее время установлена связь хеликобактериоза с развитием хронического гастрита, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки и рака желудка [Ющук Н.И. и соавт., 2006, Климович А.В., 2010, Щербаков П.Л. и соавт., 2010, T.L. et al., 2010, M.Y. et al., 2013]. Различия в восприимчивости к H.pylori могут быть обусловлены особенностями инфекционного агента и иммунореактивностью хозяина, определяемыми вариабельностью генотипов хеликобактера в отношении факторов вирулентности, а также полиморфизмом генов иммунного ответа у носителей инфекционных агентов [Печкуров Д.В., 2002, Родионов В.А. и соавт., 2003, Маев И.В. и соавт., 2008].
Несмотря на то, что проблема H.pylori-ассоциированной гастродуоденальной патологии у детей, казалось бы, хорошо освещена в литературе, разработаны общенациональные программы по их лечению и профилактике, генетические основы заболеваний гастродуоденальной области остаются малоисследованными.
Мнение некоторых ученых сводится к тому, что развитие, особенности течения и частота рецидивов хронической H.pylori-ассоциированной гастродуоденальной патологии у взрослых могут быть ассоциированы с наличием у индивидов определенных генотипов хеликобактера, в том числе гена cagA [Решетников О.В. и соавт., 2005, Камнева Н.В. и соавт., 2007, Нижевич А.А. и соавт., 2012, Bronte-Tinkew D.M. et al., 2009], а также вариантов полиморфных локусов генов ключевых иммуномедиаторов про- (-511Т/С гена IL1B) и противовоспалительных (-1082G/A гена IL10) реакций [ J. et al., 2011, H.H. et al., 2010, Kimang'a A.N. et al., 2012, T. et al., 2012], но многие из этих положений остаются дискутабельными.
Цель исследования
Изучить клинико-морфологические особенности хронических гастродуоденальных заболеваний в зависимости от генетического статуса H.pylori и полиморфизма генов IL1B и IL10 для совершенствования диагностики и прогнозирования исходов хронической H.pylori-ассоциированной гастродуоденальной патологии у детей.
Задачи исследования
1. Определить частоту выявления H.pylori и cagA-позитивных штаммов H.pylori у детей с хронической гастродуоденальной патологией г. Казани.
2. Провести оценку диагностической ценности методов выявления H.pylori.
3. Изучить особенности клинических проявлений и морфологических изменений при хронической гастродуоденальной патологии у детей инфицированных cagA+ и cagА- штаммами H.pylori.
4. Оценить взаимосвязь полиморфизмов генов IL1В и IL10 с течением и исходом хронических заболеваний желудка и двенадцатиперстной кишки у детей.
5. Обосновать дифференцированный подход к наблюдению детей с хронической гастродуоденальной патологией, ассоциированной c H.pylori-инфекцией.
Научная новизна полученных результатов
Впервые проведено исследование взаимосвязи генетических особенностей H.pylori и двух полиморфизмов генов про- и противовоспалительного цитокинов с развитием и течением хронической гастродуоденальной патологии у детей.
Впервые установлена частота колонизации cagA-позитивных штаммов H.pylori у детей с гастродуоденальной патологией в г. Казани. Особое внимание уделено вопросам совершенствования диагностики H.pylori-ассоциированных заболеваний у детей. Для повышения чувствительности и специфичности, а также уменьшения доли ложноположительных и ложноотрицательных результатов при верификации H.pylori предложено применение комбинации дыхательного Хелик-теста и ПЦР биоптатов слизистой оболочки желудка.
Проведен анализ ассоциации риска возникновения и развития основных фенотипических признаков хронических заболеваний гастродуоденальной области с наличием основного гена патогенности H.pylori и полиморфными маркерами, ранее не исследованными у детей.
Выявлены особенности клинического течения и морфологической картины слизистой оболочки желудка в зависимости от инфицирования высокопатогенными штаммами H.pylori и полиморфизмов -511Т/С гена IL-1B и -1082G/A гена IL-10. На основании полученных данных разработан алгоритм прогнозирования течения и исхода хронической H.pylori-ассоциированной гастродуоденальной патологии у детей.
Теоретическая и практическая значимость
Полученные данные открывают дополнительные возможности в оценке факторов риска развития хронической H.pylori-ассоциированной гастродуоденальной патологии. Они могут служить объективными критериями для формирования групп риска по заболеваниям желудка и ДПК и разработки индивидуальных программ профилактики с учетом генотипирования. Определение генов патогенности H.pylori и полиморфизмов -511Т/С гена IL-1B и -1082G/А гена IL-10 рекомендовано использовать при популяционных исследованиях в группах детей с отягощенной наследственностью по гастродуоденальной патологии.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Комбинация дыхательного Хелик-теста и полимеразной цепной реакции при верификации H.pylori-инфекции у детей имеет высокую диагностическую ценность.
2. Инфицирование H.pylori cagA+ повышает риск развития эрозивно-язвенных поражений и кишечной метаплазии слизистой оболочки гастродуоденальной области у детей.
3. Полиморфизмы –511Т/С гена IL1B и -1082G/А гена IL10 ассоциируются с особенностями течения и клинических проявлений хронической H.pylori-ассоциированной гастродуоденальной патологии, а наличие мутантного аллеля полиморфизма -511Т/С гена IL1B - с повышенным риском развития кишечной метаплазии слизистой оболочки гастродуоденальной области у детей.
Апробация результатов работы
Основные положения работы доложены на XIV Славяно-Балтийском научном форуме (Санкт-Петербург, 2012); IX Российской конференции «Педиатрия и детская хирургия в Приволжском федеральном округе», Российской научно-практической конференции «Инфекции и соматическая патология» (Казань, 2013), XV Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2010), где автору было присуждено II место, XVIII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2013), где было присуждено III место.
Апробация работы была проведена на совместном заседании кафедр пропедевтики детских болезней и факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета, госпитальной педиатрии с курсом поликлинической педиатрии и постдипломного образования, детских инфекций ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Минздрава России, педиатрии и неонатологии ГБОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия» Минздрава России.
Публикации по теме диссертации
По теме диссертации опубликовано 16 работ, из них 4 – в журналах, рецензируемых Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации.
Личный вклад автора
Весь объем клинических наблюдений и специальных методов исследования осуществлен при участии диссертанта. Автором составлен дизайн, определены цели и задачи, выбраны методы, спланировано проведение исследования по всем разделам диссертации, проведен обзор научной литературы по исследуемой проблеме. Диссертант самостоятельно провел ПЦР-исследование на базе центральной научно-исследовательской лаборатории ГБОУ ВПО КГМУ (зав. лабораторией – д.м.н., профессор Семина И.И.) и статистическую обработку полученных данных, сформулировал основные научные положения работы, выводы и представил практические рекомендации.
Внедрение результатов исследования в практику здравоохранения
Результаты исследования внедрены в работу 3-го корпуса ГАУЗ «ДРКБ МЗ РТ», педиатрического отделения ГАУЗ «Клиника медицинского университета». Материалы диссертации используются в педагогическом процессе при обучении студентов, интернов, ординаторов на кафедре пропедевтики детских болезней и факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета ГБОУ ВПО «Казанский ГМУ» МЗ РФ.
Структура диссертации и ее объем
Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста, иллюстрирована 30 таблицами и 25 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследования, трех глав собственных наблюдений, заключения, выводов, практических рекомендаций. Список литературы включает 194 источника, в том числе 106 отечественных и 88 зарубежных авторов.
Методы выявления инфекции H.pylori
Высокая распространенность хеликобактерной инфекции как среди взрослого, так и детского населения, а так же ее связь с развитием хронической патологии гастродуоденальной области выявила необходимость поиска чувствительных и точных методов диагностики. Это способствовало появлению множества различных способов выявления H.pylori и создало для врачей-клиницистов, специалистов лабораторной диагностики определенные трудности в выборе адекватных и достоверных методов ее обнаружения [54].
Среди всего многообразия диагностических тестов, разработанных для выявления H.pylori, выделяют несколько групп - инвазивные и неинвазивные, прямые и косвенные. Инвазивные методы основаны на взятии биоптатов при проведении эзофагогастродуоденоскопия (ЭГДС). К ним относятся бактериологический (культуральный), морфологический (гистологический и цитологический) и биохимичекий методы, а также полимеразная цепная реакция (ПНР) биоптатов СО желудка. Неинвазивные тесты не требуют проведения ЭГДС, материалом для исследования являются кровь, кал, моча, слюна, выдыхаемый пациентом воздух. К ним относятся серологические и иммунологические реакции, ПЦР исследование кала, дыхательные тесты [10, 25, 68]. Прямые методы основаны на непосредственном выявлении микроорганизма в биоптате СО желудка, косвенные - регистрируют не саму бактерию, а последствия ее персистирования в организме [10, 24]. Материал для исследования, как правило, забирается в процессе эндоскопии, которая имеет значительную самостоятельную диагностическую ценность. К специфическим морфологическим признакам Я./ту/оп -инфекции можно отнести наличие язв в ДПК, множественных разнокалиберных выбуханий на стенках СО антрального отдела желудка, гиперемию СО, наличие мутной слизи в просвете желудка, отек и утолщение складок антрального отдела желудка [45].
«Золотым стандартом» диагностики H.pylori является морфологическое исследование биоптата СО желудка, позволяющее обнаружить бактерии и определить их расположение, наблюдать взаимоотношение с тканями «хозяина», оценить характер патологического процесса в СО, наличие воспаления, атрофии, метаплазии. Его чувствительность оценивается как 70-90%, а специфичность - 97-99% [54, 97, 98]. К недостаткам бактериологического метода относятся: необходимость дорогостоящего оборудования лаборатории и реактивов, специальных питательных и транспортных сред и отсроченность сроков получения результатов [6, 60].
Противоречивы сведения литературы о диагностической ценности цитологического метода обнаружения H.pylori. По данным одних авторов применение цитологического метода для идентификации хеликобактериоза малоинформативно, его чувствительность составляет в среднем 18-20%. [94, 97]. Другие же авторы называют цитологическое исследование мазков отпечатков с биоптата СО желудка «наиболее приемлемым способом определения инфекции H.pylori». Чувствительность метода, по данным разных авторов, колеблется от 90 до 100%, специфичность от 89 до 100% [17, 89, 98, 147, 191].
Новые возможности бактериологической диагностики хеликобактериоза открыла ПЦР - технология: идентификацию H.pylori не только в чистых культурах, но и непосредственно в исследуемом материале, минуя трудоемкую, продолжительную и дорогостоящую процедуру культивирования его на искусственных питательных средах [73, 177]. С помощью ПЦР стало возможным определение видоспецифического фрагмента ДНК, что позволяет типировать штамм бактерии, оценивать свойства микроорганизма, в частности его токсигенность, по обнаружению генов cagA, vacA, iceA, ЪаЪА и других [108]. Чувствительность ПЦР в биоптате колеблется от 81 до 91 %, специфичность от 90 до 100% [40].
Биохимические (уреазные) методы основаны на изменении цвета индикатора при ощелачивании среды аммиаком, образующемся при гидролизе мочевины уреазой Н.pylori. Уреазная активность H.pylori настолько велика, что проявляется не только в чистой культуре, но и в биоптатах СО желудка. На отечественном рынке широко представлен Хелпил-тест, его чувствительность -95%, специфичность -96% [68].
Из неинвазивных методов диагностики в России нашли свое применение серологический метод, дыхательные тесты и определение микроорганизма в кале методом ПЦР.
Среди неинвазивных дыхательных методов выделяют: Ureath Breath Test (UBT), Хелик-тест. В их основе лежит простая химическая реакция, обусловленная способностью H.pylori гидролизовать мочевину с образованием иона-аммония и бикарбонат-иона [39]. Чувствительность дыхательных методов диагностики колеблется от 90 до 97%, специфичность от 92 до 100% [41, 68, 94, 97, 189].
Серологический метод основан на определении антител IgG к H.pylori в крови. Его применяют для скрининга в популяции и первичной диагностики хеликобактериоза, однако мало информативен у детей в связи со слабым иммунным ответом. С помощью серологического метода невозможно различить прошедшую или текущую инфекцию, поэтому он не рекомендован для оценки эффективности эрадикации H.pylori [10].
Иммунологические методы определения H.pylori включают: иммуноферментный анализ, иммунохроматографические тесты, в том числе технику иммуноблотинга и реакцию гемагглютинации. Материалом для исследования служит слюна, кал, моча. Однако эти методы не получили широкого применения в практике из-за невысокой специфичности и используется преимущественно для научных целей [69, 166, 192].
Среди всего многообразия методов выявления H.pylori не существует универсального способа диагностики хеликобактериоза. Во время проведения многочисленных сравнительных исследований установлено, что результаты различных тестов не всегда идентичны, следовательно, для более точной первичной диагностики инфекции необходимо использовать как минимум два теста [10], один из которых - определение H.pylori в биоптате СО желудка [45]. При первичной диагностике предпочтение отдается инвазивным методам еще и потому, что главной целью исследования является выяснение причин симптомов заболевания, а не только идентификация H.pylori [154].
Общеклинические методы исследования
Для решения поставленных задач проведен анализ жалоб, анамнеза жизни и заболевания пациентов, данных амбулаторных карт, объективного осмотра на момент поступления и в период пребывания в стационаре, результатов лабораторных и инструментальных методов исследования детей.
Для выявления анамнестических данных применено анкетирование пациентов и их родителей с помощью специально разработанной анкеты, которая включала вопросы, связанные с медико-социальным анамнезом, наследственностью, медико-биологической характеристикой детей, их предпочтениями в питании до и после постановки диагноза хронического заболевания ЖКТ, диспансеризацией пациентов с гастродуоденальной патологией.
Всем детям проводился клинико-лабораторный комплекс обследований согласно стандартам оказания медицинской помощи больным с хроническими заболеваниями гастродуоденальной области. Диагноз ставился на основании: - жалоб, анамнеза заболевания и жизни больного; - клинического обследования ребенка; - лабораторных методов исследования: общий анализ крови с лейкоформулой, биохимический анализ крови, исследование сыворотки крови методом иммуноферментного анализа (ИФА) на содержание спонтанных ИЛ-ір, ИЛ-8, ИЛ-10 и ФНО-а, общий анализ мочи, анализ кала на яйца глистов и цисты лямблий, копрологический анализ; - инструментальных методов исследования: ЭГДС с биопсией СО антрального отдела желудка и последующим морфологическим изучением ее структуры, ультразвуковое исследование (УЗИ) органов брюшной полости, обследование на H.pyloh; - по показаниям дуоденальное зондирование и электрокардиография (ЭКГ); - консультации специалистов (оториноларинголога, невропатолога, аллерголога, гинеколога) по показаниям. Перед ЭГДС всем детям проведена скрининг-диагностика H.pylori с помощью дыхательного Хелик-теста разработанного ООО «АМА» (г. Санкт-Петербург). Во время ЭГДС оценивали макроскопическую структуру СО эзофагогастро дуоденальной области с выявлением характера патологического процесса и косвенных признаков хеликобактерной инфекции: отек и утолщение складок антрального отдела и тела желудка, СО типа «булыжной мостовой», мутной слизи в просвете желудка, эрозивного гастродуоденита и язвенного дефекта в желудке или ДИК кишке [97]. Для морфологического подтверждения хронического воспаления во время ЭГДС пациентам проводили взятие биопсийного материала СО антрального отдела желудка.
Для подтверждения наличия инфекции H.pylori у детей применяли цитологический метод и ПНР биоптатов СО антрального отдела желудка.
Дальнейший диагностический поиск был связан с выявлением основного гена патогенности H.pylori cagA и генетических особенностей ребенка (полиморфизм -511Т/С гена 1ЫВ и -1082G/A гена IL10), а также количественным определением про- (ИЛ-8, ИЛ-1(3, ФНО-а) и противовоспалительного (ИЛ-10) цитокинов в сыворотке крови.
Ген cagA PAI H.pylori в биоптатах определяли по стандартной методике с использованием наборов реагентов «Хеликопол» НПФ «Литех» (Россия).
Определение содержания цитокинов в сыворотке крови проводили методом иммуноферментного анализ (ELISA) с помощью наборов фирмы «Вектор-Бест» (г. Новосибирск) на базе ФБУН КНИИЭМ Роспотребнадзора (врач-лаборант, к.м.н. Агафонова Е.В.).
УЗИ печени, желчного пузыря, поджелудочной железы, почек проводилось аппаратом «Tochiba - 140-А» с помощью датчика длиной волны 5 МГц, работающего в режиме реального времени по общепринятой методике, секторальным сканированием. При этом учитывалось состояние паренхимы и размеры печени, поджелудочной железы, почек; форма, размеры и положение желчного пузыря, состояние его стенок, наличие в просвете эхогенных структур.
Для верификации инфекции H.pylori применяли непрямой неинвазивный биохимический метод (дыхательный Хелик-тест) и два прямых инвазивных метода (цитологический и ПЦР биоптатов СО антрального отдела желудка с детекцией ureC гена островка патогенности микроорганизма).
Дыхательный тест проводили с помощью тест-системы Хелик с дыхательными трубками, разработанного ООО «АМА» (г. Санкт-Петербург). Принцип действия Хелик-теста основан на биохимическом методе определения инфицированности H.pylori по ее уреазной активности и способности быстро гидролизовать карбамид, вызывая усиленное образование аммиака.
Для получения истинного результата диагностики хеликобактерной инфекции с помощью дыхательного Хелик-теста пациенты за 5 дней не должны получать средства, снижающие кислотность желудочного сока, обезболивающие и противовоспалительные препараты и за 2 недели -антибиотики. Сначала оценивался базальный уровень аммиака в выдыхаемом пациентом воздухе, после чего ребенок принимал раствор карбамида и измерялся нагрузочный уровень. Если разница между базальным и нагрузочным уровнями составляла более 3 мм, пациента считали //./?у/оп-позитивным, менее 3 мм - H.pylori-негативным, была равна 3 - результат оценивали, как сомнительный и при постановке диагноза опирались на другие методы диагностики инфекции.
Определение концентрации про- и противовоспалительного интерлейкинов в сыворотке крови
Способность H.pylori проявлять высокую уреазную активность, вследствие которой быстро гидролизуется карбамид на аммиак и углекислый газ, легла в основу Хелик-теста. Проведен анализ концентрации аммиака в воздухе ротовой полости по показателям базального, нагрузочного и уровня прироста дыхательного метода у пациентов с гастродуоденальной патологией и у детей группы контроля. Исследование с помощью индикаторных трубок показало, что дети из группы контроля имели значимо более низкую исходную концентрацию аммиака, которая составила в среднем 0,22±0,04 мг/м3, чем пациенты с ХГД и ЯБ ДПК (0,48±0,04 и 0,46±0,08, соответственно) (р 0,05). После приема 500 мг мочевины у всех больных с хронической гастродуоденальной патологией наблюдался статистически значимый прирост концентрации аммиака, который в среднем составил у пациентов с ХГД -1,28±0,08 мг/м3, с ЯБ ДПК - 1,13±0,12мг/м3. Оба значения достоверно выше таковых у детей группы контроля (р 0,05). Значимых различий между пациентами с ХГД и ЯБ ДПК выявлено не было (таблица 3.3). различие между результатами дыхательного Хелик-теста у пациентов с ХГД и детей группы контроля, 2:3 - различие между показателями у больных с ЯБ ДПК и детей группы контроля (критерий Фишера).
Проведенный корреляционный анализ не выявил значимой взаимосвязи между базальным и уровнем прироста дыхательного Хелик-теста у пациентов с //.ру/оп -ассоциированной гастродуоденальной патологией (г=0,04, р 0,05), но обнаружил сильную положительную связь между нагрузочной концентрацией и ее приростом (г=0,903, р 0,05, чувствительность корреляции 99,9%). Следовательно, нарастание концентрации аммиака после приема мочевины не зависит от его исходного уровня, а является результатом уреазной активности бактерии, поэтому уровень прироста может служить критерием оценки наличия H.pylori у пациентов.
При проведении корреляционного анализа между показателем прироста концентрации аммиака в выдыхаемом воздухе при использовании дыхательного теста и степенью обсемененности СО антрального отдела желудка по результатам микроскопии мазков-отпечатков биоптатов статистически значимую ассоциацию выявить не удалось, поэтому по уровню прироста о количестве H.pylori, заселяющих СО желудка, судить нельзя (г=0,32, р 0,05).
Высокую информативность при диагностике инфекции H.pylori имеет цитологический метод исследования. Кроме наличия бактерии, по мазкам-отпечаткам биоптатов можно судить о степени обсемененности, а также об активности и выраженности морфологических изменений СО желудка, связанных с инвазией микроба (воспаление, атрофия, метаплазия, дисплазия) [97].
Анализ данных, полученных с помощью цитологического метода диагностики, выявил, что более чем у половины обследованных пациентов встречалась слабая степень обсемененности (55,4%) (рисунок 3.3), средняя степень обнаружена у 17,3% больных (рисунок 3.4), сильная - у 27,3% пациентов (рисунок 3.6) (таблица 3.5)
При поверхностном ХГД чаще была выявлена слабая степень обсемененности. Это свидетельствует о том, что чем меньше обсемененность H.pylori, тем менее выражены изменения СО гастродуоденальной области (р 0,05). У пациентов с ЯБ ДПК также значимо чаще встречалась слабая обсемененность, так как большинство детей, вошедших в исследование, имели стаж заболевания более года, регулярно проходили противорецидивное лечение и находились под диспансерным наблюдением. У больных с гипертрофическим ХГД значимых различий между степенями обсемененности обнаружено не было. Реже, чем при других формах гастродуоденальной патологии, была выявлена слабая обсемененность (рисунок 3.6).
При проведении корреляционного анализа установлена положительная достоверная взаимосвязь между степенью обсемененности и вариантом поражения СО гастродуоденальной области (г=0,31, р 0,05). Кроме того, выявлена положительная взаимосвязь средней силы между степенью обсемененности H.pylori и выраженностью лимфоцитарной и нейтрофильной инфильтрации СО антрального отдела желудка (г=0,44, р 0,01). Между степенью обсемененности H.pylori, выраженностью кишечной метаплазии и пролиферации покровно-ямочного эпителия значимой связи обнаружено не было.
Таким образом, выявлено, что H.pylori является ведущим этиологическим фактором развития хронической гастродуоденальной патологии более чем у 80% детей. Подтверждено, что дыхательный Хелик-тест и ПЦР при диагностике инфекции H.pylori имеют одинаково высокую Se (94,8% и 93,6%)), но низкую Sp (80,6% и 79,5% ) и высокую вероятность хеликобактериоза при отрицательных результатах методов (19,4% и 18,4%). Поэтому для первичной диагностики инфекции H.pylori лучше использовать комбинацию тестов (Хелик-тест и ПЦР биоптатов СО желудка), что уменьшит долю ЛП и ЛО данных, повысит Se (98,3%), Sp (93,5%o), общую точность (96% ), а также вероятность хеликобактериоза при положительном результате (96,6%) и уменьшит вероятность инфекции H.pylori при отрицательном ответе методов (6,4%)).
Клинико-морфологические особенности хронической гастродуоденальной патологии у детей, инфицированных cagA+ и cagA - штаммами H.pylori
Высокая распространенность хеликобактериоза не всегда коррелирует с частотой гастродуоденальной патологии, ассоциированной с данным микроорганизмом. В различных ситуациях один и тот же штамм H.pylori может проявлять разную патогенность, что обусловлено не только факторами вирулентности и колонизации бактерии, но и генетическими особенностями конкретного человека, а также влиянием окружающей среды.
Интенсивность и продолжительность воспалительного процесса у разных лиц различается, что может зависеть от количества вырабатываемых в СО желудка и ДНК интерлейкинов. У одних пациентов воспаление протекает агрессивно, с высокими значениями лихорадки, у других, напротив, хронически, не сопровождаясь системными изменениями [20]. При адгезии H.pylori на эпителиоциты происходит синтез ИЛ-8, ФНО-а, ИЛ-1р и ИЛ-6 [66]. Одновременно с этим начинается выработка противовоспалительных цитокинов (ИЛ-4 и ИЛ-10). Предполагается, что количество вырабатываемых в СО желудка и ДИК интерлейкинов может определять клинические особенности хронической //./?у/оп-ассоциированной гастродуоденальной патологии.
С развитием молекулярной генетики стало очевидным, что предрасположенность к мультифакториальным заболеваниям, эффективность и безопасность их лечения в значительной степени определяются специфичным набором полиморфных вариантов генов [49]. Предполагается, что особенности полиморфных локусов генов IL1B -511С/Т, а также 1Ы0 -1082G/A индивидов могут определять, как предрасположенность, так и клинические особенности хронической Я ту/огг-ассоциированной гастродуоденальной патологии [2]. Данные работы были проведены у взрослого населения, аналогичных исследований у детей найдено не было.
Анализ количества спонтанных про- (ИЛ-8, ИЛ-ір и ФНО-а) и противовоспалительного (ИЛ-10) интерлейкинов сыворотки крови у 41 ребенка с хронической /Z./jy/оп -ассоциированной гастродуоденальной патологией показал: уровень ИЛ-8 выше среднего значения был выявлен у 24 (58,5%) пациентов, ИЛ-1(3 - у 33 (80,5%), ФНО-а - у 34 (82,9%), а ИЛ-10 - у 11 больных (26,8%). За пределы нормального диапазона цифры ИЛ-8 вышли у 3 детей (7,3%), из них у одного пациента была выявлена ЯБ ДПК, а у двоих поверхностный гастродуоденит. Уровень ИЛ-1(3 выше нормального диапазона был определен у 16 больных (39% ), при ЭГДС у большинства из них (56,3%) был обнаружен поверхностный ХГД. Уровень ФНО-а превысил нормальный диапазон у двух пациентов с поверхностным ХГД. Показатели ИЛ-10 остались в нормальных пределах у всех обследованных детей. Достоверной разницы в количестве интерлейкинов у пациентов с ЯБ ДПК и ХГД выявлено не было (таблица 5.1).
При проведении корреляционного анализа было выявлено, что между отягощенным наследственным анамнезом по язвенной болезни и уровнями ИЛ-1р\ ФНО-а и ИЛ-10 в сыворотке крови пациентов с H.pylori-ассоциированной гастродуоденальной патологией существуют прямые достоверные положительные корреляционные связи средней силы. Это может свидетельствовать о возможном наследовании способности секретировать более высокие уровни интерлеикинов в ответ на инфицирование H.pylori (рисунок
Были обнаружены прямые ассоциации между длительностью и интенсивностью болевого абдоминального синдрома, оцененной по визуально-аналоговой шкале на момент поступления и уровнями интерлеикинов сыворотки крови. То есть чем больше количество интерлеикинов вырабатывается в ответ на инфицирование H.pylori, тем сильнее и длительнее абдоминальная боль (таблица 5.2). Таблица 5.2 - Взаимосвязь болевого синдрома и уровней интерлеикинов сыворотки крови у обследованных пациентов Характеристика болевого синдрома Цитокины Интенсивность ИЛ-8(г=0,47, р 0,01) ФНО-а (г=0,51,р 0,01) Длительность ИЛ-8 (г=0;35, р 0,05) ИЛ-1Р(г=0,34,р 0,05) ФНО-а (і=0,34, р 0,05) Достоверных взаимосвязей между характером и частотой болевого абдоминального синдрома и уровнями интерлеикинов сыворотки крови выявлено не было.
Кроме того, определены взаимосвязи между уровнями интерлеикинов в сыворотке крови и наличием симптомов диспепсии у обследованных пациентов. Обнаружены достоверные прямые ассоциации средней силы между уровнями ФНО-а и ИЛ-10 и отрыжкой, изжогой, тошнотой и рвотой (таблица 5.3).
В настоящее время доказано, что уровени продукции интерлейкинов напрямую зависят от наличия или отсутствия структурных особенностей в ДНК человека. К примеру, выявлен ряд высокопродуцирующих аллелей (вариантов) однонуклеотидных полиморфизмов гена IL1B, наследуемых чаще сцепленно (+3953, -3737, -1469, -999). У лиц, гомо- или гетерозиготных по высокопродуцирующему аллелю IL1B (+3953), выделяется, соответственно, в 4 и 2 раза больше количество этого цитокина, чем у лиц, гомозиготных по не мутантному варианту этого гена [20].
Носительство же мутантного аллеля полиморфизма -1082G/A гена IL10 связано, напротив, с меньшей экспрессией белка [150, 183]. Учитывая биологические эффекты ИЛ-10, заключающиеся в подавлении воспалительного ответа, протекающего по Th-І типу, меньшая продукция ИЛ-10, по-видимому, обусловливает более выраженное повреждающее действие, оказываемое клетками воспалительного инфильтрата на СО желудка [63].
Проведенный анализ спонтанных уровней ИЛ-ір и ИЛ-10 сыворотки крови в зависимости от полиморфизмов -511Т/С гена IL1B и -1082G/A гена IL10 статистически значимых различий не выявил (таблица 5.4). Таблица 5.4 - Уровни ИЛ-ір и ИЛ-10 сыворотки крови в зависимости от генотипа интерлеикинов у детей с хронической гастродуоденальной патологией (М±б) Интерлейкин - 1 р Интерлейкин - 10 полиморфизм -511С/Т гена IL1B уровень ИЛ-1 Р в сыворотке крови полиморфизм -1082G/A гена IL10 уровень ИЛ-10 в сыворотке крови нормальный генотип С/С 8,7±2 пг/мл нормальный генотип G/G 4,4± 1,7 пг/мл гетерозиготный генотип С/Т 9,5±2,1 пг/мл гетерозиготный генотип G/A 5,4±1,3 пг/мл мутантный генотип Т/Т 13,1±5,9 пг/мл мутантный генотип А/А Однако, видна тенденция, что при наличии в генотипе мутантного аллеля уровень интерлеикинов в сыворотке крови выше, чем у пациентов с нормальным генотипом (рисунок 5.2).
Электрофореграмма результатов определения полиморфизма -511 Т/С гена IL1B. Приведены размеры фрагментов ПЦР и молекулярного маркера (М). Генотипу Т/Т соответствовали нерестрицированные фрагменты длиной 305 пар оснований (п.о.) (лунки 6, 10), генотипу Т/С - три фрагмента длиной 305, 194 и 111 п.о. (лунки 1, 5, 7, 8, 11), а генотипу С/С - два фрагмента длиной 194 и 111 п.о. (лунки 2, 3, 4, 9). Кроме того, был проведен анализ полиморфных локусов генов IL1B и IL10 в зависимости от характера гастродуоденальной патологии и выявлено, что у пациентов с ЯБ ДПК и ХГД достоверно чаще встречался гетерозиготный мутантный генотип Т/С полиморфизма -511 Т/С гена IL1B, в отличие от детей группы контроля, у которых чаще выявлен нормальный гомозиготный генотип С/С. У всех детей, вошедших в исследование, мутантный гомозиготный генотип Т/Т обнаружен реже, чем нормальный генотип С/С. В группе больных ХГД значимо реже остальных встречался мутантный гомозиготный генотип Т/Т. У детей группы контроля чаще, чем у пациентов с ЯБ ДПК был выявлен нормальный гомозиготный генотип С/С (р 0,05) (таблица 5.5).
