Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 11
2.1. Общая характеристика токсичности производных 2,4 - дихлор-феноксиуксусной кислоты, хлорофоса и гексахлорциклогексана 13
2.2. Иммунологическая реактивность организма при воздействии пестицидов 26
3. Собственные исследования 49
3.1. Материал и методы исследования 49
3.2. Результаты исследования токсикологическая характеристика пестицидов 59
3.2.1. Параметры токсичности диметиламмониевой соли 2,4- дихлор- феноксиуксусной кислоты (2,4- ДДМА) 59
3.2.2. Клиническая картина и патоморфологические изменения при отравлении животных пестицидом 2,4- ДДМА 69
3.2.3. Морфологический состав крови животных при воздействии пестицида 2,4- ДДМА 79
3.2.4. Влияние 2,4- ДДМА на генеративную функцию овец 86
3.2.5. Параметры токсичности хлорофоса и гексахлорциклогексана 89
3.2.6. Заключение 89
3.3. Естественная резистентность животных при воздействии пестицидов 91
3.3.1. Клеточные и гуморальные факторы естественной резистентности при воздействии пестицидов 91
3.3.2. Влияние пестицидов на проницаемость стенки желудочно -кишечного тракта и поглотительную функцию системы моно-нуклеарных фагоцитов 103
3.3.3. Заключение 108
З А. Иммунологическая реактивность животных при воздействии пестицидов 114
3.4.1. Функциональная активность нейтрофилов при воздействии 2,4-ДДМА 116
3.4.2. Содержание Т- и В- лимфоцитов в крови животных при воздействии 2,4- ДДМА 119
3.4.3. Функциональная активность лимфоцитов крови
при воздействии 2,4- ДДМА 123
3.4.4. Действие 2,4 - ДДМА на структуру тимуса 125
3.4.5. Иммунный ответ у мышей на эритоциты барана в условиях воздействия пестицидов 130
3.4.6. Эффективность вакцинации крыс Salmonella enteriditis при воздействии пестицидов и зависимость его от биосинтеза белка и состояния мембраны лизосом 135
3.4.7. Иммунный статус животных при противопаразитарной обработке хлорофосом 142
3.4.8. Заключение 145
3.5. Лечение и профилактика иммунологической недостаточности, обусловленной пестицидами 15 0
3.5.1. Изучение лечебной эффективности димефосфона при иммунологической недостаточности 155
3.5.2. Изучение лечебно - профилактического действия димефосфона и левамизола при иммунологической недостаточности 164
3.5.3. Изучение профилактического действия димефосфона и гумата натрия при иммунологической недостаточности 173
3.5.4. Лечебная эффективность фармакологических средств
при отравлении овец пестицидом 2,4- ДДМА 181
3.5.5. Гигиеническое нормирование пестицида, как метод профилактики иммунологической недостаточности 186
3.5.6. Заключение 189
4. Обсуждение полученных результатов 192
5. Выводы 212
6. Практические предложения 215
7. Список литературы
- Иммунологическая реактивность организма при воздействии пестицидов
- Параметры токсичности диметиламмониевой соли 2,4- дихлор- феноксиуксусной кислоты (2,4- ДДМА)
- Естественная резистентность животных при воздействии пестицидов
- Иммунный статус животных при противопаразитарной обработке хлорофосом
Введение к работе
Актуальность темы. Одной из характерных особенностей современности является глобальный экологический кризис, возникновение и обострение которого вызвано интенсивным развитием хозяйственной деятельности человека. Среди разных форм проявлений этого кризиса, загрязнение окружающей среды в значительной степени вызвано широким применением большого разнообразия пестицидов, и в силу его неуклонного роста, гигант-ких масштабов и тяжелых последствий принимает характер угрожающий здоровью человека и животных (Шилов И.А.,1990; Яблоков А.В.,1987).
В целях предупреждения отрицательных влияний пестицидов, в разных странах разрабатываются предупредительные мероприятия, среди которых одним из главных является изучение токсического воздействия их на человека и животных (Полоз Д.Д.,1989).
Среди гербицидных препаратов по масштабам производства и применения первое место в мире занимают производные 2,4- дихлорфенокси-уксусной кислоты (2,4 - Д). Несмотря на длительное и достаточно широкое применение препаратов данной группы, у диметил аммониевой соли 2,4 - Д (2,4 - ДДМА) совершенно недостаточно изучены токсические свойства для животных и человека.
Негативное действие пестицидов на организм животных может проявляться в различных формах в зависимости от свойства препарата, интенсивности воздействия их на органы и системы в организме.
Особую актуальность в настоящее время приобретает изучение реакций иммунной системы на экстремальные экологические воздействия. Необходимость изучения состояния иммунной системы определяется прежде всего тем, что эта система является одним из центральных механизмов гомеостаза, и нарушение структурной целостности и функциональной полноценности ее может стать непосредственной предпосылкой для развития ряда других заболеваний, в частности острых и хронических инфекций, злокачественных
новообразований, аутоиммунных процессов и аллергии, а также может углубить тяжесть течения заболеваний, способствовать частым рецидивам, и ослаблять эффективность специфических методов лечения и профилактики.
Способность пестицидов вызывать изменения в иммунной системе сельскохозяйственных животных показана исследованиями Арестова И.Г. (1973), Евдокимова Э.С. (1975), Полоза Д.Д. (1978), Калмыковой Т.П. (1980), Кенигсберга ЯЗ. (1981), Шишкова В.П. (1984), Притулина П.И., Калмыковой Т.П., (1990), Жамсарановой С.Д. соавт., (1990), Лаврусенко Г.П., Жел-това В.Н., Пономарева В.Н. и соавт.,(1996), Логинова СИ., Смирнова П.И., Агарковой Т.Н. и соавт.(1997).
Разрозненность и фрагментарность данных о фактах иммунодепрессив-ного действия пестицидов, и отсутствие полных сведений о комплексном изучении интоксикационных и иммунобиологических процессов в гомеостати ческом и морфофункциональном аспекте в организме животных при воздействии пестицидов определили выбор темы и цель работы.
Цель работы. Целью настоящих исследований явилось изучение особенностей патогенетических механизмов интоксикационных процессов и иммунодефицитных состояний в организме животных, обусловленных пестицидами, и разработка методов лечения и профилактики этих патологических состояний.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
Определить параметры токсичности и изучить патогенез интоксикации животных пестицидом 2,4 - ДЦМА.
Изучить состояние естественной резистентности и иммунологической реактивности животных при действии пестицидов.
Изучить патогенетические механизмы развития иммунодефицитных состояний в организме животных при действии пестицидов.
4. Разработать методы лечения и профилактики патологических
состояний, обусловленных действием пестицида.
Научная новизна. В настоящей работе впервые проведена всесторонняя токсикологическая оценка пестицида 2,4- ДЦМА. Изучены патогенетические механизмы развития интоксикационных и иммунодепрессивных процессов при воздействии пестицидов. Разработан способ лечения и профилактики патологических состояний у животных при хроническом воздействии пестицида.
Определены параметры токсичности пестицидов. Изучены клинические и патоморфологические изменения при остром и хроническом отравлении животных пестицидом 2,4- ДДМА. Установлено тератогенное действие данного пестицида. Доказано, что в основе иммунотоксичности пестицидов и развития иммунологической недостаточности лежат нарушения метаболических процессов в клетках системы крови, структурно-функциональные изменения в центральных и периферических органах иммунной системы, нарушения проницаемости желудочно-кишечного тракта, недостаточность фагоцитарной активности нейтрофилов и клеток системы мононуклеарных фагоцитов из-за снижения в них активности оксидаз, изменения стабильности мембран и ингибиции кислых фосфотаз лизосом, торможение синтеза молекул литических факторов сыворотки крови, дефекты в клеточных и гуморальных звеньях иммунологической реактивности.
На основании литературных и собственных экспериментальных данных сформулирована концепция иммунологической недостаточности техногенной этиологии, объединяющая отдельные виды нарушений системы крови и иммунитета, развивающихся под действием разных пестицидов, в единую группу патологических состояний.
Дано научное обоснование методам лечения и профилактики иммунологической недостаточности, заключающиеся в применении иммуностимулирующих лекарственных средств и проведении гигиенических мероприятий.
Доказана высокая терапевтическая и профилактическая эффективность препаратов димефосфона, левамизола, гумата натрия и кокарбоксилазы при иммунотоксическом действии пестицида.
8 Доказана целесообразность включения иммунологических критериев в
комплекс оценок при установлении предельно допустимых уровней воздействия пестицидов.
Практическая ценность работы и внедрение результатов в практику. Результаты изучения токсикологической характеристики пестицида 2,4-ДЦМА расширяют представления о степени токсичности, о характере процесса интоксикации и локализации нарушений, о патогенезе токсического процесса, о тяжести и прогнозе отравления, и открывают возможности использования их ветеринарными врачами в практической деятельности, позволяют обратить внимание производственников на строгое соблюдение санитарных правил и технологической дисциплины при работе с данным веществом.
Разработана рекомендация по диагностике и профилактике отравлений животных пестицидом 2,4-ДДМА, которая включена в «Методические указания по диагностике, профилактике и лечению отравлений сельскохозяйственных животных гербицидами» и утверждены Главным Управлением Ветеринарии Госагропрома СССР.
Результаты исследования токсикологической характеристики 2,4-ДДМА включены: а) в «Методические разработки по вопросам санитарного контроля за применением ядохимикатов в сельском хозяйстве», одобренные Министерством здравоохранения и Министерством сельского хозяйства ТАССР, б) в учебное пособие «Ветеринарная токсикология / Г.А.Хмельницкий, В.Н.Локтионов, Д.Д.Полоз. — М.: Агропромиздат, 1987.-319с».
Концепция об иммунологической недостаточности, обусловленной пестицидами, и выявление основных механизмов, лежащих в ее основе, расширяют представление о патогенезе иммунодефицитного состояния, и дают возможность разработать пути профилактики и лечения.
Наставление по применению димефосфона в ветеринарии в качестве средства лечения и профилактики животных при отравлении пестицидами группы 2,4- Д, разработанные по результатам исследования лечебно ~ профилактической эффективности димефосфона, и подтвержденные результатами
9 комиссионного испытания димефосфона, по методике утвержденной Главком Ветеринарии, рассмотрено и разрешено Ветеринарным Фармакологическим Советом, и утверждено Главным Управлением Ветеринарии.
Разработан способ профилактики и лечения животных при отравлении диметиламмониевой солью 2,4- дихлорфеноксиуксусной кислоты, на который получено авторское свидетельство на изобретение (№ 1554] 86).
Лекарственный препарат димефосфон включен в учебник «Фармакология /В.Д.Соколов, М.И.Рабинович, Г.И.Горшков и др.; Под ред. В.Д.Соколова. — М.:Колос, 1997. — 543с». (Для студентов вузов, обучающихся по специальности «Ветеринария»).
Предложена научно обоснованная система мероприятий по профилактике иммунологической недостаточности, заключающаяся в ограничении воздействия на организм пестицида на основе предельно допустимого уровня воздействия, устанавливаемого с обязательным использованием показателей иммунологической реактивности.
Основные положения работы могут быть использованы в научной работе и в учебном процессе по курсу ветеринарная и экологическая токсикология, патологическая физиология и морфология, и ветеринарная фармакология.
Основные положения, выносимые на защиту.
Токсикологическая характеристика пестицида 2,4- ДДМА: основные параметры токсичности, клиническая картина, патоморфологические изменения и морфологический состав крови у животных при интоксикации.
Поступление пестицидов животным приводит к развитию иммунологической недостаточности, которая проявляется угнетением клеточных и гуморальных факторов естественной резистентности и иммунологической реактивности.
Нарушения пестицидами барьерной функции желудочно-кишечного тракта, метаболических процессов в иммунокомпетентных клетках, стабильности лизосомальных мембран и ингибиция активности оксидаз и кислых
10 фосфотаз в фагоцитах, патоморфологические изменения в центральных и
периферических иммунных органах, нарушение дифференцировки лимфоцитов, угнетение биосинтеза белка и пролиферативной активности лимфоцитов являются основными патогенетическими механизмами развития вторичной иммунологической недостаточности у животных.
Лекарственные средства, предназначенные для лечения недостаточности должны обладать широким спектром действия. Этим требованиям в значительной степени удовлетворяют лекарственные препараты димефос-фон, левамизол, гумат натрия и кокарбоксилаза.
Ведущую роль в профилактике иммунологической недостаточности играют гигиенические мероприятия, направленные на предотвращение воздействия пестицидов на организм. К числу этих мероприятий прежде всего относится установление научно обоснованных предельно допустимых уровней воздействия, обеспечивающих полную безопасность животных.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Пути развития народного хозяйства до последнего времени определялись целью получение максимального экономического эффекта на основе использования достижений научно - технического прогресса. Высокие темпы вовлечения в сферу хозяйственного освоения обширных территорий, интенсивное использование природных ресурсов и развитие отраслей народного хозяйства, активно воздействующих на природную среду, привели к возникновению и обострению глобального экологического кризиса, проявляющегося в различных формах, в том числе и в загрязнении окружающей среды (Шилов И.А., 1990).
Для того чтобы представить как велики масштабы антропогенного загрязнения окружающей среды, достаточно напомнить, что в результате сжигания всех видов топлива в атмосферу ежегодно поступает более 200 млрд т углекислого газа, более 70 млн т других летучих и твердых продуктов горения, в том числе более 150 млн т сернистого газа. Ежегодный прирост загрязнений указанного типа составляет около 5%. Другой вид загрязнений вызван расширением применения агрохимикатов. Ежегодно в почву вносится свыше 500 млн т минеральных удобрений и около 3 млн т пестицидов (Криволуц-кий Д.А., Федоров Е.А., и др., 1990). Считается, что ежегодно в окружающую среду попадает около 10000 т ртути и десятки тысяч тонн свинца (Измеров Н.Ф., 1974). В 1967 году количество чужеродных химических, загрязняющих биосферу, веществ оценивалось в 10 тысяч. К 1973 году их количество возросло до 2 миллионов и продолжало увеличиваться со скоростью 250 тысяч в год (Тиунов Л.А., 1978).
Среди факторов, загрязняющих окружающую среду, особую опасность для человека и животных представляют пестициды - единственный класс биологически высокоактивных химических веществ, сознательно вносимых человеком в биосферу, и являющийся неотъемлемым элементом современной сельскохозяйственной технологии.
12 Уже более 100 лет химические средства защиты растений играют
важную роль в борьбе с возбудителями болезней, насекомыми - вредителями и сорной растительностью. Необходимость такой борьбы достаточно очевидна, если учесть, что вызываемые ими потери урожая в мировом земледелии составляют от 23,9 до 46,4%. Потенциальные потери урожая в России достигают 71,3 млн т зерновых единиц (Соколов MX. и др., 1994). По оценкам ФАО (1989) каждый год от насекомых — вредителей, болезней растений и сорняков мировое сельское хозяйство несет убытки в 75 млрд долл. В связи с этим вполне закономерно ежегодный рост мирового производства пестицидов. Из общего количества производимых во всем мире пестицидов США и Канада использовали 33%, страны Западной Европы - 25, страны Юго - Восточной Азии - 22, страны Восточной Европы (включая Россию) - 10, страны Латинской Америки - 9, Австралия и Новая Зеландия — 1%. На 1 га посевов в Италии используют 21 кг, в Японии - около 16, в других странах Западной Европы - в среднем 2 — 3, в республиках бывшего СССР - от 0,6 (Эстония) до 13,2 (Молдавия), а во всем мире - в среднем 0,3 — 0,4 кг действующего вещества на 1 га (Соколов М.С. и др., 1994).
При применении инсектицидов и фунгицидов 97 - 99 процентов и гербицидов - 60% - 95% даже при строгом соблюдении всех регламентов их применения не достигают объектов подавления, а попадают в почву, воздух, водоемы (Яблоков А.В., 1987).
В отечественной и зарубежной литературе имеется обширная информация о содержании пестицидов в отдельных компонентах внешней среды. Миграция пестицидов в окружающей среде и по цепям питания приводит к накоплению остаточного количества препарата в большинстве природных объектов, в организме животных и человека. Данные национального мониторинга остатков пестицидов, например в США, подтверждают их наличие практически во всех контролируемых объектах (Лунев М.И., 1988). В настоящее время в науке имеются весомые доказательства загрязнения пестицидами различных объектов окружающей среды.
13 В этой связи защита окружающей среды является одной из актуальных
проблем современности. Успешное решение этой проблемы в значительной степени зависит как от совершенства технологии, так и от уровня наших знаний о влиянии загрязнении на экологические системы, и в первую очередь на здоровье человека и животных.
Перечень используемых в сельском хозяйстве пестицидов очень велик. Естественно, в рамках диссертационной работы невозможно привести накопленный к настоящему времени огромный материал о негативных влияниях пестицидов на живой организм. Поэтому в обзоре литературы приводятся и анализируются сведения о токсических свойствах и об иммунологической реактивности организма в условиях воздействия пестицидов, имеющих непосредственное отношение к разрабатываемой теме.
Иммунологическая реактивность организма при воздействии пестицидов
Важнейшим принципом нормального функционирования организма животных и человека является поддержание постоянства внутренней среды (гомеостаза), которое достигается деятельностью ряда систем, находящихся между собой в сложных регуляторных взаимоотношениях, к числу которых относятся система иммунитета и неспецифические факторы защиты (Горизонтов П. Д., 1976). Иммунитет, еще недавно понимавшийся только как способ защиты организма от инфекции, оказался одним из центральных механизмов поддержания постоянства внутренней среды организма. Интенсивные исследования показали, что иммунная система представляет собой сложную высокоорганизованную структуру, включающая центральные и периферические органы, иммунокомпетентные клетки разной степени специализации и огромное количество регуляторных молекул. Уже ни у кого не вызывает сомнения, что нормальное функционирование системы является одним из определяющих условий здоровья человека и животных.
Интерес к изучению иммунной системы постоянно возрастает, что связано со следующими обстоятельствами: а) значительные экономические потери в животноводстве вследствие заболеваний, обусловленных снижением или нарушением иммунного статуса животных (Шишков В.П., 1985); б) насущная потребность практики в средствах регуляции иммунитета; в) усиление воздействия на различные системы организма, в том числе и на систему иммунитета неблагоприятных внешних факторов, в связи интенсивным загрязнением окружающей среды.
Особую актуальность в настоящее время приобретает реакция иммунной системы на экстремальные экологические воздействия. Изучение иммунной системы как мишени для химических веществ, условий проявления их модифицирующего действия на иммуногенез быстро расширяются во всем мире. Сформировалось самостоятельное научное направление — иммуноток-сикология, которая изучает взаимодействие ксенобиотиков с иммунной системой (Greenlee W.F. et aL, 1985; Gibson G.G. et al., 1983; Berlin A. et al., 1987; Kallos P. Etal., 1987; Lawrence D.A., 1981; Zbinden L., 1987).
Необходимость изучения состояния этой системы диктуется прежде всего ее важностью для поддержания генетического постоянства организма и серьезностью риска возникновения патологических состояний инфекционной и неинфекционной природы при нарушениях функционирования системы иммунитета (Адамов А. К., Николаев Н.И., 1966; Косяков П. Н., 1979; Burnet F. М., 1971; Эрнст Л. К., 1985).
В настоящее время в системе ветеринарно — профилактических мероприятий важное значение имеет контроль общего иммунобиологического состояния и мероприятия по созданию устойчивых популяций животных. Данное положение определяется тем, что значительная часть желудочно-кишечных, респираторных и других заболеваний развивается в результате нарушения общей резистентности, иммунологической реактивности организма и проявления отрицательного воздействия условно — патогенной микрофлоры. Эти мероприятия предусматривают выявление всех иммуно-депрессоров и комплекса отрицательно влияющих факторов на иммунологическую реактивность, изучение патогенеза, разработку эффективных вакцин, а также изыскание средств стимуляции всей иммунной системы (Шишков В.П., 1985; Эрнст Л.К., 1985; Жаров А.В., 1995).
Притулин П.И., Калмыкова Т.П. и др., (1990), изучающие в течение многих лет влияние различных неблагоприятных факторов на организм животных, считают что экологическая обстановка на Земле стала катастрофической для существования всего живого. Особенно опасный удар наносят: радиация, токсические вещества, загрязняющие биосферу, а также использование пестицидов в сельском хозяйстве. Заболевания, обусловленные экологическими факторами, авторы рекомендуют именовать «экологической патологией животных». Главная особенность и характерная черта экологической патологии животных - угнетение неспецифических и специфических механизмов защиты организма, повреждения генетической наследственной информации, нарушения физических, химических и биологических обменных процессов. В результате этого возникают иммунодефицит, различные мутации, своеобразные инфекционные и эпизоотические процессы, генетическая трансформация возбудителей болезней и т.д.
Нарушение функции иммунитета сопровождается снижением резистен тности организма к инфекционным заболеваниям, повышением опасности возникновения злокачественных новообразований, аутоиммунной и аллерго-патологии. Среди различных видов иммунопатологии важное место занимают заболевания, возникающие на основе иммунодефицитных, аллергических и аутоиммунных состояний (Николаев А.И., 1977; Новиков Д.К., 1987; КарпутьИ.М. и др., 1992, 1993,1994).
Состояние отдельных механизмов системы иммунологического гомео-стаза изучались при действии различных вредных факторов как техногенных, так и естественных, например, природных и климатических, в первую очередь в зонах земного шара, имеющих экстремальные параметры климата - высокогорные, полярные, пустынные зоны. Накопленный к настоящему времени обширный материал подробно освещен в ряде обзоров и монографий (Стояновский А. Ф., Рассказова Т. В., 1966; Тиунов Л. А., Кустов В. В., 1974; Фрейдлин И. С, 1971; Фукс Б. Б., Константинова И. В., 1973; Шубик В.М., 1976; Миррахимов М. М. и др., 1985; Васильев Н.В., 1992; Новиков В. С, Смирнов В. С, І995; Чиркин В. В., Семенков В. Ф., Каранда-шов В. И., 1999; Смирнов В. С, Фрейдлин К. С, 2000). Анализ данного материала свидетельствует о том, что техногенные факторы вызывают значительные изменения различных показателей иммунологической реактивности.
Параметры токсичности диметиламмониевой соли 2,4- дихлор- феноксиуксусной кислоты (2,4- ДДМА)
У животных, получавших пестицид в течение 60 дней, в дозе 1 мг/кг был исследован тимус морфометрическим и гистологическим методами. Исследование тимуса сводилось к определению массы органа, площади функциональных зон — коркового и мозгового вещества, и в оценке их микроструктуры. Материал фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина, с последующей обработкой и заливкой в парафин по общепринятой методике. Гистологические срезы толщиной 4-6 мкм окрашивали гематоксилин - эозином, Морфометрические измерения проводили на микроскопе МБИ- 3 с использованием окуляр - микрометра по Автандилову ГГ., 1990).
Влияние пестицидов на специфическую иммунную реакцию изучали в трех экспериментах, с использованием в качестве антигена эритроциты барана и Salmonella enteriditis, при разных режимах воздействия пестицидов. Первый эксперимент выполнен по схеме однофакторного дисперсионного анализа, позволяющий одновременно оценить влияние различных доз изучаемого пестицида на титр антител. Мышей иммунизировали 10%-ной взвесью эритроцитов барана однократным внутрибрюшинным введением 0,2 мл. Пестициды в 1/100, 1/10, 1/5, 1/2 ЛД50 вводили мышам в желудок пятикратно 1 раз в сутки, начиная со дня иммунизации. На пятые сутки в сыворотке крови мышей определяли титр гемолизинов.
Для получения эритроцитов кровь брали из яремной вены баранов-доноров в раствор Альсевера (Топчий М.К., Корнюшенко Н.П., 1967). Эритроциты отмывали физиологическим раствором при центрифугировании. Использовали кровь, хранившуюся в растворе Альсевера при температуре +2 - 4 не более 2-3 суток. Реакцию гемолиза проводили по общепринятой методике.
Во втором эксперименте пестициды вводили мышам в 1/100, 1/20 ЛД;о ежедневно в течение 20 дней. На 16-й день мышей иммунизировали эри 54 троцитами барана и через 4 дня, в течение которых продолжали введение пестицидов, определяли титр антител в сыворотке, относительный вес селезенки и содержание общего белка в сыворотке крови.
В третьем эксперименте пестициды вводили крысам в желудок в 1/100, 1/50, 1/10 ЛДзо ежедневно 1 раз в сутки в течение 2 месяцев. После этого подопытным животным вводили антиген (Salmonella enteriditis) двукратно с интервалом 3 суток в дозе 0,2 и 0,5 мл. В сыворотке крови определяли титр антител в реакции пассивной гемагглютинации. В печени, селезенке и брюжеечных лимфатических узлах определяли интенсивность биосинтеза белка по включению С- глицина, а в цитоплазме печеночных клеток и внутри лизосом после разрушения их мембран тритоном Х-100 - активность маркерного лизосомального фермента кислой фосфотазы. Эти показатели определяли до иммунизации и после - на 4 и 11-е сутки.
Приготовление сальмонеллезной вакцины: суточную агаровую культуру сальмонелл смывали физиологическим раствором и доводили по оптическому стандарту до густоты 1 млрд микробных тел в I мл. Взвесь прогревали на водяной бане при 70 в течение 1 часа и после проверки на стерильность высевом на мясо - пептонный агар и мясо — пептонный бульон использовали в качестве вакцины.
Для определения интенсивности биосинтеза белка у крыс за 18 часов до убоя их внутривенно вводили 4С- глицин в дозе 50 мкКи на 100 г. массы тела. В эксперименте использован глицин-14С с удельной активностью 12,8 — 54 мКи/мМ и содержанием основного вещества 95 - 99%. Кусочки органов гомогенезировали в 5% растворе трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и гомогенат центрифугировали. Радиоактивность полученного кислотораство-римого материала в расчете на 1 мг белка характеризовала удельную радиоактивность кислоторастворимой фракции. Кислотонерастворимый материал отмывали 1 раз 5% ТХУ при 90 в течение 15 мин, 2 раза 5% ТХУ при комнатной температуре, 1 раз этанолом, насыщенным уксуснокислым натрием, 1 раз смесью этанол - эфир (2:1) при 60 в течение 10 мин, 1 раз эфиром. Осадок высушивали и растворяли в 0,5 н растворе едкого натра. В одной части пробы определяли белок по Лоури, в другой - радиоактивность на газопроточном счетчике «Протока» с геометрией счета 4л. Эффективность счета ,4С - 55%. Степень включения метки в белки, отражающую интенсивность биосинтеза белка, выражали в единицах относительной удельной активности (ОУА), получаемой делением величины удельной активности кислотонерастворимых белков на удельную активность кислоторастворимой фракции.
Выделение субклеточных структур печени. Кусочки печени тщательно отмывали в 0,25 М растворе сахарозы с рН 7,4, затем гомогенизировали в этой же среде в соотношении 1:10 (вес/объем). Полученный гомогенат подвергали дифференциальному центрифугированию в скоростном роторе центрифуги ЦЛР-1 (Покровский А.А., Арчаков А.И., 1968). Ядра и обломки клеток осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант центрифугировали 10 мин при 7500 об/мин для осаждения митохондриальной фракции. Лизосомальную фракцию выделяли центрифугированием полученного супернатанта при 16000 об/мин в течение 20 мин. Для разрушения мембран субклеточной структуры инкубировали в течение 30 мин на холоде с тритоном Х-100 в конечной концентрации 0,2-0,4%. После солюбилизации тритоном мембраны осаждали центрифугированием при 18000 об/мин в течение 20 мин. Всю работу по выделению субклеточных структур проводили в холодной камере при температуре 0-2.
Активность кислой фосфатазы определяли по гидролизу динатриевой соли р-нитрофенилфосфата в кислой среде. О проницаемости лизосомальных мембран для кислой фосфатазы судили по процентному отношению свободной (внелизосомальной) активности фермента к общей активности, определяемой после обработки лизосом тритоном Х-100.
Естественная резистентность животных при воздействии пестицидов
В системе противоинфекционной защиты организма важное место принадлежит механизмам естественной резистентности, которые обеспечивают устойчивость к заражению инфекционными агентами. Эффективное поддержание устойчивости специально не иммунизированного организма всецело зависит от состояния отдельных механизмов, совместная деятельность которых препятствует проникновению инфекционных агентов во внутреннюю среду организма и обезвреживает их внутри организма в случае прохождения через наружные барьеры.
Поэтому для изучения действия пестицидов на естественную резистентность предстояло исследовать состояние отдельных гуморальных и клеточных факторов с тем, чтобы попытаться оценить их роль в вероятном нарушении резистентности.
С этой целью в опытах на кроликах изучали бактерицидную активность сыворотки крови, уровень лизоцима и бета-лизинов в сыворотке, фагоцитарную активность лейкоцитов, в опытах на мышах оценивали барьерную функцию стенки желудочно-кишечного тракта и поглотительную функцию системы мононуклеарных фагоцитов.
В экспериментах были использованы три вида пестицида: хлорофос, ГХЦГ, 2,4 - ДДМА. Чтобы обеспечить одинаковые условия испытания пестицидов, введение животным осуществляли в эквивалентных по токсическому эффекту дозах (в равных частях ЛД50, сделав исключение только для ГХЦГ, который из-за выраженных кумулятивных свойств не может длительное время вводиться в дозе 1/10 ЛДэо.
.Клеточные и гуморальные факторы естественной резистентности при воздействии пестицидов Опыты проведены на 28 кроликах, разделенных на 7 равных групп. Пестициды вводили через рот 1 раз в сутки ежедневно на протяжении двух месяцев в следующих дозах: хлорофос -32 и 3,2 мг/кг, 2,4-ДДМА - 40 и 4 мг/кг, ГХЦГ - 9,4 и 4,7 мг/кг. Исследования проводили дважды до начала введения препаратов (фон), а затем 1 раз в 2 недели.
В течение опыта состояние и поведение животных не изменялось. При введении кроликам хлорофоса в дозе 32 мг/кг бактерицидная активность сыворотки крови (БАСК) в первые 2 недели затравки не отличалась от активности сыворотки крови животных контрольной группы. Через 4 недели БАСК резко снизилась и оставалась на низком уровне до конца опыта. При использовании хлорофоса в дозе 3,2 мг/кг падение БАСК началось уже через 2 недели (50% контрольного уровня). В последующие сроки сохранялись низкие значения БАСК, а через 8 недель после начала введения хлорофоса БАСК вообще не определялась (рис. 8).
Под действием 2,4-ДДМА в дозе 40 мг/кг БАСК снизилась через 4 недели до нулевых значений у всех подопытных кроликов. В дальнейшем наблюдалось некоторое восстановление активности, однако, и к концу опыта величина БАСК была в 11,2 раза ниже уровня контрольной группы. При введении 2,4-ДДМА в дозе 4 мг/кг максимальное падение БАСК наступало позже (через 8 недель) и было менее выраженным, чем при использовании 2,4-ДДМА в дозе 40 мг/кг (рис. 9).
У кроликов, получавших ГХЦГ в дозе 9,4 мг/кг, БАСК снижалась в 4 раза через 4 недели после начала затравки, а затем вообще не определялась. ГХЦГ в дозе 4,7 мг/кг вызывал более плавное снижение БАСК, однако как и у животных предыдущей группы, через 6 и 8 недель определить бактерицидную активность сывороток не удавалось (рис.Ю).
Под действием хлорофоса в дозе 32 мг/кг концентрация лизоцима в сыворотке крови кроликов начала снижаться через 4 недели, упав до нулевых значений через 8 недель. При введении хлорофоса в дозе 3,2 мг/кг концентрация лизоцима также снижалась через 4 недели, однако это снижение было значительно менее выраженным, чем в предыдущей группе. Через 6 и 8 недель сыворотки крови вообще не лизировали тест-объект (рис. 11).
В течение первого месяца затравки кроликов 2,4-ДЦМА в дозе 40 мг/кг существенных отличий концентрации лизоцима в сыворотках крови подопытных и контрольных животных не было. Через 6 недель концентрация лизоцима в сыворотке подопытных кроликов превышала контрольный уровень в 1,37 раза, а через 8 недель концентрация лизоцима упала в 6,5 раза, по сравнению с контролем. У кроликов, получавших 2,4-ДДМА в дозе 4 мг/кг, наблюдалось стойкое повышение концентрации лизоцима, которое лишь через 8 недель сменилось снижением в 1,5 раза (рис. 12)
При введении кроликам ГХЦГ четко заметен двухфазный характер изменения концентрации лизоцима в сыворотке крови. Длительность и выраженность пика первой фазы повышения концентрации лизоцима находилась в обратной зависимости от примененной дозы ГХЦГ. Вторая фаза снижения концентрации независимо от дозы препарат завершалась полным отсутствием лизоцима в сыворотке крови. Хотя регрессионный анализ и не выявил существенных различий между линиями регрессии опыта и контроля (рис. 13), в отдельно взятые сроки исследования различия между группами оказались достоверными (Р 0,05 - 0,001).
Изменения активности бета-лизинов в сыворотке крови кроликов были однотипными и заключались в падении активности через 2 недели после начала введения препаратов с последующим восстановлением к 4 неделе до контрольного уровня (рис. 14 и 15). Исключение составляла группа кроликов, получавших ГХЦГ в дозе 4,7 мг/кг, у которых активность бета-лизинов в сыворотке крови в течение опыта не отличалась от значений контрольной группы (рис.16).
Иммунный статус животных при противопаразитарной обработке хлорофосом
Выше было показано (см. 3.4.5.), что торможение пестицидами 2,4-ДДМА и хлорофосом иммунного ответа на эритроциты барана у мышей связано с угнетением биосинтеза белка в период, предшествующий иммунизации, и с ослаблением активации протеосинтеза при антигенной стимуляции. В данном разделе описываются результаты аналогичных экспериментов, отличающихся использованием вместо эритроцитов барана антигена Salmonella enteriditis и применением хлорофоса и 2,4-ДДМА. Кроме исследования биосинтеза белка проводили оценку состояния лизосомальных мембран. Необходимость этого изучения диктовалась, как важностью роли лизосом в иммуногенезе, так и стремлением в условиях строго контролируемого эксперимента, проведенного на одних и тех же животных, оценить вклад в обусловленную пестицидами иммунодепрессию двух механизмов: уже известного по вышеописанным опытам - угнетения биосинтеза белка и вероятного - нарушения стабильности лизосомальных мембран.
Опыты поставлены на 75 половозрелых крысах, разделенных на пять равных групп. Животные 1-й группы служили контролем, 2-й - получали хлорофос в дозе 1/10 ЛДзо, 3-й - хлорофос в дозе 1/50 ЛД50» 4-й - 2,4-ДДМА в дозе 1/10 ЛД50, 5-Й - 2,4-ДДМА в дозе 1/100 ЛД50. Пестициды вводили крысам в желудок ежедневно 1 раз в сутки в течение 2 месяцев. Антиген вводили внутримышечно по 0,2 и 0,5 мл с интервалом 3 суток. Перед иммунизацией, на 4 и 11-е сутки после первой инъекции антигена по 5 крыс из каждой группы убивали. В сыворотках крови определяли титр антител в реакции пассивной гемагглютинации, в печени, селезенке и брыжеечных лимфатических узлах - интенсивность биосинтеза белка по включению 14С-глицина, в цитоплазме печеночных клеток и внутри лизисом после разрушения их мембран тритоном Х-100 - активность маркерного лизосо мального фермента кислой фосфатазы.
У контрольных животных иммунизация привела к резкой активации включения метки в тканевые белки (табл. 26). На 4-е сутки после начала иммунизации ОУР белков печени возросла в 9,7 раза, селезенки — в 2,84 раза, лимфатических узлов - в 1,93 раза. На 11-е сутки ОУР белков печени превышала контрольный уровень в 2,73 раза, селезенки - в 1,59 раза. Титр антител составил 1:121 на 4-е сутки и 1:422 на 11-е сутки. Иммунизация не сопровождалась достоверным изменением стабильности лизосомальных мембран, а общая активность кислой фосфатазы увеличилась на 52% через 11 суток от начала введения антигена.
У группы крыс, получавших хлорофос в дозе 1/50 ЛДЬо, в предшествующий иммунизации период, было достоверно снижено включение метки в белки и проницаемость мембраны лизосом (табл. 27), а общая активность кислой фосфатазы увеличилась на 62%. Произведенная на этом фоне иммунизация привела к накоплению в сыворотке крови антител в низких титрах - 1:57 на 4-е сутки и 1:34 на 11-е сутки. На 4-е сутки ОУР белков печени была ниже, чем у контрольных иммунизированных крыс, в 10 раз, селезенки - в 1,7 раза, лимфатических узлов - в 3,9 раза. На 11-е сутки снижение, по сравнению с контролем, составило соответственно 2,14 — 3,38 — 3,28 раза. Проницаемость мембраны лизосом увеличилась на 4-е сутки на 65%, а затем нормализовалась. Увеличенная до иммунизации общая активность кислой фосфатазы снизилась на 4-е сутки в 2,28 раза и вновь возросла почти в 2 раза на 11-е сутки.
Введение крысам хлорофоса в дозе 1/10 ЛД5о привело к падению ОУР белков печени, селезенки и лимфатических узлов на 42 — 57%. Изменения проницаемости мембран лизосом и общей активности кислой фосфатазы были такими же, как и у животных, получавших меньшую дозу хлорофоса.
После иммунизации титры антител в сыворотке крови оказались равными 1:40 на 4-е сутки и 1:80 на 11-е сутки, что было значительно ниже контрольного уровня. Введение антигена стимулировало протеосинтез в печени и лимфатических узлах, однако степень стимуляции даже на 4-е сутки была настолько низкой, что показатели ОУР белков печени отличались от контроля в 5,8 раза, лимфатических узлов - в 1,43 раза. Показатели включения метки в белки селезенки на 4-е сутки и белки всех исследованных органов на 11-е сутки были даже достоверно ниже значений неиммуни-зированного контроля. Проницаемость мембраны лизосом после иммунизации увеличилась, а активность кислой фосфатазы снизилась на 21 - 24%.
Угнетение биосинтеза белка при введении 2,4-ДЦМА в дозе 1/100 ЛД5о было выражено, чем под действием хлорофоса. Проницаемость мембраны лизосом снизилась, по сравнению с контролем, на 32%, а общая активность кислой фосфатазы не изменилась. Произведенная на этом фоне иммунизация была мало эффективной - титры антител равны 1:30 на 4-е сутки и 1:24 на 11 -е сутки. На 4-е сутки после введения антигена наблюдалась достоверная активация биосинтеза белка, по сравнению с неиммувизированным контролем, но включение метки было намного ниже, чем у контрольных иммунизированных крыс. На 11-е сутки степень включения метки в белки печени и лимфатических узлов составляла только 71 - 80% от уровня, зарегистрированного у неиммунизированных животных. Проницаемость мембраны лизосом мало изменялась после иммунизации, но была постоянно ниже, чем в контроле. Общая активность кислой фосфатазы увеличилась на 25% через 4 суток и на 44% через 11 суток.
Введение крысам 2,4-ДДМА в дозе 1/10 ЛД50 привело к торможению биосинтеза белка, степень которого была сопоставима с наблюдавшейся у предыдущей группы животных. Проницаемость мембраны лизосом уменьшилась на 16%, по сравнению с контролем, а активность кислой фосфатазы достоверно не изменилась. На 4-е сутки после иммунизации включение метки в белки органов увеличилось, но было ниже значений иммунизи рованного контроля в 10,7 раза для печени, в 2,05 раза для селезенки и в 3,2 раза для лимфатических узлов. Проницаемость мембраны лизосом и общая активность кислой фосфатазы мало изменились, по сравнению с периодом до иммунизации. В сыворотке крови титр антител в этот срок исследования составил 1:20. На 11-е сутки ОУР белков достоверно не отличалась от значений, зарегистрированных у неиммунизированных контрольных животных. Проницаемость мембраны лизосом практически не изменилась и составляла 81% контрольного уровня, а активность кислой фосфатазы увеличилась до 133%. Среднегеометрический титр антител составил лишь 1:17 против 1:422 в контроле.
