Содержание к диссертации
Введение
I. Литературный обзор 8
1.1. Система эритрона 8
1.2. Методы измерения параметров эритроцитов (существующие экспериментальные решения) 13
1.2.1. Оптическая микроскопия 13
1.2.2. Турбидометрические измерения на ансамбле клеток 14
1.2.3. Спектрофотометрический метод 15
1.2.4. Проточная цитометрия 16
1.2.5. Метод двухуглового рассеивания 18
1.2.6. Кондуктометрический метод 19
1.3. Патогенез изменения системы эритрона при заболевании печени 20
1.4. Морфологические изменения эритроцитов и внутренних органов при заболеваниях печени 39
1.4.1. Морфология эритроцитов 39
1.4.2. Патологоанатомическая картина заболеваний печени . 48
II. Материалы и методы исследования 51
III. Результаты собственных исследований 60
3.1. Клинический осмотр животных 60
3.2. Результаты биохимического исследования крови 66
3.3. Результаты ультрасонографического исследования печени собак 71
3.4. Результаты ультрасонографического исследования печени кошек 75
3.5. Результаты гистологического исследования биоптатов печени собак 77
3.6. Результаты гистологического исследования биоптатов печени кошек 84
3.7. Результаты клинического анализа крови у собак 86
3.7.1. Острый токсический гепатит 86
3.7.2. Гепатоз 90
3.7.3. Цирроз печени 92
Атрофический и гипертрофический цирроз печени 93
Билиарный цирроз печени 95
3.7.4. Изменения некоторых параметров эритрона в зависимости от тяжести поражения печени 96
3.8. Результаты клинического анализа крови у кошек 97
3.8.1. Холангиогепатит 97
3.8.2. Липидоз 99
3.9. Морфология эритроцитов при патологиях печени у собак и кошек 102
IV. Обсуждение результатов 107
Выводы 113
Практические предложения 114
Список литературы 11
- Методы измерения параметров эритроцитов (существующие экспериментальные решения)
- Морфологические изменения эритроцитов и внутренних органов при заболеваниях печени
- Результаты ультрасонографического исследования печени собак
- Изменения некоторых параметров эритрона в зависимости от тяжести поражения печени
Введение к работе
По данным отечественных и зарубежных авторов, внутренние незаразные болезни составляют основную часть заболеваний собак и кошек - около 41 %, среди которых болезни печени составляют около 5 %. Наиболее часто встречаемыми патологиями печени у собак являются острый гепатит, хронический гепатит и множественные новообразования* печени, у кошек - острый гепатит, липидоз и метаплазия (Уша Б.В., Беляков И.М., 1998; Денисенко В.И., Кесарева Е.А., 2006).
Патология пищеварительной системы продолжает оставаться одной из наиболее актуальных проблем теоретической и практической ветеринарной медицины. Несмотря на большие успехи в. профилактике, диагностике, специализированном лечении, болезни печени остаются тяжелыми заболеваниями, нередко приводящими к падежу животных. Заболевания печени сопровождаются изменениями в различных органах и системах, среди которых особое место занимает система крови. Тесная взаимосвязь печени с процессом гемопоэза обусловливается ее ведущим значением в обмене важнейших гемопоэтических факторов: железа, витамина Ві2, фолиевой кислоты, эритропоэтина и других. Механизм возникновения гематологических нарушений при заболеваниях печени сложен и его изучение имеет существенное значение для целенаправленной патогенетической терапии больных с заболеваниями печени. Проведение подобных исследований по выяснению клинико-гематологических параллелей при- острых и хронических заболеваниях печени во многом способствует более углубленному пониманию патогенеза и послужит основанием для дифференциальной диагностики, профилактики и эффективного лечения.
Новый уровень методических приемов потребовал пересмотра и углубления наших знаний о сущности и динамике патологических
процессов в организме, ликвидации разрыва между так называемыми "функциональными" изменениями и морфологическими, "органическими повреждениями" ткани в процессе становления и развития болезни. Поэтому одной из основных задач теоретической ветеринарии* является изучение ранних морфофункциональных изменений в организме, отражающих начальные этапы- становления, патологического процесса; выяснение характера и динамики патологических изменений органов и тканей в течение болезни, выявление связей- между характером морфологических и функциональных изменений органов и показателей крови. С целью оценки и повышения эффективности тех или иных лечебно-профилактических мероприятий возникает необходимость морфологического контроля за биологическими процессами в организме животных (Жаров А.В., Жарова Ю.П., 2006). Несомненно, что детальное прижизненное- изучение морфогенеза должно служить- подспорьем в клинической практике при решении* вопросов диагноза и прогноза болезни.
Клетки крови, будучи важнейшими компонентами внутренней среды, организма, чутко реагируют на различные физиологические иг патологические процессы в организме* что позволяет использовать изменения крови в качестве дифференциально-диагностического теста при самых разнообразных нозологических формах. Применение в этих целях более тонких и чувствительных методов исследования позволяет дифференцированно подойти к изменениям в системе крови при заболеваниях печени. В свете вышеизложенного становится очевидной актуальность и своевременность.дальнейших комплексных исследований крови и кроветворения при патологиях печени в научных и практических целях.
Цель исследования выявить закономерности морфофункциональных изменений эритроцитов крови при различных патологиях печени мелких домашних животных.
Задачи исследования
Оценить морфофункциональное состояние эритроцитов крови и особенности его изменения у животных с различными заболеваниями печени.
Определить нозологический профиль болезней печени собак и кошек.
Провести анализ корреляционной зависимости между морфофункциональными показателями эритроцитов крови и патоморфологической картиной поражения печени у собак и кошек.
Научная новизна
Впервые детально показаны возможности использования морфометрии эритроцитов для оценки функционального состояния печени
Выявлены новые закономерности изменения эритроцитарной системы периферической крови у животных с заболеваниями печени в зависимости от стадии и степени поражения.
Практическое значение
Установлено, что при поражении печени в патологический процесс вовлекается и система крови, что существенно влияет на течение заболевания и должно учитываться при установке прогноза и назначении лечения.
Материалы исследования помогут более полно оценивать состояние животных с заболеваниями печени и могут служить методологической основой для применения системного анализа в лабораторной практике ветеринарных клиник.
Исследования общего клинического аназиза крови, наработка данных и умение их интерпретировать позволят быстро проводить первичное обследование большой группы животных, получать точные данные о составе и функциональной активности клеток крови, выявлять скрытые заболевания и начальные стадии заболеваний, при которых
клинические признаки еще не успели развиться, а также позволят прогнозировать развитие и исход многих болезней.
Материалы и результаты исследований используются в учебном процессе на кафедре незаразных болезней животных Московского государственного университета прикладной биотехнологии.
Основные положения, выносимые на защиту
Морфофункциональные изменения эритроцитов крови собак и кошек при различных гепатопатиях
Морфологические характеристики патологий печени собак и кошек
Биохимические изменения в организме собак и кошек при некоторых заболеваниях печени
Апробация работы
Материалы исследования доложены на конференциях:
Конференция молодых ученых и студентов "Живые системы и биологическая безопасность населения" (МГУПБ 2006, 2007, 2008 гг.)
XV Международный Московский ветеринарный конгресс (2007
г-)
3. VII Всероссийская выставка научно-технического творчества
молодежи (Москва, 2007 г.)
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 в изданиях, рекомендованных ВАК.
Методы измерения параметров эритроцитов (существующие экспериментальные решения)
Разработка методов поштучного анализа частиц ведется со времен создания светового микроскопа в 1674 г. Вплоть до середины 50-х годов световой микроскоп оставался единственно доступным средством в анализе одиночных клеток. Позже акцент сместился в сторону проточных цитометров.
Недавно сообщалось об экспериментальном прототипе прибора, работающего на принципе проточной цитометрии с рабочим названием: "imaging-combined flow cytoraeter" (IFC) (Kubota F., 2003). Описанная экспериментальная установка в дополнение к стандартной оптической схеме цитометра оснащена интенсифицированной ПЗС матрицей для анализа картины малоуглового рассеяния. Данная модификация позволяет оценивать объем эритроцитов, дискриминировать тромбоциты и эритроциты, агрегаты клеток.
Автоматизированный вариант микроскопа комбинированного с видеокамерой последние годы продвигается на рынок лидером в проточной цитометрии, компанией Beckton-Dickinson под названием "Scanning cytometer". Естественно ожидать, что подобные приборы, благодаря унификации компьютерных алгоритмов анализа изображений, вскоре придут на смену "визуальному" наблюдению пробы. Однако все инструментальные ограничения светового микроскопа при данном подходе остаются не преодоленными.
До 80-х годов экспериментальные решения сводились в основном к оптическим методам исследования на ансамбле клеток. Турбидометрически в области малоуглового рассеяния можно на качественном уровне зарегистрировать, например, морфологические изменения эритроцитов или разрушение части клеток в ходе лизиса. Как правило, предполагается, что уровень сигнала монотонно зависит от степени прохождения того или иного процесса. Измерения оптической плотности проводятся на длине волны, где поглощение гемоглобина мало (например, 700 нм), чтобы вклад в наблюдаемый сигнал вносило только светорассеяние.
При достаточно высокой статистической достоверности существуют возражения против измерения на ансамбле частиц по оптической плотности: необходимость калибровки "нуля" (например, соответствующего 100%-му лизису) и неоднозначность интерпретации промежуточных стадий.
Наиболее полный количественный анализ зависимости сигнала рассеяния от стадии осмотического гемолиза и углов сбора светового сигнала на установке подобной (Danon D.E., 1967) был недавно проведен Mazeron и др. (2000). При моделировании популяция эритроцитов рассматривалась как ансамбль сферических частиц. Стоит отметить, что авторы некорректно интерпретировали экспериментальные данные, полагая, что S-образная форма кривой лизиса обусловлена постепенным синхронным выходом гемоглобина из клеток. Несмотря на это, некоторые выводы, сделанные в данной работе, представляют интерес, так как согласуются с экспериментальными данными для широкого диапазона углов сбора светорассеяния: падение интенсивности сигнала соответствует только процессу гемолиза и не зависит от изменения формы клеток, а рост интенсивности соответствует гиперосмотическому сжатию.
Спектрофотометрически, по степени поглощения, измеряют концентрацию гемоглобина в надосадке, осаждая мембраны лизированных клеток. Для минимизации влияния степени оксигенирования гемоглобина выбирают длину волны излучения, соответствующую одной из изобестических точек (Mancini D.M., Ferraro N., Nazzaro, D., Chance B. and Wilson J.R., 1994) или стабилизируют гемоглобин, превращая его в циано-метгемоглобин.
В гематологических анализаторах, аналогичным образом, производя дополнительные измерения объема клеток, вычисляют так называемую "среднеклеточную концентрацию гемоглобина" (MGHC - mean cell hemoglobin concentration). Данным способом также можно зарегистрировать степень выхода гемоглобина или долю разрушенных клеток в ходе гемолиза.
Морфологические изменения эритроцитов и внутренних органов при заболеваниях печени
Изменения конфигурации эритроцитов могут иметь большое диагностическое значение и нести дополнительную информацию наряду с их количеством, цветовым показателем и концентрацией гемоглобина. В норме большая часть красных кровяных телец — это двояковогнутые диски. Они обладают высокой пластичностью и способностью быстро восстанавливать свою обычную форму после прохождения капилляров. Выполняя важные для организма функции (дыхательную, пластическую, транспортную, буферную), эти клетки должны одновременно обеспечивать и свой внутриклеточный, метаболизм, поддерживать функциональную пригодность, гемоглобина,- функции и сохранность элементов;в условиях постоянной угрозы аутоиммунного или осмотического лизиса: Противостоять такой угрозе клетка может благодаря активности цитолеммы, регулирующей обмен кислорода и углекислого газа, степень гидратации и электролитное равновесие,.связывание антител и антигенов. Вместе с тем эритроциты относительно дефектны, в связи с потерей функций, свойственных ядру и органеллам. Отсутствие ядер- снижает возможности клеточной регенерации, устойчивость к изменениям экстрацеллюлярной; среды и к воздействию ряда внешних физических факторов: Нарушения, энергетических, иммунологических,, осмотических, онкотических и реологических условий внутренней среды организма предъявляют повышенные требования;: к таким "функционально неполноценным" клеткам, а на субклеточном уровне - к их мембранному аппарату, нагрузки, на который первоначально сказываются на, форме клетки. В- медицинской литературе встречается следующая классификация-существующих форм, эритроцитов, выделяются 5 групп: дискоциты, стоматоциты, эхиноциты, пойкило- и шизоциты,. гемолизирующиеся формы. В указанные 5 групп включено более 40 известных форм эритроцитов,- основные морфологические признаки которых представлены в табл. 1. По аналогии с лейкограммой распределение эритроцитов по указанным группам обозначаем термином "квантитативная (количественная) эритрограмма" и выражаем его в процентах от общего количества клеток, а в случаях, заметного изменения числа эритроцитов-в крови1 — в абсолютных цифрах. Внутри групп степень выраженности трансформации клеток неодинакова. Нарастание этого признака соответствует распределению клеток по подгруппам, обозначенным римскими цифрами I - IV. (Кидалов В.Н., Лысак В.Ф:, 1989):
Полихроматофилы или ретикулоциты. Определение количества ретикулоцитов в крови — самый последовательный способ оценки силы эритропоэза, но при интерпретации необходимо учитывать время начала анемии и величину ретикулоцитоза. Подсчет ретикулоцитов должен следовать за первым; общим анализом крови, если гематакрит меньше 30: % у собак и 20 % у кошек. Он показывает силу эритроидной.регенерации, после этого уже нет необходимости; проводить биопсию и пункцию костного мозга; Ретикулоциты; являются; незрелыми эритроцитами, выделяемыми» BV увеличенных количествах здоровым костным мозгом; в ответ на анемию:. ДІІЯІ продолжения синтеза:; гемоглобина; они; имеют рибосомы;(РНК), которые принимают вид- синих гранул при; окрашивании; новым: метиленовым синим: Ретикулоциты, кошек- подразделяют на агрегатные и пунктатные формы. Их регистрируют таким, образом: абсолютное: количество ретикулоцитові на микролитр крови;: ретикулоцитный индекс; (RI); процентная: доля ретикулоцитов; скорректированная процентная доля; ретикулоцитов, а также оценка, полихромазии; иш мазках, кровт Еслш ретикулоциты имеют больший размер , то: их называют макроцитамт Макроцитоз и макроцитная гипохромная-1 анемия, являются! косвенным- отражением;ретикулоцитоза и реактивности; костного мозга (Тведтен. F., Вейсс Д1, 2003). Ретикулоциты собак в норме созревают до: эритроцитов примерно за\ один- день после выделения; в кровь. В?- процессе; созревания; поскольку оно: приходит быстро;, ретикулоциты; представлены; преимущественно? агрегатными; формами (т.е: содержат большую массу преципитированных эритроцитов с. малым, количеством пунктатных форм): Ретикулоциты, собак не подразделяют на типы, несмотря- на. то, что некоторые специалисты эритроциты; с; одной или; двумя выделяемыми гранулами: не; относят к ретикулоцитам; Небольшое количество, пунктатных ретикулоцитов у собаки не имеет клинической значимости, учитывая; большую погрешность, в микроскопических подсчетах. Ретикулоциты у собак, приблизительно равны полихроматофилам вмазках крови, окрашенных по Райту.
Результаты ультрасонографического исследования печени собак
Для определения характера поражения печени мы проводили ультразвуковую диагностику. Каждое заболевание имело характерные черты.
Острый токсический гепатит характеризовался увеличением размера печени, контуры ровные, капсула утолщена и четко визуализируется, эхогенность паренхимы снижена, сосудистый рисунок четко выражен, однородность структуры сохранена, иногда встречались признаки острого холецистита (расширение желчного пузыря) и холестаза (расширение желчных протоков) (рис. 4).
Цирроз характеризовался следующими ультрасонографическими признаками:
Макронодулярный цирроз: увеличение размеров печени, неровные контуры, в паренхиме имеется большое количество эхогенных образований, структура неоднородная, грубозернистая, сосудистый рисунок обеднен.
Микронодулярный цирроз: уменьшение размеров, неровные контуры, капсула визуализируется нечетко, значительное повышение эхогенности и ослабление сосудистого рисунка, спленомегалия, асцит (на начальных стадиях свободную жидкость отмечают между долями печени, под куполом диафрагмы, иногда в тазовой полости, позднее она заполняет всю брюшную полость).
Сонографически определяемые стадии: начальная, сформированная, терминальная (Иванов В.В., 2007). Начальная стадия характеризовалась увеличением размеровшечени, ровным контуром, повышением; эхогенности, диафрагмальные доли визуализируются хуже, воротная; вена- расширена, селезеночная вена и печеночная артерия расширены.
Сформированная? стадия характеризовалась= множественными, уплотненными? участками диффузным5 повышением- эхогенности; селезенка диффузно уплотнена..
Терминальная стадия? — уменьшение размеров; неровный; контур, повышение эхогенности; расширение мелких: сосудов; расширение желчных:протоков;,селезенка увеличена1, уплотнена.
Вї паренхиме печени; определялась чаще всего5 повышенная; эхогенность крупных участков;. чередующаяся- с участками неравномерной пониженной эхогенности; На этом фоне; как правило, выделялись многочисленные: срезы сосудов , высокой эхогенности; что! обусловлено склерозомшхстенок, а также наличиемфасширенных; вен; причем,иногдах. явлениями: их выраженной деформации . Особым! приемом? визуализации уплотненных стенок сосудов, являлась картина- снижения ко нтрастности изображения, когда? на экране дисплея? исчезают менее эхогенные структуры- и сохраняются только; плотные образования: При циррозах имело место значительное снижение функциональной активности по краям органа вследствие разрастания соединительной; ткани, что находит выражение в; визуализации широкой? полосы высокой; эхогенности. Важным сонографическим; признаком: цирроза; печени? (хотя и не во:всех случаях), являлись спленомегалия? и визуализация расширенных: селезеночных вен; В" 10 % случаев выраженного: увеличения селезенки не регистрировали.
Изменения некоторых параметров эритрона в зависимости от тяжести поражения печени
При определении морфофункциональных показателей эритроцитов у собак с хроническим течением гепатоза нами было установлено, что изменения эритроцитов при разных формах гепатоза существенно не отличаются.
В отличие от острого гепатита, при гепатозе с хроническим течением у собак развивается макроцитарная нормохромная гомогенная анемия. Количество эритроцитов и гемоглобина у большинства животных было незначительно снижено и составляло 5,4+0,9 Ю12/л и 13,2+2,4 г/дл соответственно. Повышение среднего объема эритроцитов (MCV) 76,5+3,9 фл указывает на макроцитарный тип анемии. Показатель среднего содержания гемоглобина в эритроцитах (МСН), как правило, был в пределах нормы или незначительно повышен и составлял в среднем 28,0+5,1 пг. Повышение показателя МСН происходит в связи с увеличением объема эритроцита и самостоятельного значения не имеет, а учитывается только совместно с MCV. Индекс анизоцитоза эритоцитов (RDW) значительно отличался у каждого животного и соответствовал степени поражения печени и уровню компенсации патологического процесса. У собак с хроническим гепатозом в стадии декомпенсации RDW соответствовал норме или был незначительно снижен, что указывало на апластический характер развившейся анемии. У таких животных прогноз течения заболевания неблагоприятный в виду истощения системы эритрона и развивающейся на этом фоне хронической гипоксии. У собак с более благоприятным течением заболевания показатель RDW увеличен, вследствие наличия в крови большого количества молодых незрелых эритроцитов, в то время как количество зрелых эритроцитов снижено, в итоге происходит расширение гистограммы распределения эритроцитов. Объяснить это явление можно тем, что при хроническом поражении печени эритроциты становятся менее устойчивыми и быстро гемолизируются. Чтобы поддержать нормальное количество эритроцитов активируется гемопоэз, и в крови появляется большое количество незрелых эритроцитов-ретикулоцитов, имеющих больший по сравнения со зрелым эритроцитом объем. Так как при хроническом поражении печени часто страдает ее синтетическая функция, то эритропоэз в скором времени становится неэффективным, т.е. в кровь попадают эритроциты, которые не могут полноценно функционировать, быстро разрушаются, что в конечном итоге ведет к истощению эритропоэтической функции спинного мозга и к развитию апластической анемии (рис. 18).
Количество лейкоцитов в крови при гепатозе у собак в среднем колебалось в пределах нормы и составило 8,7±1,6х10 7л, что указывает на отсутствие острого воспаления в организме.
Лейкограмма была, как правило, с незначительной нейтрофилией, при этом в некоторых случаях обнаруживалось увеличение процента сегментоядерных клеток при нормальном или пониженном количестве палочкоядерных лейкоцитов, что указывало на арегенераторныи сдвиг вправо. Это подтверждало хроническое течение болезни. Во время исследования было выявлено 13 собак с циррозом печени.
Изменения эритроцитарной системы при циррозе печени были многообразны и неоднородны и зависели не только от степени активности процесса, но и от формы цирроза. В связи с этим средние показатели параметров эритропоэза для всех наблюдаемых собак, больных циррозом, в ряде случаев были не информативны и не отражали истинного состояния той или иной стороны эритропоэза. Поэтому мы предлагаем описание морфофункциональных показателей печени по видам обнаруженного цирроза.
Атрофический и гипертрофический цирроз печени
Анемия в этой группе выявлена у всех больных. Уровень гемоглобина колеблется от 11,2 до 14,5 г/дл, в среднем составляя 12,9+1,6 г/дл. Количество эритроцитов было также снижено (4,2+0,5) 1012/л. Как видно, анемия носила нормохромный характер. Средний объем эритроцитов (MCV) колебался от 67,5 фл при выраженной спленомегалии до 88,7 фл при декомпенсированном циррозе печени. Среднее содержание гемоглобина в эритроците(МСН) было понижено — 26,6+1,1 пг. Индекс анизоцитоза эритроцитов (RDW) был увеличен и составлял в среднем 9,4+0,3 %. Причиной увеличения неоднородности популяции эритроцитов скорее всего является уменьшение продолжительности жизни эритроцитов и появление в крови клеток неэффективного эритропоэза (рис. 19).
Таким образом, у больных гипертрофическим и атрофическим циррозом печени выявлены значительные изменения эритропоэза. Наблюдается угнетение общего эритропоэза (уменьшение количества эритроцитов и уровня гемоглобина в периферической крови). Высокий уровень неэффективного эритропоэза.
