Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 9
1. Таксономическое положение и систематика 9
2. История применения L. edodes 10
3. Морфологические признаки мицелия и базидиом L. edodes 11
4. Ареал и биология 13
5. Методы и условия культивирования 13
5.1 Выделение и хранение культуры 13
5.2 Выращивание на плотных средах 15
5.3 Погруженное культивирование 16
5.4 Получение плодовых тел 19
6. Питательная ценность, химический состав L. edodes и химическая природа его биологически активных компонентов 21
7. Биологическая активность L. edodes 24
7.1 Антибактериальное и антифунгальное действие 27
7.2 Противоопухолевое и иммуномодулирующее действие 32
7.3 Противовирусное действие 40
7.4 Гиполипидемическое действие 42
7.5 Гипогликемическое действие 45
7.6 Действие на сердечно-сосудистую систему 45
7.7 Гепатопротекторнос действие 45
7.8 Противовоспалительное действие 46
7.9 Другие биологические свойства L. edodes 46
8. Токсичность 47
9. Формы препаратов и дозировки 47
Глава II. Материалы и методы 50
1. Объекты исследования 50
2. Хранение культур L. edodes 50
3. Культивирование на плотных средах 50
4. Изучение морфолого-физиологических признаков штаммов L. edodes 51
5. Погруженное культивирование L. edodes 51
6. Оптимизация состава среды для погруженного культивирования L. edodes 53
7. Получение плодовых тел 54
8. Морфометрия плодовых тел L. edodes 54
9. Изучение антибиотического действия штаммов L. edodes 54
10. Разделение экстрактов и идентификация антибиотических соединений 56
11. Определение гиполипидемической активности 56
12. Получение водных экстрактов и их фракций из мицелия L. edodes 57
13. Определение содержания полисахаридов в водных экстрактах мицелия и плодовых тел штаммов L. edodes 58
14. Определение моносахаридного состава полисахаридных фракций 59
15. Изучение противоопухолевого действия L. edodes 60
Глава III. Результаты и обсуждение 61
1. Морфолого-физиологическое изучение штаммов L. edodes 61
1.1 Макроморфология штаммов L. edodes на плотных средах 61
1.2 Микроморфология мицелия штаммов L. edodes 66
1.3 Получение плодовых тел штаммов L. edodes и их макроморфология 69
2. Отбор штаммов L. edodes с высоким выходом погруженной биомассы, антибиотической и противоопухолевой активностью 72
2.1 Схема отбора штаммов L. edodes с высоким выходом погруженной биомассы и антибиотической активностью 72
2.2 Изучение антибиотической активности штаммов L. edodes 73
2.3 Выделение и идентификация биологически активных веществ штаммов L. edodes 80
2.4 Накопление погруженной биомассы и содержание водорастворимых полисахаридов в мицелии и плодовых телах штаммов L. edodes, противоопухолевые свойства водных экстрактов мицелия 84
2.4.1 Изучение характера накопления и выхода погруженной биомассы L. edodes 85
2.4.2 Содержание водорастворимых полисахаридов в мицелии и плодовых телах штаммов L. edodes 89
2.4.3 Противоопухолевые свойства погруженного мицелия штамма 15 L. edodes 91
2.5 Разаработка метода погруженного культивирования L. edodes 94
2.5.1 Зависимость накопления биомассы L. edodes от интенсивности аэрации 95
2.5.2 Зависимость накопления биомассы L. edodes от качества и количества посевного материала 95
2.5.3 Разработка состава жидкой питательной среды для культивирования штамма 15 L. edodes и изучение зависимости накопления биомассы от состава ферментационных сред 97
2.5.3.1 Качественный отбор источников питания 98
2.5.3.2 Оптимизация количественного состава жидкой питательной среды методами математического планирования эксперимента 99
2.5.4 Изучение длительности процесса погруженного культивирования 105
Заключение 107
Выводы 110
Список литературы 112
Приложение 1 129
Приложение 2 137
- Питательная ценность, химический состав L. edodes и химическая природа его биологически активных компонентов
- Оптимизация состава среды для погруженного культивирования L. edodes
- Выделение и идентификация биологически активных веществ штаммов L. edodes
- Оптимизация количественного состава жидкой питательной среды методами математического планирования эксперимента
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время ведутся активные поиски биологически активных соединений базидиомицетов. Lentinus edodes (Berk.) Sing. [син. Lentinula edodes (Berk.) Pegler] - пилолистник съедобный, сиитаке или шиитаке, один из наиболее известных съедобных базидиальных грибов, используемый в лечебных целях с давнего времени. Интенсивные исследования последних десятилетий привели к выявлению биологически активных метаболитов L. edodes, обладающих иммуномодулирующими, противоопухолевыми, гиполипидемическими, гипогликемическими, противовирусными и др. свойствами (Chihara et al, 1969; Chibata et al, 1969; Kamiya et al, 1969; Chihara, 1970; Kaneko et al, 1989; Breene, 1990; Jong, Birmingham, 1993; Komemushi et al, 1995; Wasser et al, 1997; Hatvani, 2001; Ishikawa et al, 2001; Rowan et al, 2003; Hassegawa et al, 2005; Lo et al, 2007; Wu, Hansen, 2008). Изучению антибиотической активности L. edodes посвящено значительно меньше работ. В то же время известно, что по сравнению с другими видами базидиомицетов L. edodes проявляет более выраженные антибиотические свойства (Краснопольская и др., 1997).
Погруженное культивирование, по сравнению с другими методами выращивания базидиомицетов, представляет собой наиболее целесообразный способ получения их биологически активных метаболитов. Современные способы культивирования базидиомицетов, разработанные для конкретных штаммов, предусматривают проведение процессов выращивания в строго контролируемых стерильных условиях, обеспечивающих стабильность химического состава получаемой продукции и воспроизводимость биологических эффектов. На сегодня существует значительный разрыв между исследованием биологической активности и изучением штаммового разнообразия L. edodes. Наличие у L. edodes широкого спектра биологической активности позволяет предположить существование штаммов, являющихся активными продуцентами не одного, а двух или более хозяйственно ценных метаболитов, различающихся направленностью и механизмом своего действия и накапливающих целевые соединения, как в биомассе, так и в культуральной жидкости. Выявление таких штаммов и использование их в биотехнологии приведет к повышению эффективности и конкурентоспособности способов получения биологически активных метаболитов. Скрининг штаммов L. edodes с широким спектром биологической активности и высокой продуктивностью является составной частью исследования штаммового разнообразия
этого вида, в которое также должно входить изучение морфологических, физиологических и морфометрических особенностей штаммов L. edodes.
Цель и задачи исследования. Цель исследования состояла в комплексном изучении штаммового разнообразия L. edodes на вегетативной и генеративной стадиях, в проведении отбора штаммов L. edodes, сочетающих высокую антибиотическую активность с противоопухолевыми свойствами, и разработку способа погруженного культивирования наиболее перспективного штамма.
В работе были поставлены следующие задачи:
Изучение морфолого-физиологических характеристик штаммов L. edodes при росте на плотных питательных средах.
Изучение микроморфологических признаков штаммов L. edodes при росте на плотных питательных средах и при погруженном культивировании.
Получение и морфометрическое изучение плодовых тел штаммов L. edodes.
Изучение антибиотического действия штаммов L. edodes, выделение и идентификация действующих веществ.
Изучение процессов погруженного культивирования штаммов L. edodes, накопления биомассы и содержания эндополисахаридов.
Отбор штаммов, сочетающих высокую антибиотическую активность с интенсивным накоплением биомассы и эндополисахаридов в условиях погруженной культуры.
Выявление противоопухолевого действия отобранного штамма L. edodes в опытах in vivo.
Разработка способа погруженного культивирования отобранного штамма L. edodes, включая оптимизацию состава ферментационной среды методами математического планирования.
Научная новизна. В результате проведенного исследования описаны морфолого-физиологические характеристики 15 штаммов L. edodes. Составлены морфологические описания колоний изученных штаммов при росте на четырех плотных питательных средах различного состава. Предложен новый метод определения интенсивности развития мицелия L. edodes, основанный на определении отношения массы сухого мицелия к единице площади колонии. Разработан новый экспресс-метод для сравнительной оценки длительности процессов погруженного культивирования штаммов L. edodes.
Изученные штаммы были разделены на две группы по форме шляпки: одни -образовывали базидиомы с конусообразной формой шляпки, другие - с распростертой.
Показано, что антибиотические свойства L. edodes более ярко выражены на вегетативной стадии развития, чем на генеративной. Штаммы различаются по спектру антибиотического действия и степени активности. В качестве основного компонента антибиотического комплекса L. edodes идентифицирован лентинамицин В. Впервые показана антибиотическая активность в отношении грибов-дерматофитов. Выявлены штаммы, способные к образованию эритаденина.
Выявлены штаммы, обеспечивающие высокий выход эндополисахаридов в условиях погруженной культуры. Показано противоопухолевое действие порошка воздушно-сухой биомассы, водного экстракта мицелия и суммарной фракции водорастворимых полисахаридов мицелия штамма 15 L. edodes при пероральном введении. Сочетание экстракта мицелия L. edodes и пиклофосфамида в низкой терапевтической дозе 50 мг/кг, угнетающей супрессоры, резко усиливало противоопухолевый эффект.
Отобран штамм L. edodes, сочетающий высокую антибиотическую активность с противоопухолевыми свойствами. При этом антибиотически активные метаболиты накапливаются преимущественно в культуральной жидкости, а противоопухолевые полисахариды входят в состав клеточной стенки погруженного мицелия.
Показано штаммовое разнообразие L. edodes и предложена система скрининга штаммов L. edodes, обладающих высоким выходом биомассы и выраженными антибиотическими и противоопухолевыми свойствами.
Обнаружен штамм L. edodes, способный накапливать до 42 % липидов в погруженном мицелии.
Практическая значимость. На основании результатов изучения штаммового разнообразия L. edodes разработана «Методика проведения испытаний на отличимость, однородность и стабильность (ООС) Шиитаке (пилолистник съедобный) (Lenfinus edodes (Berk.) Sing.)» RTG/1078/1 № 12-06/21, утвержденная ФГУ «Государственной комиссией Российской Федерации по испытанию и охране селекционных достижений» 21.09.2009 г. Для проведения исследований штаммового разнообразия на вегетативной стадии развития L. edodes рекомендована среда Чапека-Докса с добавлением дрожжевого экстракта (Serva), обеспечивающая проявление специфических морфологических черт отдельных штаммов L. edodes.
Выявлены штаммы L. edodes с высокой антибиотической активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, дрожжей, мицелиальных грибов, в том числе грибов-дерматофитов. Антибиотик лентинамипин В получен в хроматографически чистом виде.
Отобраны штаммы, сочетающие выраженное антибиотическое действие и высокий выход эндополисахаридов, из числа которых штамм 15 оказался одним из наиболее перспективных.
Разработан биотехнологический метод погруженного культивирования отобранного штамма 15, обеспечивающий двукратное увеличение выхода биомассы (до 18-20 г/л) по сравнению с исходным уровнем на 6 сутки. Метод апробирован в условиях биореактора геометрическим объемом 0,5 м .
В результате опытов получены экспериментальные образцы суммарной фракции водорастворимых полисахаридов погруженного мицелия штамма 15 L. edodes, проявившие противоопухолевую активность в экспериментах in vivo в отношении Т-лимфомы EL-4 и лимфомы Р388.
Получен патент РФ № 5091 на штамм Lentinus edodes (Berk.) Sing. Шиитаке 15 и подана заявка на патент РФ на способ получения средства, обладающего противоопухолевой активностью, регистрационный № 2009148354.
Апробация работы. Результаты исследования были доложены на конференции молодых ученых ГУ НИИНА им. Г.Ф. Гаузе РАМН (Москва, 2004), на 7-й школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003), на втором Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2004). Материалы работы были представлены на первом, втором, третьем, четвертом и пятом Всероссийских конгрессах по медицинской микологии (Москва, 2003, 2004, 2005, 2006, 2007), на первой и второй Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Суздаль, 2005; Рязань, 2007).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 137 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной материалам и методам исследования, главы «Результаты и обсуждение», заключения, выводов, списка литературы, включающего 232 источника, из них 188 - зарубежных, двух приложений. Работа содержит 32 рисунка и 27 таблиц.
Питательная ценность, химический состав L. edodes и химическая природа его биологически активных компонентов
L. edod.es — ксилосапротроф, растущий на мертвой древесине широколиственных пород деревьев, преимущественно семейства дубовых. Для шиитаке разработаны биотехнологии выращивания посевного мицелия и плодовых тел, получено большое количество производственных штаммов. Успех выращивания шиитаке во многом зависит от соответствия выбранного штамма конкретным условиям производства (Фомина и др., 1998), а также от самих условий и их стабильности.
В качестве посевного материала шиитаке используют различные типы мицелия: выращенный на деревянных цилиндрах, на опилках, на зерне или в погруженной культуре. Посевной мицелий шиитаке на деревянных цилиндрах и опилках преимущественно используют при экстенсивном способе получения плодовых тел гриба, а зерновой и жидкий мицелий - при интенсивном (Краснопольская, Белицкий, 2002).
Экстенсивный способ приближен к естественному образу жизни гриба и заключается в использовании в качестве субстрата стволов деревьев или их отрубков. Для выращивания шиитаке берут свежеспиленные стволы и сучья лиственных пород деревьев, желательно с твердой древесиной (дуб, бук, граб, береза, тополь). По всей длине очищенного ото мхов, лишайников и грязи и подсушенного ствола просверливают отверстия для инокуляции (Краснопольская, Белицкий, 2002).
Материал для инокуляции готовят в лабораторных стерильных условиях, заращивая вегетативным мицелием деревянные цилиндры или древесные опилки. Инокуляцию осуществляют, забивая в отверстия зарощенные мицелием деревянные цилиндры или помещая в них опилочный мицелий с помощью специального приспособления. После чего места инокуляции заливают расплавленным парафином (Адриеш и др., 2002).
Инкубацию инокулированной древесины проводят так, чтобы обеспечить оптимальную температуру (22-25 С) и влажность древесины (35-55 %). На освоение субстрата мицелием гриба уходит от 6 до 24 месяцев. Переход к генеративной стадии стимулируют временным снижением температуры и замачиванием древесины. Отдача урожая идет волнообразно в течение 3-6 лет. Период покоя между волнами плодоношения составляет 3-5 недель. Биологическая эффективность - процентное отношение суммарной сырой массы грибов, полученных за весь период культивирования, к сухой начальной массе субстрата, при экстенсивном выращивании шиитаке составляет 30-35 %. Относительно низкая биологическая эффективность данного способа выращивания шиитаке компенсируется высокими вкусовыми и потребительскими качествами получаемых грибов (Краснопольская, Белицкий, 2002).
Значительно более высоких урожаев можно добиться, используя интенсивный способ выращивания шиитаке. Технологический процесс начинается с подготовки лигноцеллюлозного субстрата. Основу субстрата составляют опилки твердых лиственных пород (дуб, бук, клен, береза, тополь) (Donoghue et al., 1996) или солома (пшеница) (Delpech, Olivier, 1991; Kalberer, 1998; Mata et al., 2003). Статистически доказано, что количественные показатели, характеризующие рост колонии, зависят от состава субстрата, биологических особенностей штамма и сочетания этих факторов (Фомина и др., 1998; Gaitan-Hernandez etal., 2006). Традиционно в странах Юго-Восточной Азии используют смесь дубовых опилок и рисовых отубей (Ito, 1978).
Для повышения урожайности гриба в опилочный субстрат вносят минеральные, в первую очередь азотные, и витаминные добавки, которые также влияют на уменьшение заражения Trichoderma spp. на начальных стадиях освоения субстрата L. edodes (Mata et al., 1998; Savoie et al, 2000; Mata, Savoie, 1998; Ohmasa, Cheong, 1999). Относительную влажность субстрата доводят до 55-70 %. Увлажненный субстрат фасуют в пластиковые мешки и стерилизуют в автоклаве (1,5 атм.). Время стерилизации зависит от объема субстрата в мешке (Краснопольская, Белицкий, 2002).
Отходы сельского хозяйства могут быть использованы для получения жидкого инокулюма для коммерческого производства шиитаке. Биоконверсия отходов сельского хозяйства является довольно привлекательной альтернативой, как для коммерческого производства биомассы гриба, так и для уменьшения числа отходов, тем самым, сокращая загрязнение окружающей среды (Feofilova et al., 1996).
Соблюдение правил асептики при посеве шиитаке - медленнорастущей культуры с невысокой конкурентной способностью — чрезвычайно важно, поскольку их нарушение приводит к попаданию в обогащенный питательными веществами субстрат быстрорастущих конкурентных грибов и бактерий, блокирующих рост шиитаке (Leatham, Griffin, 1984).
Следующая стадия технологического процесса - инкубация инокулированного субстрата. Эту стадию проводят в помещениях с естественным или искусственным освещением и вентиляцией. Определено, что рассеянный свет в пределах 200 - 250 люкс проявляет стимулирующий эффект в период плодообразования, относительная влажность воздуха составляет 85-90 % (Коробан, 2005). Оптимальная температура субстрата для развития вегетативного мицелия шиитаке составляет 25 С (Zervakis et al., 2001). Длительность процесса инкубации варьирует от 30 до 120 дней в зависимости от штамма гриба, состава и массы субстрата, количества инокулюма, его распределения по объему, а таюісе температуры инкубации. Основным признаком завершения фазы вегетативного роста служит появление коричневой мицелиальной пленки, образующейся на поверхности зрелого мицелия. Мицелиальная пленка представляет собой плотное сплетение толстостенных пигментированных гиф, которые защищают блок от проникновения патогенных и конкурентных микроорганизмов и регулируют влажность блока (Александрова и др., 1998).
Для перехода к плодообразованию необходима его индукция. "Созревший блок" извлекают из мешка и переносят в помещение для плодоношения. Первая волна плодообразования может инициироваться снижением температуры воздуха до 5-16 С на 12-24 ч, а также снижением концентрации С02. Образование и рост плодовых тел
происходит при температуре от 10 до 20 С и относительной влажности воздуха - 75-95 %. В среднем длительность индукции составляет 1-3 дня, образования примордиев - 3-10 дней, плодоношения - 14-21 день. После окончания волны плодоношения наступает период покоя, во время которого возобновляется вегетативный рост культуры и происходит накопление питательных веществ, необходимых для следующей волны плодоношения. Длительность этого периода составляет от 10 до 30 дней. Для инициации второй и последующих волн плодообразования требуется замачивание блоков в холодной воде, что позволяет снизить температуру блока и восстанавливает его водный баланс. После замачивания блоки должны быть подсушены, иначе поверхностная влага создает благоприятные условия для заражения плесневыми грибами и бактериями (Краснопольская, Белицкий, 2002). Характер отдачи урожая волнами зависит от используемого штамма (Levanon et al., 1993) и формулы субстрата.
Суммарная биологическая эффективность за весь срок плодоношения варьирует по данным разных авторов от 40 до 100 %, что выше по сравнению с экстенсивным способом выращивания (Wasser, Weis, 1997).
Согласно исследованиям ученых из Северной Кореи, отходы субстрата после выгонки плодовых тел L. edodes, могут быть эффективно использованы для получения биоэтанола (Lee et al., 2007).
Оптимизация состава среды для погруженного культивирования L. edodes
Оптимизацию количественного и качественного состава ферментационной среды для погруженного культивирования отобранного штамма проводили методами математического планирования. Для создания эффективной среды использовали метод полного факторного эксперимента и метод крутого восхождения (Максимов, Федоров, 1969; Максимов, 1980).
Оптимизация была проведена в три этапа, каждый из которых состоял из серии экспериментов, проведенных по этим методам. За исходную среду на первом этапе оптимизации была взята среда, содержащая глюкозу 15 г/л, соевую муку 13 г/л, растительное масло 13 мл/л, дигидрофосфат калия 2,5 г/л и сульфат магния 0,25 г/л. Для обработки результатов применяли программу Statistica 6.0.
Выращивание плодовых тел штаммов L. edodes проводили на блоках с зерновым мицелием по методу Стаметса (Stamets, 2000).
Зерновой субстрат готовили по следующей технологии. Пшеничное зерно заливали водой и варили в течение 40 минут. Далее зерно подсушивали и добавляли к нему 1-1,5 % масс, смеси гипса и мела в соотношении 3:1. Зерно, смешанное с минеральными веществами, в количестве 3,5-4 кг расфасовывали в полипропиленовые пакеты. Пакеты с субстратом стерилизовали в автоклаве под давлением в 1,5 атм. в течение 3 часов. Подготовленный зерновой субстрат инокулировали погруженной культурой гриба из расчета 3 % (10-15 мл/кг). Инкубацию проводили в темноте при температуре 24-26 С в течение 12-18 суток. После полного зарастания зернового субстрата мицелием пакеты выставляли в камеру для плодоношения с температурой 18 С, относительной влажностью воздуха 80-90 %, вентиляцией 2 об/час и освещением 500 люкс.
Определяли массы базидиом, шляпок и ножек, высоту базидиом и ножек, толщину шляпок в центре, диаметры ножек вверху и внизу и шляпок в двух взаимоперпендикулярных направлениях. Отмечали форму шляпок и расположение ножек (Бухало, 1988). Морфометрический анализ плодовых тел штаммов проводили вычислением статистических характеристик выборки из 10 базидиом при количественной изменчивости признака с 95 %-ным доверительным интервалом для среднего значения совокупности (Доспехов, 1985) с использованием программы Excel. Использовали одновозрастные базидиомы второй волны, как наиболее выровненные по морфологическим признакам.
Для изучения антибиотического действия культуральной жидкости, погруженного мицелия и плодовых тел пятнадцати штаммов L. edodes готовили этанольные экстракты.
Фильтрат культуральной жидкости со значением рН 3,25-3,45 экстрагировали равным объемом этилацетата. С помощью делительной воронки этилацетатную фракцию отделяли от водной. Затем этилацетат удаляли под вакуумом на роторном испарителе. Сухой остаток этилацетатного экстракта растворяли в этиловом спирте таким образом, чтобы исходная концентрация метаболитов была увеличена в 50 раз. Полученным этанольным концентратом этилацетатного экстракта пропитывали бумажные диски. После высыхания диски выкладывали на чашки Петри с тест-организмами. Сырой погруженный мицелий экстрагировали этиловым спиртом в соотношении 10 г сырого мицелия на 50 мл растворителя в течение 5 часов. Затем экстракт отфильтровывали от мицелия через фильтровальную бумагу и на вакуумном роторном испарителе удаляли этиловый спирт. Сухой остаток растворяли в 1 мл этанола. Полученным экстрактом пропитывали бумажные диски. После высыхания диски выкладывали на чашки Петри с тест-организмами. Активность экстрактов культуральной жидкости и мицелия всех штаммов изучали при выращивании культур на среде L1 в течение 6 суток. Экстракты плодовых тел, отдельно шляпок и ножек, готовили также как и экстракт мицелия.
Изучение антибиотического действия экстрактов проводили методом диффузии в агар с использованием бумажных дисков на чашках Петри с тест-организмами (Герольд, 1966). Количество наносимого материала на диск составляло 1-3 мкг сухого вещества.
Использовали следующие тест-организмы коллекции ГУ НИИНА им. Г.Ф. Гаузе РАМН: грамположительные бактерии Bacillus subtilis АТСС 6633, В. cereus subsp. mycoides 537, Micrococcus luteus NCTC 8340, Staphylococcus aureus FDA 209P, Streptococcus pneumonia, грамотрицательпые бактерии Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATCC 25922, Commamonas terrigena ATCC 25922, дрожжи Candida albicans и мицелиальные грибы Aspergillus niger INA 00760, Fusarium bulbigenum, Verticillium albo-atrum. А также мицелиальный гриб Trichoderma harzianum 155 коллекции кафедры микологии и альгологии МГУ им. М.В. Ломоносова и культуры грибов-дерматофитов Microsponim canis 147, Trichophyton mentagrophytes v. gypseum 2424, Scopulariopsis sp. 178 коллекции лаборатории микологии ЦКВД №1 г. Москвы. Культуры мицелиальных грибов, дрожжей и В. cereus subsp. mycoides инкубировали при температуре 28 С, остальные культуры - при температуре 37 С. При использовании метода диффузии в агар из бумажных дисков культивирование проводили в течение 20 часов. Критерием действия исследуемых экстрактов служила величина зоны ингибирования роста тест-организма. При внесении исследуемых материалов в питательные среды наблюдение вели до полного зарастания чашки Петри с контрольной средой колонией тест-объекта.
Действие экстракта культуральной жидкости штамма 15 L. edodes, в отношении Т. harzianum проводили на плотной среде КГА с внесением в нее 1 % этанольного экстракта. Контролем служил рост Т. harzianum на плотной среде КГА с 1 % этанола.
Действие экстракта культуральной жидкости штамма 15 L. edodes, на грибы-дерматофиты изучали на плотной среде Сабуро (казеиновый пептон - 10 г/л, мальтоза -40 г/л, агар - 20 г/л рН = 6,5-7) с использованием такой же методикой, что и с Г. harzianum.
Для получения компонентов в хроматографически чистом виде проводили разделение полученных этанольных экстрактов, представляющих собой антибиотический комплекс, методом препаративной тонкослойной хроматографии на пластинках с широкопористым силикагелем ("Silufol", Чехословакия) в системе хлороформ — бензол — метанол в соотношении 30:20:7. Разделение зон на пластинках для последующей элюции проводили в соответствии с результатами биоавтографического проявления на тест-культурах В. subtilis и A. niger, проявления перманганатом калия и по свечению в УФ-свете при длине волны 254 нм. UV-VIS-спектры снимали на спектрофотометрах Shimadzu 1601С и Hitachi U-2000 (Japan). Масс-спектры выделенных антибиотиков регистрировали на приборе VISION методом MALDIOF в режиме положительных ионов. Лазер — азот, 337 nm, матрица - DHB (2,5-дигидрокси-бензойная кислота).
Выделение и идентификация биологически активных веществ штаммов L. edodes
Разработку состава жидкой питательной среды для культивирования штамма 15 L. edodes проводили в два этапа. На первом этапе изучали зависимость выхода биомассы и содержания в ней водорастворимых полисахаридов от качественного состава источников питания, на втором проводили оптимизацию количественного соотношения источников питания, отобранных на первом этапе.
Качественный подбор источников питания жидких сред проводили с использованием различньк источников углерода и азота. В качестве источников углерода были использованы глюкоза, крахмал, растительное масло, сахароза, меласса, тростниковый сахар, в качестве источников азота — соевая мука, соевый пептон, кукурузный экстракт с добавлением нитрата натрия, казеиновый пептон, дрожжевой экстракт с добавлением нитрата натрия, пшеничная мука (табл. 4). Подбирали различные сочетания выбранных источников питания. Изучение накопления биомассы штамма 15 L. edod.es на этих средах показало, что наибольшую продукцию мицелия обеспечивает среда L21, содержащая в своем составе глюкозу (20 г/л), растительное масло (10 мл/л), соевую муку (10 г/л) и минеральные соли.
Известно, что источники питания способны менять биосинтетическую деятельность культуры. Было изучено их влияние на количественное содержание полисахаридов мицелия штамма 15 L. edodes, выращенного на пяти жидких средах различного состава, представленных в таблице 23. Среды также содержали дигидрофосфат калия и сульфат магния в количестве 2,5 г/л и 0,25 г/л, соответственно. Оценка содержания водорастворимых полисахаридов в погруженном мицелии показала, что среда L21 способствует наибольшему выходу водорастворимых полисахаридов мицелия, а среда L7 — наименьшему.
Сопоставление значений выхода воздушно-сухой биомассы и выхода полисахаридов, а также ранее изученной антибиотической активности позволили отобрать для следующего этапа работы по созданию рецептуры среды для погруженного культивирования штамма 15 L. edodes в качестве базовой среду с глюкозой, растительным маслом и соевой мукой. В условиях опыта было отмечено высокое, до 42 %, содержание липидов при выращивании штамма 15 L. edodes на среде с кукурузным экстрактом в качестве источника азота. Липиды экстрагировали методом Фолча (Folch, Lees, Sloan-Staulet, 1957) из высушенного погруженного мицелия. Жирнокислотный состав липидов анализировали в виде метиловых эфиров жирных кислот на газожидкостном хроматографе «Chrom-5» (Чехия). Идентификацию жирных кислот проводили по относительным удерживаемым объемам, а также в сопоставлении с показателями метиловых эфиров чистых жирных кислот (Верещагин, Скворцов, Исхаков, 1963; Кейтс, 1975). Проведенный жирнокислотный анализ липидной фракции показал, что основной насыщенной жирной кислотой является — пальмитиновая, количество которой составляет 13,3 %, ненасыщенной — линолевая, содержание которой достигает 62,3 %.
Известно, что при оценке пищевых потребностей при росте базидиальных грибов следует учитывать не только качественный состав источников питания, который был разработан в предыдущих опытах, но также их количественное соотношение. Одними из наиболее удобных инструментов разработки количественного состава питательных сред являются методы математического планирования эксперимента. Их применение, согласно предварительным данным, может также минимизировать длительность процесса культивирования.
Была поставлена задача оптимизации питательной среды, чтобы ее состав мог полностью удовлетворять пищевые потребности культуры и способствовать максимальному накоплению биомассы. Процесс оптимизации питательной среды может быть охарактеризован зависимостью выхода процесса (у) от изучаемых факторов (хь хг, хз, ..., хп). Уровень этих факторов в каждый момент определяет состояние системы. Поэтому изучение такой системы можно представить как исследование функции многих переменных, т. е. отыскивание зависимости вида; у = f (xi, хг, хз, ..., хп). Это уравнение описывает некоторую гиперповерхность в многомерном пространстве (факторное пространство), и, следовательно, изучение многофакторной системы можно представить, как исследование формы этой поверхности, называемой поверхностью отклика. Для осуществления оптимизации состава питательной среды были выбраны методы математического планирования эксперимента, включающие полный факторный эксперимент (ПФЭ) и опыт по методу крутого восхождения (KB) (Максимов, Федоров, 1969; Максимов, 1980).
В предыдущих опытах на основании сравнения эффективности жидких питательных сред, различающихся сочетаниями источников углерода и азота, был проведен качественный отбор источников питания. Лучшие результаты показала среда, в которой в качестве источников питания были глюкоза, соевая мука и растительное масло. Выход воздушно-сухой биомассы штамма 15 L. edod.es при культивировании на данной среде в среднем составлял 8-12 г/л на 6-7 сутки культивирования.
Для проведения оптимизации была взята среда, содержащая глюкозу 15 г/л, соевую муку 13 г/л, растительное масло 13 мл/л, дигидрофосфат калия 2,5 г/л, сульфат магния 0,25 г/л. Указанные концентрации были приняты за средний уровень в матрице планирования полного факторного эксперимента. Сульфат магния не варьировался. Уровни исследуемых факторов приведены в таблице 24. Общее число комбинаций варьирующих факторов в ПФЭ равнялось 2 . Длительность процесса культивирования составляла 6 суток. Критерием оценки (Yu) служил выход воздушно-сухой биомассы.
Оптимизация количественного состава жидкой питательной среды методами математического планирования эксперимента
Базидиомицет L. edodes известен как культивируемый съедобный гриб и как продуцент разнообразных биологически активных соединений, различающихся спектром своего действия. В подавляющем большинстве работ по изучению биологической активности этого вида рассматривается какой-либо один вид активности. Как следствие изучаемые штаммы описываются как продуценты биологически активных соединений, вызывающий один определенный эффект. В то же время выявление штаммов с широким спектром биологического действия и выраженной активностью имеет значение, как для изучения этого вида, так и для биотехнологических работ. Получение таких культур приведет к сокращению числа производственных штаммов и, как следствие уменьшению объемов работ по сохранению их биосинтетической активности, к возможности получения в одном биотехнологическом процессе нескольких биологически активных соединений, что сократит затраты на их производство. Проведение настоящей работы, основанной на изучении штаммового разнообразия L. edodes, позволило выявить штамм 15, образующий метаболиты с высокой антибиотической активностью и метаболиты с выраженным самостоятельным противоопухолевым действием. При погруженном культивировании этого штамма антибиотический комплекс накапливался в культуральной жидкости, противоопухолевые полисахариды - в мицелии.
Изучение антибиотической активности штаммов L. edodes показало, что этот вид в целом обладает достаточно высокой антибактериальной и антифунгальной активностью. Были выявлены штаммы L. edodes, экстракты культуральных фильтратов и погруженных биомасс которых показали выраженное антибиотическое действие в отношении грамположительных бактерий (Я subtilis, В. cereus subsp. mycoides, М. luteus, S. aureus, S. pneumonia), грамотрицательных бактерий (P. aeruginosa, E. coli, С terrigena), одного вида дрожжей (С. albicans), мицелиальных грибов (A. niger, F. bulbigenum, V. albo-atrum, Т. harzianum), а также грибов-дерматофитов (М canis, Т. mentagrophytes v. gypseitm, Scopulariopsis sp.). Основным компонентом антибиотического комплекса изученных штаммов L. edodes был лентинамицин В. Выделение этого соединения в хроматографически чистом виде позволило впервые детально изучить его действие в отношении бактериальных и грибных тест-культур.
Вегетативный мицелий L. edodes штамм 15, выращенный в условиях погруженной культуры, обладал выраженной антибиотической активностью, в то время как плодовые тела этого штамма такую активность практически не показали. В природе вегетативный мицелий, находящийся в субстрате, в значительно большей степени контактирует с представителями его микробиоты, по сравнению с базидиомами. Можно предположить, что выявленное различие в наличии антибиотических свойств связано с необходимостью вегетативного мицелия подавлять рост и развитие возможных конкурентов за субстрат. Вегетативный мицелий гриба в природной среде обитания, по-видимому, также синтезирует антибиотические вещества в гораздо большем количестве, чем плодовое тело, т. к. ему необходимо выдержать борьбу с конкурирующими видами мицелиальных грибов и бактерий. Из числа мицелиальных грибов наибольшую опасность представляют Trichoderma, Gliocladium, Mucor, Penicillium, Doratomyces.
Изученные штаммы L. edodes показали разную скорость роста в условиях погруженной культуры, разные уровни накапливаемого погруженного мицелия и разное содержание в нем водорастворимых полисахаридов. Отобранный в результате проведения работы штамм 15 обеспечивал наиболее высокий выход водорастворимых полисахаридов. Моносахаридный состав суммарной фракции водорастворимых полисахаридов включал шесть нейтральных моносахаридов, основным являлась глюкоза. По содержанию глюкозы в водорастворимых полисахаридах штамм 15 L. edodes намного превосходит штаммы других видов ксилотрофных базидиальных грибов, выращенных также в условиях погруженной культуры (Автономова и др., 2006, Krasnopolskaya et al., 2008). Следует отметить, что наиболее известным биологически активным полисахаридом L. edodes является лентинан, представляющий собой p-D-глюкан.
Достоверное противоопухолевое действие in vivo на модели перевиваемой солидной опухоли в проведенной работе продемонстрировали водный экстракт и суммарная фракция водорастворимых полисахаридов L. edodes штамм 15. Совместное применение водного экстракта мицелия с однократным введением циклофосфамида в низкой иммуномоделирующей дозе резко усиливало противоопухолевый эффект. Торможение роста опухоли при сочетанном применении водного экстракта и цитостатика составило 98,8 % на 18-е сутки опыта. Этот факт свидетельствует о возможных перспективах в разработке курсов лечения, предусматривающих сочетания химиотерапии с препаратами на основе грибных метаболитов, усиливающих противоопухолевый иммунитет.
При получении водного экстракта мицелия штамма 15 была опущена традиционная стадия сушки, измельчения мицелия и первичной обработки порошка этанолом. Расчет соотношения сырого мицелия и экстрагента вели с учетом содержания влаги в мицелии. При этом противоопухолевая активность полученного экстракта была достоверной и высокой. Это свидетельствует о возможности использования данной сокращенной методики, как при проведении научных исследований, так и при организации производства субстанций с противоопухолевыми свойствами на основе метаболитов базидиальных грибов. Проведенная работа показала перспективность использования методов математического планирования эксперимента при разработке составов питательных сред. Оптимизация количественного состава питательной среды для погруженного культивирования штамма 15 L. edodes была проведена с применением метода полного факторного эксперимента и метода крутого восхождения. В результате были достигнуты: 1) двухкратное увеличение выхода биомассы, 2) увеличение содержания в погруженном мицелии водорастворимых полисахаридов, 3) сокращение длительности процесса культивирования, 4) стабильность периодического процесса культивирования, выражающася в воспроизводимости выходов биомассы, значения конечного рН культуральной жидкости, 5) морфологическая однородность погруженного мицелия, отсутствовавшая при использовании исходных неоптимизированных сред, 6) сохранение антибиотической и противоопухолевой активности.
Отобранный в результате проведенной работе штамм L. edodes, по-видимому, представляет собой удачный объект для продолжения физиолого-биохимических и медико-биологических исследований. Дальнейшее изучение L. edodes штамм 15 в НИИНА РАМН показало, что эта культура проявляет гиполипидемические свойства, в том числе связанные с подавлением ранних этапов биосинтеза стсролов (Тренин и др., 2009). Таким образом, можно предположить, что кроме идентифицированного в настоящей работе эритаденина, штамм 15 способен синтезировать другое или другие соединения с гиполипидемической активностью. Изучение трофических потребностей этого штамма выявило условия, при которых в его мицелии накапливается значительное количество липидов. Изучение жирнокислотного состава липидной фракции показало наличие в ней эссенциальных жирных кислот.
