Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Антигены трихинелл и их характеристика. 8
1.2. Диагностика трихинеллеза иммуноферментным методом 21
1.3. Дот-ИФА в диагностике гельминтозов 32
2. Собственные исследования. 46
2.1. Материалы и методы 46
2.1.1. Материалы 46
2.1.2. Методы исследований 47
а) Получение личинок Trichinella spiralis, приготовление соматического экстракта 47
б) Получение соматического фракционированного антигена трихинелл 48
в) Получение экскреторно-секреторного антигена трихинелл 49
г) Физико-химическая характеристика соматического фракционированного и экскреторно-секреторного антигенов трихинелл 49
д) Постановка и учет иммуноферментной реакции при трихинеллезе свиней с экскреторно-секреторным антигеном 50
е) Разработка дот-ИФА при трихинеллезе свиней 51
ж) Изучение динамики антител при экспериментальном трихинеллезе свиней в ИФР и дот-ИФА 53
з) Диагностическая эффективность ИФР при трихинеллезе свиней с соматическим фракционированным и экскреторно-секреторным антигенами 53
и) Диагностическая эффективность дот-ИФА и ИФР при трихинеллезе свиней с экскреторно-секреторным антигеном в производственных условиях .54
к) Статистическая обработка результатов 55
2.2. Результаты исследовани 55
2.2.1. Анализ данных по получению соматического фракционированного и экскреторно-секреторного антигенов Trichinella spiralis 55
2.2.2. Анализ данных по физико-химической характеристике соматического фракционированого и экскреторно-секреторного антигенов трихинелл 60
2.2.3. Результаты исследований по постановке и учету иммуноферментной реакции при трихинеллезе свиней с экскреторно-секреторным антигеном 62
2.2.4. Результаты исследований по разработке дот-ИФА при трихинеллезе свиней 69
2.2.5. Анализ данных по динамике антител при экспериментальном трихинеллезе свиней в ИФР и дот-ИФА 78
2.2.6. Диагностическая эффективность ИФР при трихинеллезе свиней с соматическим фракционированным и экскреторно-секреторными антигенами 84
2.2.7. Диагностическая эффективность дот-ИФА и ИФР при трихинеллезе свиней с экскреторно-секреторным антигеном 90
Обсуждение полученных результатов 94
Выводы 105
- Диагностика трихинеллеза иммуноферментным методом
- Результаты исследовани
- Результаты исследований по разработке дот-ИФА при трихинеллезе свиней
- Диагностическая эффективность дот-ИФА и ИФР при трихинеллезе свиней с экскреторно-секреторным антигеном
Введение к работе
Актуальность проблемы. Трихинеллез, вследствие повсеместного распространения возбудителя на земном шаре, является глобальным антропозоогельминтозом. Это инвазионное заболевание представляет собой серьезную медицинскую, ветеринарную и социально-экономическую проблему во всем мире, так как наносит немалый ущерб хозяйству стран и обществу в целом. Поэтому во многих странах с неизменным постоянством и высокой интенсивностью ведутся комплексные ветеринарно-медико-биологические исследования по трихинеллезу, но несмотря; на это актуальность проблемы не ослабевает, а в нашей стране в последнее время даже возрастает.
Предусмотренные существующими инструкциями мероприятия по борьбе с трихинеллезом не обеспечивают надежной профилактики этого гельминтоза у сельскохозяйственных животных. Свинина и изделия из нее продолжают оставаться основными источниками возбудителя заболевания людей. Причиной этого является недостаточная эффективность посмертных прямых методов диагностики, используемых на мясокомбинатах и убойных пунктах, не гарантирующих полную выявляемость всех зараженных животных. Так, наиболее широко применяемая в своем классическом варианте методика компрессорной трихинеллоскопии по Reissman (1908), основанная на исследовании 24 срезов ножек диафрагмы, позволяет выявлять, инвазию с интенсивностью свыше 1 -2 личинок на 1г мышц. Между тем, слабое заражение встречается гораздо чаще, чем умеренное и сильное. Помимо этого, метод плохо поддается механизации, малопроизводителен, крайне утомителен и достаточно дорог (требует привлечения большого штата трихинеллоскопистов).
Групповое исследование мышц методом переваривания в искусственном желудочном соке (ИЖС) значительно превосходит по диагностической эффективности компрессорную трихинеллоскопию, особенно с позиций главной задачи экспертизы - предупреждения опасного для здоровья людей заражения трихинеллами, так как успешно выявляет жизнеспособные личинки. Однако, при высоких скоростях убоя и переработки свинины, которые обычно имеются на; больших мясоперерабатывающих предприятиях, применение его становится затруднительным (F.C. Leighty, 1983). Кроме того, он неэффективен в случае гибели личинок, что значительно снижает его ценность (особенно для решения некоторых вопросов эпизоотологии и эпидемиологии).
Для повышения результативности профилактических противотрихинеллезных, мероприятий, в первую очередь следует разрабатывать надежные и недорогие методы прижизненной диагностики трихинеллеза свиней, что позволило бы предупреждать затраты на содержание больных животных и решать другие проблемы научно-исследовательского характера, а именно выявлять неблагополучные хозяйства и подворья при эпизоотологических обследованиях, уточнять некоторые вопросы эпизоотологии и эпидемиологии трихинеллеза, пути и факторы передачи, экстенсивность инвазии.
Исходя из сказанного, становится понятным, что совершенствование существующих и изыскание новых, высокоэффективных и возможно универсальных методов посмертной и прижизненной диагностики трихинеллеза является первостепенной задачей и насущной необходимостью как в научном, так и в практическом плане.
Цели і и задачи исследования. Основной целью наших исследований было: разработать иммуноферментную тест-систему дот-ИФА и сравнить диагностическую эффективность ИФР и дот-ИФА при трихинеллезе свиней.
Для выполнения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
1. Получить личинки трихинелл для экспериментального заражения свиней и приготовления соматического фракционированного и экскреторно- секреторного антигенов.
2. Изучить динамику выработки антител у экспериментально зараженных разными дозами Trichinella. spiralis свиней в ИФР.
Провести фракционирование соматического экстракта личинок трихинелл и выделить наиболее эффективную диагностическую фракцию.
Провести культивирование личинок Т. spiralis в искусственной питательной среде, получить экскреторно-секреторный антиген.
5. Провести электрофоретический анализ соматического фракционированного и экскреторно-секреторного антигенов личинок трихинелл в ДСН-ПААГ.
6. Отработать параметры постановки иммуноферментной тест-системы дот-ИФА.
7. Оценить диагностические качества фракционированного и экскреторно-секреторного антигенов.
8. Провести производственные испытания ИФА и дот-ИФА при трихинеллезе свиней
Научная новизна. Впервые в России разработана экономичная по времени и перспективная для полевых испытаний иммуноферментная тест- система дот-ИФА (типа dot-ELlSA) при трихинеллезе свиней. Изучена сравнительная динамика выработки антител у свиней, экспериментально зараженных разными дозами личинок трихинелл; проведено фракционирование экстракта Т. spiralis и определена наиболее активная и специфичная фракция; получен экскреторно-секреторный антиген личинок Т. spiralis культивированием в искусственной питательной среде. Проведена сравнительная оценка диагностической эффективности фракционированного и экскреторно-секреторного антигенов при трихинеллезе свиней; определена молекулярная масса диагностически эффективных фракций в антигенах, полученных из личинок Т. spiralis.
Практическая ценность работы. По материалам диссертации разработаны «Временное наставление по применению набора для диагностики трихинеллеза свиней методом дот-ИФ А» и ТУ на «Набор для диагностики трихинеллеза свиней методом дот-ИФ А», а также «Временное наставление по применению набора для диагностики трихинеллеза свиней иммуноферментным методом (ИФА)» и ТУ на «Набор для диагностики трихинеллеза свиней иммуноферментным методом (ИФА)». Документы утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 3 0.03.04 г. (№ 13-5-02/0978, № 13-5-02/0977).
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на:
Международном Ветеринарном Конгрессе, 3-9 сентября, 1995 год, Йокогама (Япония).
7-й Научной конференции по трихинеллезу человека и животных, 2-3 октября, 1996 год, Москва (Россия).
8-й Всероссийской конференции по трихинеллезу, 30-31 мая, 2000 год, Москва (Россия).
Научной конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями», 2003 год, Москва (Россия).
Объединенных сессиях Координационного совещания по ветеринарной паразитологии Центрального совета Общества гельминтологов РАН и секции «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН. (10.12.97; 9.12.99; 26.05.00; 01.06.00; 20-22.02.01; 22-24.05.02; Москва).
Заседаниях Ученого совета ВИГИС (1996-2003).
Основные положения, выносимые на защиту.
Приготовление соматического фракционированного и экскреторно-секреторного антигена из личинок Т. spiralis.
Электрофоретический анализ соматического фракционированного и экскреторно-секреторного антигенов в ДСН-ПААГ.
Разработка диагностической тест-системы дот-ИФА при трихинеллезе свиней.
Изучение динамики выработки антител при экспериментальном трихинеллезе свиней.
Оценка диагностической эффективности фракционированного и экскреторно-секреторного антигена при трихинеллезе свиней.
Сравнительные испытания ИФР и дот-ИФА при трихинеллезе свиней в производственных условиях.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 статей.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 130 страницах машинописного текста. Состоят из введения, обзора литературы, раздела собственных исследований, включающего: материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Список литературы включает 223 источника, в том числе 53 отечественных и 170 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 5 таблицами, 16 рисунками.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Диагностика трихинеллеза иммуноферментным методом
Вопросам иммунодиагностики трихинеллеза посвящено множество работ в различных странах мира, в том числе и в нашей стране. Практически все существующие иммунологические методы пытались применить для диагностики трихинеллеза. Среди них были испытаны различные типы и варианты внутрикожной аллергической пробы (Лукашенко, 1956, 1957; Бессонов, 1962, 1967, 1970; Del Mazza, 1958; Субботин, 1968; Бессонов, Успенский, 1971; Бекиш, Рачковская, 1972; Сакалаускайте,1978); преципитационные (Калюс,1947; Лейкина и др., 1956; Лукашенко, 1957; Бессонов, 1962, 1970; Пашук, 1965; Субботин, 1968; Gancarz, 1968; Гаркави, 1971; Белозеров, 1976; Степанов, 1975; Успенский и др., 1975; Бессонов, Успенский, 1977; Сапунов, 1986; Жданова, 1997); агглютинационные реакции (Thomas et al, 1953; Norman et al, 1955; Лейкина и др., 1956; Лукашенко, 1957 Bozicevich, 1960; Bloomfield et al, 1962; Бессонов, 1966, 1968; Sulzer et al, 1966; Субботин, 1968; Gancarz, 1968; Wilozynski et al.,1969; Успенский, 1971, 1972, 1974; Zapart et al, 1972; Пашук, 1985; Choy et al, 1989; Haralambidis et al, 1989); реакция связывания комплемента (Strobel, 1911; Пашук, 1956; Bozicevich, 1960,1962; Wilozynski et al, 1969; Kampelmacher et al,1965; Белозеров и др., 1985). Более перспективными явились иммунохимически усиленные тесты, первым из которых была реакция иммунофлюоресценции (РИФ), обладающая хорошей чувствительностью и специфичностью. Впервые при трихинеллезе реакция испытана Sadun et al. (1962), Sadun (1963), впоследствии ее широко применяли для диагностики трихинеллеза человека и животных. В основе метода лежит феномен люминесценции. Принцип метода заключается в способности специфических антител, к которым химическим путем присоединена метка — флуорохром, вступать в реакцию с антигеном, образуя комплекс антиген-антитело, обеспечивающий яркое свечение при ультрафиолетовом облучении. В непрямой реакции на антиген вначале действуют немечеными антителами, а затем меченым антивидовым глобулином. РИФ при трихинеллезе небезуспешно применяли многие исследователи (Chroust et al.,1967; Scholtens et ah, 1966; Sulzer, Chisholm, 1966; Ruitenberg et al., 1968; Lupasco et al., 1968; Gancarz, 1968; Gore, Sadun, 1969; Chroust, 1970; Kozar et al., 1970;; Белозеров, 1973, 1976; Kagan, 1976; Белозеров, Бессонов, 1974; Белозеров, Шеховцов, 1978; Chroust, Mittermayer, 1983; Шеховцов и др.,1989).
Следующим этапом была разработка радиоиммунологического анализа (PHA)(Yalow, Berson, 1959), где в качестве метки используют радиоактивные изотопы. В нашей стране были отработаны параметры постановки и учета РИА для диагностики трихинеллеза Белозеровым (1990), который отметил ее высокую специфичность и чувствительность, а также возможность применения как для индивидуальной диагностики, так и для оценки эпизоотической ситуации. Помимо высокой чувствительности и специфичности преимуществом РИА является возможность объективного учета результатов. Метод получил широкое признание и быстро превратился в стандартный инструмент лабораторных исследований в медицине и ветеринарии ,что ускорило важные открытия в области биомедицинских наук. Тем не менее он обладает рядом серьезных недостатков, которые так и не удалось преодолеть поскольку они обусловлены самой его сущностью. Во-первых, сложность и высокая стоимость оборудования; во-вторых, короткий срок хранения антигенов и антител, меченных гамма-излучающими изотопами,. т.к. для метки чаще всего применяется изотоп I с коротким периодом полураспада (60 дней). В-третьих, работа с изотопами небезопасна, необходимы специально оборудованные помещения и специальные меры предосторожности. Указанные недостатки метода препятствуют его массовому применению. Стремление найти замену радиоактивным меткам привело к использованию неизотопных меток, среди которых наиболее перспективными и универсальными для иммуноанализа в настоящее время признаны ферменты. Метод с использованием ферментных меток разработан в 1971году независимо друг от друга тремя группами авторов: Engvall, Perlmann в Швеции, Van Weeman, Schuurs в Нидерландах и Avrameas, Guilbert Engvall, Perlmann предложили называть этот анализ "Enzyme Linked Immunosorbent Assay" или сокращенно ELISA, что в переводе означает — ферментзависимый (энзимом-меченный) иммуносорбентный анализ. Нередко в русском варианте метод называют иммуноферментным анализом ( ИФА ), а саму реакцию - иммуноферментной (ИФР). Данный метод по чувствительности, специфичности, воспроизводимости превосходит реакции, основанные на агглютинации и приближается по этим показателям к радиоиммунологическому анализу, но при этом не требует применения опасных для здоровья радиоактивных реагентов, что делает его гораздо более доступным. Принцип метода состоит в использовании антигенов и антител, ковалентно связанных с ферментами (конъюгатов), способных присоединяться к образовавшимся на твердой фазе иммунным комплексам, что позволяет выявлять их в результате реакции фермента с хромогенным субстратом. Ферменты, среди которых наибольшее распространение получили пероксидаза хрена и щелочная; фосфатаза,, ковалентно присоединяют к антигенам или антителам различными химическими методами, позволяющими сохранять биологическую активность обоим ком-понентам. Результаты анализа можно учитывать визуально и инструменталь-но по оптической плотности окрашенных продуктов реакции. Проблемы специфичности ИФА по характеру и сложности те же, что и у других иммунологических методов. Применение в ИФА моноклональных AT, обладающих строго определенной специфичностью и одинаковой аффинностью, позволило разработать множество новых диагностических систем. Некоторые из них уже выпускаются на коммерческой основе. В качестве твердой фазы для проведения ИФА можно применять различные материалы. В ранних разработках, как правило, использовали пластмассовые пробирки, на смену которым быстро пришли планшеты для титрования с лунками, имеющими плоское прозрачное дно и удобными для измерения оптической плотности продуктов реакции; на спектрофотометрических приборах - ридерах (от англ. to read - читать).
Последние модификации в качестве твердой фазы предусматривают использование палочек и шариков. Модификация с использованием полимерных мембран, которые активно сорбируют белки получила название dot-ELISA, в русском варианте встречаются также названия — иммунодот: или точечная иммуноферментная реакция. Принцип проведения твердофазного ИФА независимо от модификации включает 4 основных этапа: Первый этап реакции - сенсибилизация планшетов основан на принципе большинства антигенов (белки, пептиды, полисахариды, бактериальные липополисахариды) и антител самопроизвольно сорбироваться на поверхности пластика, сохраняя свою активность. Адсорбированные на твердой фазе реагенты уже не смываются буфером, содержащим детергент, тогда как несвязавшиеся - легко удаляются отмыванием. Второй этап реакции предусматривает инкубирование в сенсибилизированных лунках планшета исследуемых образцов и стандартных реагентов. При этом на поверхности твердой фазы формируются иммунные комплексы, состоящие из одного или нескольких слоев. Несвязавшиеся компоненты на каждом этапе удаляют отмыванием, что позволяет добиться высокой специфичности анализа. Третий этап включает связывание конъюгата (антитело-фермент или антиген-фермент) с иммобилизированным иммунным комплексом. При этом активный центр фермента остается доступным для взаимодействия с субстратом. Четвертый этап - инкубация субстрата в лунках с иммобилизованным конъюгатом, приводит к развитию цветной реакции. Эту реакцию останавливают на нужной стадии, а выраженность окрашивания оценивают визуально или спектрофотометрически по оптической плотности. Всякий раз, когда предлагалась новая иммунологическая реакция, ее, как правило, в последнюю очередь применяли в паразитологии. С ИФР получилось наоборот: первой и удачной областью - ее применения была именно паразитология, а трихинеллез был в числе первых паразитарных заболеваний, для диагностики которого применили ИФР. Еще в 1973 году Ruitenberg et al разработали тест-систему для обнаружения антител при трихинеллезе свиней., В нашей стране тест-систему для диагностики трихинеллеза разработали Ефремов ( 1977 ), Ефремов, Ермолин ( 1980 ). С тех пор были проведены многочисленные исследования с применением ИФР, как в паразитологии вообще, так ив гельминтологии: в частности.
Результаты исследовани
Соматический фракционированный антиген. В процессе фракционирования (рис.1) экстракта личинок трихинелл на сефадексе G-200 мы получили, пять белковых пиков, из которых первые два пика содержали диагностически активные антигенные компоненты. При этом белки первого пика имели очень хорошую активность, но давали много ложноположительных реакций в серологии. Белки второго пика показали не только высокую чувствительность, но и лучшую специфичность. Учитывая неоднородность антигенных компонентов в полученных пиках при гель-фильтрации на сефадексе G-200, что может влиять на специфичность и иммунологическую активность антигена, мы модифицировали методику фракционирования экстракта личинок трихинелл. Модификация заключалась в дополнительном разделении на фракции объема элюата наиболее специфического второго пика и граничащей с ним зоны первого пика (как наиболее активной). В результате были получены 9 фракций, выходивших в процессе элюирования в следующем порядке: 1 - верх первого пика; 2 - середина снижения первого пика; 3 - конец первого пика; 4 - начало второго пика; 5 — середина подъема второго пика; 6 - верх второго пика; 7 — начало снижения второго пика; 8 - середина снижения второго пика и 9 - конец второго пика. Иммунологическую активность этих фракций испытали в иммуноферментной реакции на одних и тех же сыворотках свиней, экспериментально зараженных личинками трихинелл (умеренный и слабый иммунный ответ). Результаты анализа показаны в таблице 1. Специфичность, фракций изучали на 96 сыворотках крови убойных свиней (из различных зон страны, благоприятных и неблагоприятных по трихинеллезу) и по данным ветсанэкспертизы не имеющих тканевых гельминтов. Установили, что 5-я фракция (середина подъема второго пика) является наиболее специфичной при сохранении высокой чувствительности (рис. 1, табл. 1). Экскреторно-секреторный антиген. В результате опытов по культивированию (рис.2) в питательной среде ДМЕМ инвазионных личинок Т. spiralis получили их экскреторно-секреторные продукты общим объемом 100 мл с содержанием белка в разных сериях от 400 до 550 мкг/мл. Испытали их диагностическую активность в ИФР на сыворотках свиней, экспериментально зараженных трихинеллами, со слабым и умеренным иммунным ответом.
Титры составили 1:200 и 1:1600 соответственно. Исходя из представленных схем (рис. 2), включающих этапы получения антигенов трихинелл методами фракционирования и культивирования в искусственной питательной среде четко прослеживаются преимущества второго метода. Эти преимущества заключаются в том, что резко сокращается время получения антигена: нет необходимости в больших временных затратах на подготовительные этапы (приготовление экстракта, подготовка оборудования и носителей для фракционирования), предшествующие фракционированию и требующие специальных и квалифицированных навыков персонала. В то же время полученные обоими способами антигены трихинелл по своей диагностической активности (свойствам) сопоставимы. Для сравнения соматического фракционированного и экскреторно-секреторного антигенов использовали метод электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAAG), который выполняли согласно Laemmli (1970) с некоторыми модификациями. Для разделения белков в денатурирующих условиях использовали; 12,5 %-ный гель в присутствии додецилсульфата натрия. На электрофореграмме соматического фракционированного антигена выявлено 17 компонентов, причем наиболее интенсивно окрашенные из них расположены в диапазоне белков молекулярной массы 31-68 кДа. Мажорные белковые полосы (№2, №3; №5, №7, №1) в убывающем порядке по степени проявления и соответственно по количеству белка располагаются в диапазоне белков молекулярной массы 55 кДа, 44 кДа, 40 кДа, 31 кДа. и 68 кДа Еще две полосы (№4, №6) также достаточно интенсивно окрашенные, но по сравнению с мажорными с меньшим содержанием белка, расположены в области белков молекулярной массы 42,7 и 39 кДа. Остальные полосы, судя: по степени проявления, характеризуются незначительным количеством белка, а некоторые из них почти неотличимы от общего фона (рис.3). В белковом спектре экскреторно-секреторного антигена выявлено 18 белковых компонентов, из которых наиболее выраженные расположены в диапазоне белков молекулярной массы 44-64 кДа. Мажорная белковая полоса (№ 5), по степени проявления и соответственно по количеству белка располагается на электрофореграмме в диапазоне 44 кДа. Одна белковая полоса, также интенсивно окрашенная проявлялась в области белков молекулярной массы 55 кДа, а две другие - 10 и 87,1 кДа. Остальные белковые полосы проявляются очень слабо и по интенсивности окраски приближаются к фону (рис.3). При сравнении белкового спектра соматического фракционированного и экскреторно-секреторного антигенов отметили в обоих препаратах полосы, расположенные в диапазоне белков, имеющих одинаковую молекулярную массу — 55 кДа (для соматического - №2; для экскреторно-секреторного — №4). Тем не менее, они отличаются по степени проявления: на электрофореграмме соматического фракционированного антигена она представлена четко выраженной широкой полосой, тогда как в экскреторно-секреторном — она выражена значительно слабее. Полосы, расположенные в области белков молекулярной массы 44 кДа на электрофореграммах обоих антигенов, хотя в количественном отношении сопоставимы, тем не менее, являются неравноценными, поскольку в экскреторно-секреторном антигене эта полоса представляет основной белковый компонент. Что касается соматического фракционированного антигена» то таковыми являются полосы, расположенные в зоне белков молекулярной массы 55, 44, 40, 31 и 68 кДа. Полосы №4 (42,7 кДа), №5 (40 кДа), №6 (39 кДа) и №7 (31 кДа), хотя и присутствуют в экскреторно-секреторном антигене, но в сравнении с соматическим фракционированным выражены очень слабо и по интенсивности окраски приближаются к фону. 2.2.3. Результаты исследований по постановке и учету иммуноферментной реакции при трихинеллезе свиней с экскреторно-секреторным антигеном. Определение оптимальной концентрации антигена. Чувствительность, а также в немалой степени и специфичность иммуноферментной реакции во многом зависит от концентрации антигена при сенсибилизации планшетов.
Опыты, по определению оптимальной концентрации антигена были выполнены нами с использованием 2-х сывороток крови: свиней, экспериментально инвазированных разными дозами личинок трихинелл и с предварительно установленным иммунным ответом (слабый и умеренный), а также на гетерологичных сыворотках от свиней с экспериментальным и естественным заражением E. granulosus, A. suum, Т. suis. Отрицательным контролем в реакции служила сыворотка клинически здоровой свиньи. Исследования показали, что с повышением концентрации антигена с 2 мкг/мл до 40 мкг/ мл чувствительность реакции заметно повышается, достигая оптимума при 5-10 мкг/мл по .белку. Дальнейшее увеличение концентрации до 20 и 40 мкг/мл неблагоприятно отражается на специфичности - она снижается. При этих концентрациях антигена титры некоторых гетеро логичных сывороток стали сопоставимы по уровню с титрами слабой трихинеллезной сыворотки. Таким образом, появляются сомнительные и ложноположительные ответы среди, гетерологичных сывороток, что снижает специфичность теста. Чувствительность при этом; остается на прежнем уровне, то есть перестает повышаться (рис.4). Определение режима сенсибилизации планшетов антигеном. Работу выполняли на тех же сыворотках, что и при определении оптимальной концентрации антигенов. Для разведения исследуемых антигенов при сенсибилизации планшетов использовали карбонатно-бикарбонатный буфер рН; 9,6, который дает хорошие результаты при адсорбции на полистироле антигенов различных гельминтов, в том числе и трихинелл. В качестве белкового стабилизатора разводящих растворов для сывороток и конъюгата был использован бычий сывороточный альбумин, тоже хорошо зарекомендовавший себя в диагностике трихинеллеза и чаще всего употребляемый для этих целей. Испытали несколько режимов сенсибилизации: 4 часа при 4 С; 4 часа при 18-26 С; 4 часа при 37 С;Л 8-20 часов при 4 С; 18-20 часов при 18-26 С; 1 час при 37 С; 1 час при 37 С и затем 18-20 часов при 4 С. Наиболее оптимальными мы считаем два режима: 18-20 часов при 4 С и комбинированный - 1 час при 37 С плюс 18-20 часов при 4 С, Первый из них, исходя из показателей чувствительности, практически не уступает второму.
Результаты исследований по разработке дот-ИФА при трихинеллезе свиней
Определение оптимальной концентрации антигена и минимального диагностического титра. Диагностическую тест-систему дот-ИФА разрабатывали с целью усовершенствования иммунодиагностики трихинеллеза и облегчения работы в полевых условиях. Использовали экскреторно-секреторный антиген, который предварительно для удобства перед отработкой параметров сконцентрировали посредством лиофильной; сушки. Исследования по разработке дот-ИФА (отработке параметров и режимов постановки) проводились дважды. Первоначально работа проводилась на нитроцеллюлозных мембранах российского производства ("ДИНЦ", Москва) с сыворотками, экспериментально зараженных свиней Т. spiralis (слабый и умеренный!иммунный ответ) и с сыворотками свиней! экспериментально и естественно инвазированных другими гельминтами (Е. granulosus,. A. suum, Т. suis). Оптимальная концентрация антигена -0.6 мкг/дот (1 определение) в объеме 2 мкл/дот, что в пересчете составляет 300 мкг/мл. Время инкубации с сыворотками 1 час во влажной камере при комнатной температуре (18-26 С), время инкубации в рабочем растворе конъюгата 30 минут. В этих условиях минимальным диагностическим титром был выбран титр 1:50. В последующих опытах мы перешли на использование импортной нитроцеллюлозной бумаги (Millipore, США), так как качество ее было лучше - пятна (доты) в положительных реакциях проявлялись более ясно и с отчетливо очерченными контурами, что облегчало учет реакции. Мы пересмотрели (переконструировали) параметры и режим постановки тест-системы, уменьшив время проведения реакции. Для определения оптимальной концентрации антигена И: минимального диагностического титра сыворотки мы использовали метод последовательных двукратных разведений антигена и сывороток. Антиген разводили от 800 мкг/мл до 6,25 мкг/мл, сыворотки от 1:5 до 1:320. В результате мы установили, что оптимальной концентрацией антигена при объеме 2 мкл/дот (V определение) является 400 мкг/мл, то есть 0,8 мкг/дот (рис.7). Эта концентрация позволяет максимально разграничить отрицательный контроль и сыворотки свиней с гетерологичной инвазией с одной стороны от положительного контроля и сывороток зараженных животных с другой стороны, в титре 1:10. Таким образом, минимальным диагностическим титром является титр 1:10. Определение режима сенсибилизации мембран антигеном. При отработке режимов иммобилизации на нитроцеллюлозных мембранах антигена использовали два режима и семь растворов для: его разведения: 0,01 М фосфатно-солевой буфер рН 7,4; 0,01 М карбонатно-бикарбонатный буфер рН 9,6; 0,01 М триэтаноламино-солевой буфер рН 7,5; 0,1 М трис-НС1 буфер рН 7,4; 0,05 М трис-HCl буфер + 0,2 М NaCl рН 8,0, физиологический раствор и дистиллированную воду.
Результаты были сопоставимы, но несколько лучшие показатели чувствительности (больше на один титр) получали при использовании карбонатно-бикарбонатного и фосфатно-солевого буферных растворов. В дальнейшей работе мы при сенсибилизации нитроцеллюлозных мембран антигенами трихинелл использовали при необходимости для их разведения 0,01 М карбонатно-бикарбонатный буфер рН 9,6. Несколько хуже были результаты с 0,1 М трис-HCl буфером рН 7,4 и дистиллированной водой. Испытали два режима сенсибилизации: высушивание после нанесения антигена при комнатной температуре (18-26С) и высушивание в термостате при 56С в течение 15 минут. Предпочтение отдали второму варианту, в результате которого положительные реакции проявлялись пятном с более четкими контурами. Определение режима блокирования несвязавшихся участков на мембранах. После иммобилизации антигенного материала насыщаются, как правило, не все участки мембраны. Оставшиеся свободными сайты связывания необходимо инактивировать, чтобы исключить в дальнейшем неспецифическую сорбцию антител и других реагентов на мембране. Для этого проводят процедуру блокирования. Условия блокирования подбирали опытным путем. Использовали два варианта с разными растворами: 5% бычий сывороточный альбумин в 0,01 М триэтаноламино-солевом буфере рН 7,5; 1%-я (по объему) кроличья сыворотка в 0,01 М фосфатно-солевом буфере рН 7,4; 2%-й бычий сывороточный альбумин в 0,01 М фосфатно-солевом буфере рН 7,4; 5-кратный раствор Денхарта; цельную лошадиную сыворотку. Блокирование (инактивацию) проводили 1 час при 37 С или 18-20 часов, при 4 С. Лучше всего предупреждали неспецифическое связывание три раствора: 2%-й бычий сывороточный альбумин в 0,01 М фосфатно-солевом буфере рН 7,4; 5-кратный раствор Денхарта и 1%-я кроличья сыворотка в 0,01 М фосфатно-солевом буфере рН 7,4. Мы отдали: предпочтение раствору, компоненты которого наиболее доступны (в том числе и по цене-2%-й бычий сывороточный альбумин в фосфатно-солевом буфере рН7,4 и режиму блокирования 20 часов при 4С (в течение ночи). Режим постановки реакции. При отработке режима постановки дот-ИФА с экскреторно-секреторным антигеном установили, что оптимальным режимом является вариант инкубации с сыворотками: 40 минут при комнатной температуре (18-26 СС) во влажной камере и 30 минут в рабочем растворе конъюгата при комнатной температуре (18-26 С). Увеличение времени инкубации: усиливает неспецифическое связывание, а следовательно возрастает количество ложных ответов. Ход постановки реакции. Постановку дот-ИФА осуществляли в непрямом варианте с целью выявления антител к Т. spiralis в сыворотке крови свиней. Схема постановки непрямого варианта дот-ИФА представлена на рисунке 8. В качестве твердой: фазы использовали нитроцеллюлозные мембраны с диаметром пор 0,22 цт производства фирмы "Millipore" (США). Все манипуляции с мембраной проводили с помощью анатомического пинцета, не касаясь ее руками. Результаты по отработке параметров и режима постановки реакции следующие: 1. Для иммобилизации антигена на мембране при необходимости в качестве разбавителя использовали 0,01 М карбонатно-бикарбонатный комплексирующий буфер рН 9,6.
Антиген наносили на мембрану в объеме2 мкл на размеченные простым карандашом точки-доты. Затем мембрану высушивали 15 минут при 56 С. 2. Блокирование проводили в 0,01 М фосфатно-солевом буфере рН 7,4 с 2%-м содержанием бычьего сывороточного альбумина в течение 20 часов при 4 С. Затем мембрану отмывали один раз 5 минут в отмывающем растворе, состоящим из 0,01 М фосфатно-солевого буфера с 0,05%-м, содержанием твина-20 (40). 3. На следующем этапе контрольные и исследуемые сыворотки разводили в 0,01 М ФСБ рН 7,2-7,4 с 0,5%-м содержанием БСА и 0,05%-м содержанием твина-20 (40). Наносили на мембрану в объеме 2 мкл/дот с помощью полуавтоматической пипетки. Инкубирование проводили при комнатной температуре (18-26 С) во влажной камере, которая состоит из чашки Петри или подобной подходящей емкости с тонким слоем поролона (0,5 см) и листа фильтровальной бумаги на нем, смоченных отмывающим раствором. Продолжительность инкубации с сыворотками - 40 минут. По окончании инкубации непрореагировавшие компоненты удаляли с мембраны трехкратным отмыванием ее по 5 минут в упомянутом выше растворе, в чашке Петри,, периодически потряхивая емкость. Отрицательным контролем служила сыворотка крови клинически здоровой свиньи; (без тканевых гельминтов по данным ветсанэкспертизы), а положительным - сыворотка от экспериментально зараженного Т. spiralis животного, реагировавшая в дот-ИФА в титре не менее 1:80. Для получения слабоположительного контроля положительную контрольную сыворотку разводят в титре 1:80. 4. Конъюгат использовали в рабочем разведении, которое устанавливали в предварительных опытах для каждой новой; серии. Для приготовления рабочего разведения конъюгата использоволи 0,01 М фосфатно-солевой буфер рН 7,2-7,4 с 1%-м содержанием бычьего сывороточного альбумина и 0,05%-м содержанием твина-20 (40). Мембрану помещали в раствор конъюгата и инкубировали при комнатной температуре (18-26 С) в течение 30 минут, затем отмывали способом, указанным выше (см. п.З). 5. На заключительном этапе мембрану помещали в раствор субстратной смеси и выдерживали 5-Ю минут в темноте
Диагностическая эффективность дот-ИФА и ИФР при трихинеллезе свиней с экскреторно-секреторным антигеном
Для оценки диагностической эффективности обоих тестов при трихинеллезе с экскреторно-секреторным антигеном использовали сыворотки, полученные с мясокомбинатов от убойных свиней из благополучных и неблагополучных по трихинеллезу районов Российской Федерации и Украины с учётом данных ветсанэкспертизы,а также от экспериментально зараженных гельминтами животных. В производственных испытаниях исследовали 354 сыворотки. В их число вошли 12 сывороток от свиней с инвазией Т. spiralis: 6 — с экспериментальной (30-150-й день после заражения) и 6 — с естественной (г. Вологда). Диагноз подтверждён перевариванием проб мышц в искусственном желудочном соке. Других тканевых гельминтов весанэкспертизой не обнаружено. Сыворотки от клинически здоровых свиней в количестве 322 пробы получены с мясокомбинатов из разных районов.. РФ и Украины и по данным ветсанэкспертизы; свободных от трихинелл и других тканевых гельминтов; 20 сывороток получили от свиней, свободных от трихинелл, но по данным ветсанэкспертизы имеющих гетерологичную гельминтную инвазию, в том числе: 5 — естественно инвазированы С. tenuicollis; 2. — O.dentatum; 6 - Е. granulosus; 7 — экспериментально инвазированы E.granulosus. Сыворотки от свиней с естественным цистицеркозом тенуикольным и эхинококкозом получили с мясокомбинатов, а 2 сыворотки от свиней с естественным эзофагостомозом были взяты во время подворного убоя. Полученные результаты представлены в таблице 5. Сыворотки от свиней как естественно, так и экспериментально инвазированных трихинеллами в обеих реакциях дали положительный ответ. Сыворотки от свиней с гетерологичными инвазиями С. tenuicollis, O.dentatum дали отрицательный ответ. Все неспецифические положительные и сомнительные результаты относили к ложноположительным. Ложноположительные ответы дали в каждой реакции по 9 сывороток, из которых: 2 — естественный эхинококкоз, 1 - экспериментальный эхинококкоз, 6 — от клинически здоровых свиней.
Следовательно, ложноположительные результаты зарегистрированы в 2,54% случаев. Специфичность в дот-ИФА и ИФР была в пределах 97,46%. Чувствительность составила в обоих тестах 100%. (Акт прилагается). Таким образом, на основании проведенных сравнительных исследований и полученных данных нами установлено, что по диагностической эффективности дот-ИФА равноценна используемой в настоящее время для диагностики трихинеллёза свиней ИФР. Но в то же время, дот-ИФА более проста в постановке и лучше приспособлена для работы в полевых условиях и малооснащенных лабораториях, так как не требует электрооборудования. Исходя из выше сказанного, нами сделано заключение, что дот-ИФА может использоваться наряду с ИФР для дифференциальной диагностики трихинеллеза свиней и массовых сероэпизоотологических исследований в широкой практикею. Прижизненная диагностика трихинеллеза, основанная на иммунологических реакциях, судя по данным научной литературы, была и остается актуальной проблемой. Развитие иммунодиагностики: гельминтозов происходило в двух направлениях. Во-первых, усовершенствовались известные и разрабатывались более простые в исполнении и высокоэффективные новые иммунологические тесты. Во-вторых, значительный прогресс происходил в разработке методов получения антигенов из гельминтов. Безусловно без взаимосвязи между этими направлениями добиться успеха практически невозможно, поскольку даже при хорошем антигеном препарате, но недостаточно чувствительной иммунологической реакции диагностическая эффективность будет низкой. Аналогичная ситуация возникает и при обратном; варианте. Задача исследователей и состоит в том, чтобы t подобрать оптимальные условия, позволяющие при высокой чувствительности реакций не снизить их специфичность. Вопросом изыскания способов повышения эффективности иммунодиагностических тестов при трихинеллезе посвящено большое число работ отечественных и иностранных авторов (Бессонов, 1975; 1976; Полетаева, 1986, 1990, 1994; Бережко и др., 1988; Успенский, 1988; Белозеров, 1982; Жданова, 1996; Ruintenberg et aL, 1974-1979; VanKnapen et aL, 1976,1980,1981; Rapi6, 1980; Rapid at aL, 1981; Gamble at aL, 1983,1984, 1988; Bolas-Fernandez et aL, 1993; Reina et aL, 1996). Наша работа, посвященная оценке диагностической эффективности двух тестов на основе иммуноферментного анализа - ИФР и дот-ИФА при трихинеллезе свиней, также включала исследования по двум направлениям, а именно -- усовершенствование методов получения наиболее чувствительных и специфичных антигенов из личинок трихинелл и разработке применительно к нашим условиям более простой в исполнении, но не уступающей по эффективности реакции, как дот-ИФА., Для проведения иммунодиагностических исследований при трихинеллезе использовали два вида антигенов — соматический фракционированный и экскреторно-секреторный, каждый из которых, судя; по нашим данным, характеризовался хорошими диагностическими свойствами. Полученные результаты с обоими антигенами были сопоставимы, что позволяет рекомендовать их в качестве диагностикумов при трихинеллезе. Тем не менее учитывая, что получение экскреторно-секреторного антигена менее трудоемко и требует значительно меньше времени, на наш взгляд, он имеет большую перспективу в практическом отношении. Более того о высоких диагностических качествах экскреторно-секреторных антигенов имеется достаточно подтверждений (Костецкий и др., 1988; Philipp et al., 1980; Parkhouse et al., 1984; Gamble at al., 1984; Frydas et al., 1995 и др.). Полученные нами данные при проведении диагностических исследований с использованием экскреторно-секреторного антигена согласуются; с результатами других авторов, которые отмечали, высокую чувствительность и специфичность серологических реакций при трихинеллезе с этими антигенами. Так, Gamble et al. (1984), используя в ELISA экскреторно-секреторные антигены молекулярной массы 45 кДа, 49 кДа, 53 кДа, выявляли антитела к T.spiralis у экспериментально зараженных свиней разными дозами личинок паразитов (500 и 10000) с 26 по 80-й день инвазии.
Антигены оказались высоко специфичными, ложноположительные реакции отсутствовали. Аналогичные выводы в отношении экскреторно-секреторных и поверхностно-стихосомальных антигенов личинок трихинелл были сделаны Rapic et al. (1986); Yepez-Mulia et al. (1994); Smith, Snowdon (1987); Murrell etal.(1986). По своим диагностическим качествам соматический фракционированный антиген не уступал экскреторно-секреторному, он также успешно использовался в серологических реакциях и выявлял инвазированных трихинеллами животными. По своему антигенному составу он сопоставим с экскретами и секретами личинок трихинелл. Отдельные авторы отдают предпочтение именно соматическим антигенам (Ruitenberg et al„ 1974; VanKnapen et al., 1980; Kagan, 1976,1982; Полетаева и др., 1990,1994). Последующие наши исследования по физико-химической характеристике соматического фракционированного и экскреторно-секреторного антигенов методом электрофореза в ДСН-ПААГ показали значительное сходство в их белковом спектре. На электрофореграммах обоих антигенов полосы, представляющие белковые компоненты, различались по степени окраски. Так, в белковом спектре соматического фракционированного антигега регистрировали не менее пяти мажорных полос, проявленных в зоне белков молекулярной массы от 31 до 68 кДа. В то же время в белковом спектре экскреторно-секреторного антигена проявлялась одна мажорная полоса в зоне белков молекулярной массы 44 кДа, другие три компонента в зоне белков молекулярной массы 55 кДа, 10 кДа и 87,1 к Да были представлены в значительно меньших количествах, поскольку представляющие их полосы на электрофореграмме были окрашены слабее. Остальные полосы по степени проявления почти не отличались от общего фона. Полученные нами данные сопоставимы с результатами Zhang et al. (1994), которые обычным и одномерным Вестерн-блотингом в экскреторно- секреторных продуктах личинок T.spiralis с помощью поликлональных антител выявили три главные иммуногенные молекулы молекулярной массы 45 к Да, 53 к Да и 60 кДа.
