Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 15
1.1. Молекулярно-генетические факторы развития сенсоневральной тугоухости 16
1.1.1. Мутации гена коннексина 26 21
1.1.2. Мутации, предрасполагающие к проявлению аминогликозидных ототоксических реакций 30
1.1.2.1. Мутация A1555G в гене 12S рРНК митохондрий 30
1.1.2.2. Конституциональные особенности метаболизма ксенобиотиков 37
1.2. Общая патология нейро-эпителиальных элементов спирального органа 41
1.3. Дистрофические изменения, некроз и апоптоз в спиральном органе 49
1.4. Механизмы окислительного повреждения структур улитки 55
1.5. Современные направления развития отопротективной терапии 65
Глава II. Материалы и методы исследования 74
ILL Объекты клинического исследования 75
П.2. Аппаратурно-методическое обеспечение клинико- аудиологических исследований 77
II.3. Методы лабораторных исследований 83
П.4. Характеристика экспериментальных исследований и материала 94
Глава III. Результаты исследований 112
III. 1. Экспериментальные исследования 112
III. 1.1. Патоморфология сенсорного аппарата слухового анализатора 112
III. 1.2. Сравнительное исследование отопротективного потенциала препаратов различных фармакологических групп 162
Ш.2. Клинические исследования 174
Ш.2.1. Мутации гена GJB2 174
III.2.2. Мутация A1555G гена 12S рРНК митохондрий 180
Ш.2.3. Особенности реакции N-ацетилирования у пациентов с аминогликозидными ототоксическими осложнениями 183
Ш.2.4. Исследование аутопсийного материала улитки умерших, при жизни имевших контакт с отоповреждающими факторами 191
Ш.2.5. Сравнительное исследование отопротективных свойств Севитина и Цитофлавина 199
Обсуждение результатов 202
Заключение 259
Выводы 269
Практические рекомендации 270
Литература
- Мутации, предрасполагающие к проявлению аминогликозидных ототоксических реакций
- Дистрофические изменения, некроз и апоптоз в спиральном органе
- Аппаратурно-методическое обеспечение клинико- аудиологических исследований
- Сравнительное исследование отопротективного потенциала препаратов различных фармакологических групп
Введение к работе
Актуальность темы
Сенсоневральная тугоухость (СНТ) одна из сохраняющих актуальность проблем современной оториноларингологии. Это связано с рядом факторов, в том числе, с распространенностью агрессивных средовых условий существования человека (фонового окружающего и производственного шума), ростом числа хронических и острых заболеваний, в лечении которых используются ототоксические лекарственные препараты (туберкулез, муковисцидоз, злокачественные опухоли), использованием продуктов в пищевом рационе человека, содержащих токсические вещества, что способствует росту в популяции нейродегенеративных заболеваний (Forge A. et al., 20006). Определенную роль в увеличении частоты СНТ играет урбанизация населения, общая тенденция к увеличению продолжительности жизни и росту нейродегенеративных заболеваний. Известно, что сенсоневральный характер слуховой дисфункции среди детей до 1 года встречается в 0,1% случаев, к 45-60 годам встречается уже у 5-14%, после 65 лет - у 30%, а в возрасте 80 лет — более чем у 50% людей (Вартанян И.А., 1991; Воронкин В.Ф.и др.2001; Таварткиладзе Г.А. и др.2001; Morton N.E., 1991 ).
В последнем десятилетии научный прогресс в исследовании проблемы СНТ обязан разработке и внедрению в медицинскую практику биотехнологических методов молекулярной биологии. Благодаря им стало возможным открытие молекулярно-генетических факторов, определяющих наследственную природу нарушения слуха, понимание молекулярной патофизиологии тугоухости, а также разработка принципиально новых методов ее лечения и стратегии профилактики (Kikuchi Т. et al., 1995; Kelsell D.P. et al., 1997; Estivill X.et al., 1998; Antoniadi T. et al., 2001).
По данным G.E.Green at al. (2003) от 22 до 50% случаев хронической СНТ, манифестирующей в раннем детском возрасте обусловлена генетическими причинами. Изучение клинических случаев спорадической и семейной глубокой тугоухости позволило выявить специфические гены, мутации і которых облигатно с развитием утраты слуха (Denoyelle F. et al., 1997; Kelley
P.M. et al, 1998; Kelsell D.P. et al., 1997). Их спектр имеет этническую и популяционную специфичность (Morell RJ. et al., 1998; Oddoux С. et al., 1999; Sobe T. et al., 2000; Lucotte G. et al., 2005), что и определяет самостоятельную ценность их изучения в различных регионах России. Результаты такого рода исследований могут стать научной базой для разработки мероприятий по развитию национальной программы пре- и постнатальной диагностики и профилактики спонтанных наследственных, в первую очередь, доречевых вариантов тугоухости и глухоты.
Наследственный фактор актуален не только для спонтанно-развивающихся, но и для приобретенных фенотипов травматической и возрастной тугоухости (Bai U. et al., 1997; Peters U. et al., 2000; Prezant T.R. et al., 1993; Sha S.H. et al., 2001). Основная цель исследований в этом направлении - решение задачи первичной профилактики вариантов СНТ при конституционально-детерминированной повышенной чувствительности к шумовому и ототоксическому (аминогликозидные антибиотики, цисплатин ) повреждению, а также развитию пресбиакузиса.
По аналогии с осложнениями болезней внутренних органов (сердечной, дыхательной, почечной, печеночной недостаточностью), СНТ, по сути, клинико-патогенетически можно рассматривать как «слуховую недостаточность». Ее морфологический субстрат представлен от морфо-функциональных изменений до количественного дефицита сенсоневральных элементов на любом из уровней слухового анализатора, начиная от периферического участка - внутреннего уха - и заканчивая центральным отделом, представленным слуховой корой височной доли. При этом патология слухового анализатора, связанная с повреждением улитки, оказывается главенствующей среди причин снижения или утраты слуха (Альтман Я.А. и др., 2003).
Несмотря на давнюю историю изучения, сведения о патологической морфологии периферического звена слухового анализатора являются фрагментарными как с общепатологической точки зрения, так и в аспекте морфологических особенностей спирального органа (СО), связанных с гистогенетической спецификой улитки (Альтман Я.А. и др., 2003; Винников Я.А.и др., 1961; Карлсон Б., 1983; Плужников М.С. и др., 1966; Salt A.N. et al., 1988; Sha S.H. et. al., 2001; Sterkers O. et al., 1988). Изучение патологического субстрата CHT с этих позиций целесообразно для уточнения представлений о механизмах формирования тугоухости, а также обоснования стратегии как реабилитации при глубоких нарушениях слуха, так и отопротекции - защиты СО путем повышения неспецифической клеточной резистентности в условиях неблагоприятных для существования волосковых клеток (ВК) (Ни В.Н. et.al., 2002; Pirvola U. et al., 2000; Staecker H. et al., 2000; 2001; Torchinsky C. et al., 1999). В свою очередь разработка цельной клинической концепции отопротекции нуждается как в поиске новых, так и пересмотре арсенала уже известных ототропных фармакологических средств конкретно для целей сурдологии, исходя из современных представлений о молекулярном патогенезе прогрессии тугоухости и о возможных механизмах отопротективного воздействия.
Цель работы
Изучить молекулярно-генетические и структурные особенности этиопатогенеза сенсоневральной тугоухости, обозначить новые патогенетические направления ее фармакологической коррекции и профилактики.
Задачи исследования
1. Оценить вклад наследственных факторов в распространенность спорадической прелингвальной и индуцированной (ототоксической аминогликозидной) СНТ для популяции Санкт-Петербурга и Северо-Западного региона России. Для этого изучить распространенность рецессивных мутаций нуклеарного гена коннексина 26 и мутации A1555G в 8 гене 12S рРНК митохондрий.
2. Проанализировать особенности реакции N-ацетилирования у пациентов с ототоксической аминогликозидной СНТ.
3. На материале экспериментальных моделей сенсоневрального повреждения слухового анализатора провести патоморфологический анализ состояния ВК с учетом условий повреждения и гистогенетической специфики СО.
4. На аутопсийном материале исследовать морфологию СО в условиях патологических состояний, патогенетически связанных с формированием СНТ.
5. Сравнить слухосохраняющие свойства препаратов, предлагаемых в качестве неспецифических отопротекторов с учетом патогенетических особенностей формирования и прогрессии СНТ (блокаторы ионов Са , NMDA-рецепторов, антиоксиданты, субстраты митохондриального метаболизма, олигопептиды).
6. Оценить слухосохраняющий потенциал лекарственных препаратов Севитин (L-карнозин) и Цитофлавин (комплексный препарат на основе янтарной кислоты) у больных с хронической СНТ.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
1. Наследственная мутация 35delG гена коннексина-26 является преобладающим конституционально-детерминированным фактором развития спорадических случаев рецессивной прелингвальной СНТ. Мутация 35delG в гене GJB2 встречается у больных доречевой СНТ в Северо-Западной части России с частотой, сопоставимой с частотой в других европейских популяциях.
2. Развитие аминогликозидных ототоксических реакций патогенетически определяется рядом индивидуальных конституционально-детерминированных особенностей метаболических реакций. Ототоксические реакции при применении АА возникают преимущественно у лиц с медленным типом N-ацетилирования.
3. Характер и выраженность патоморфологических изменений в спиральном канале зависят от интенсивности и природы повреждающего воздействия. Наиболее уязвимым звеном СО являются наружные волосковые клетки, повреждение которых при остром (акустическом) воздействии проявляется преимущественно дистрофией, при подостром (аминогликозидная ототоксичность) — доминированием некротических изменений, при хроническом (эндогенная интоксикация) - процессами апоптоза.
4. Повреждение структур спирального канала как у экспериментальных животных, так и у человека имеет свои морфологические особенности, формирование которых определяется внутриорганной спецификой перепончатой улитки.
5. В условиях экспериментальной акустической травмы янтарная кислота оказывает отопротективный эффект на уровне центрального звена, в то время как L-карнозин - и на центральном, и на периферическом звене слухового анализатора.
6. В клинической практике при хронической СНТ слухоулучшающий эффект Цитофлавина (препарата янтарной кислоты) переимущественно связан с улучшением речевой разборчивости, а Севитина (препарата L-карнозина) - с улучшением и разборчивости и функции тонального слуха.
Научная новизна исследования
Впервые среди слабослышащих на Северо-Западе России изучена распространенность рецессивных мутаций гена белка субъединицы межклеточных контактов коннексина 26 (GJB2) и мутации A1555G гена 12S рРНК митохондрий, для которых ранее уже показана связь с определенными вариантами наследственной СНТ у коренного населения в других странах и континентах (Denoyelle F.et al., 1997; Kelsell D.P. et al., 1997; Kelley P.M. et al., 1998; Fischel-Ghodsian N., 1999; Iwasaki S. et al., 2000; Lucotte G.et al., 2005). Впервые механизм аминогликозидных ототоксических реакций рассмотрен с позиций генетической предрасположенности, а именно конституционально-обусловленной активности реакции N-ацетилирования (одной из реакций системы детоксикации ксенобиотиков).
Научной новизной является изучение морфологических особенностей дистрофии, некроза и апоптоза ВК при сенсоневральном повреждении слухового анализатора в аспекте гистогенетической специфики СО.
Впервые исследован комплекс патоморфологических изменений структур перепончатой улитки в связи с природой отоповреждающего воздействия.
Новыми являются данные по сравнительной оценке отопротективного потенциала воздействия на различные механизмы развития окислительного стресса в возбудимых структурах. Впервые в эксперименте показаны отопротективные свойства антагонистов кальция (верапамила), антиоксидантов L-карнозина и янтарной кислоты. Клинико-экспериментально обоснована необходимость дифференцированного выбора отопротектора или слухоулучшающего средства в зависимости от ведущего звена (центрального или периферического) в прогрессии «слуховой недостаточности».
Научно-практическая значимость исследования
Результаты настоящего исследования имеют значение для дальнейшего развития представлений о патогенезе СНТ, решения медико-социальных задач лечения, а также первичной и вторичной профилактики хронической СНТ.
I. Обоснована необходимость молекулярно-генетического типирования рецессивных мутаций гена GJB2, поскольку среди жителей Северо-Западного региона спорадическая доречевая глухота при отсутствии в анамнезе перинатальной патологии более чем в 70% случаев определяется генетическим дефектом белка коннексина 26, а распространенность носительства наиболее частой мутации этого гена - 35delG - в популяции здоровых составляет 5,5% (!).
Выявление низкой N-ацетилирующей активности может рассматриваться как конституционально - неспецифическое условие, которое относит пациента к группе риска развития аминогликозидных ототоксических осложнений.
Выявление носительства мутации A1555G в гене 12S рРНК митохондрий перед проведением аминогликозидной терапии позволит избежать развития ототоксических аминогликозидных осложнений.
Сведения о распространенности наследственных мутаций, определяющих развитие спонтанных и приобретенных форм СНТ могут служить основой для медико-генетического консультирования, разработки принципов первичной профилактики, установления диагноза, лечебных и реабилитационных мероприятий.
II. Обоснована необходимость дифференцированного подхода к назначению ототропных фармакологических препаратов с целью вторичной профилактики СНТ в зависимости от локализации очага преимущественной прогрессии тугоухости, характера течения и пр.
Отечественные препараты Севитин (L-карнозин) и Цитофлавин (комплексный препарат янтарной кислоты) могут рекомендоваться как препараты выбора для слухоулучшающей и отопротективной терапии у пациентов с СНТ.
III. Анализируя морфологический материал перепончатой улитки при воспроизведении экспериментальных моделей сенсоневрального повреждения следует учитывать, что изменения в спиральном канале являются маркером интенсивности повреждающего воздействия. Первоначальным реактивным изменением нейроэпителия является морфо-функциональный феномен «пульсации» ядер волосковых клеток, соответствующий стадии дистрофии клетки. Некроз ВК - итог повреждающего воздействия, имеющего высокотравматичный характер. Отдаленным результатом острого отоповреждающего воздействия при интенсивностях воздействия, не затрагивающих целостность мембранных структур перепончатой улитки, является либо коагуляционный некроз с длительной сохранностью мумифицированных останков, либо апоптоз ВК. Обнаружение апоптотического характера гибели клеток СО указывает на хроническое воздействие отоповреждающего фактора низкой интенсивности. Выявление фиброза спирального канала является ретроспективным морфологическим свидетельством эпизода повреждающего воздействия с разрушением мембранных структур перепончатого лабиринта.
Внедрение результатов.
Результаты проведенного исследования используются в учебной программе: при проведении лекций и практических занятий со студентами V курса на цикле «оториноларингология», в циклах лекций на элективных курсах «оториноларингология-сурдология» (раздел «Сенсоневральная тугоухость») и «молекулярная генетика» (раздел «Наследственная патология органа слуха») в СПбГМУ им.акад. И.П.Павлова, представлены для широкой аудитории в виде лекции в журнале «Архив патологии» (2004, №1), в монографии коллектива авторов «Фармакотерапевтический справочник сурдолога-оториноларинголога»; в лечебной работе сурдокабинета клиник и лаборатории слуха и речи НИЦ, ЛОР-отделения поликлиники №31 г. Санкт-Петербурга (для дифференцированного подбора слухоулучшающей терапии); в диагностической работе лаборатории слуха и речи, отдела молекулярно-генетических технологий НИЦ, Медико-генетического центра г.Санкт-Петербург, СПб института раннего вмешательства (при диагностике генетических форм врожденной глухоты), отделения клинической генетики болезней органов дыхания Института пульмонологии СПбГМУ им. И.П.Павлова, Детских городских больниц №3 и №4 г.Санкт-Петербурга, противотуберкулезного диспансера г.Пушкин (для диагностики наследственных условий предрасположенности к формированию ототоксической аминогликозидной тугоухости).
Апробация работы
Материалы диссертации обсуждены на научных заседаниях лаборатории слуха и речи НИЦ СПГМУ им. И.П.Павлова, совместной проблемной комиссии «Гигиена и организация здравоохранения» (2002-2004, г. С.-Петербург),
представлялись на 51-ой Всероссийской конференции молодых ученых-оториноларингологов и логопатологов (февраль 2004, г. С.-Петербург), Российском национальном конгрессе «Человек и его здоровье» (26-29 ноября 2002, г. Санкт-Петербург), Российской конференции оториноларингологов «Современные проблемы заболеваний верхних дыхательных путей и уха» (19-20 ноября 2002, г. Москва), на заседании расширенного Президиума Российского общества аудиологов (2-4 декабря 2002, г. Суздаль), на Всероссийской научно-практической конференции «Проблема реабилитации в оториноларингологии» (15-16 мая 2003, г. Самара), на Конференции, посвященной памяти проф. Б.М. Сагаловича «Актуальные вопросы аудиологии, сурдологии и слухопротезировавния (1-2 октября 2003, г.Санкт-Петербург), на XI Конференции Украинского научного общества оториноларингологов «Современные технологии диагностики и лечения заболеваний верхних дыхательных путей и уха» (12-14 мая 2004, г. Киев), на I Национальном конгрессе аудиологов (7-11 июня 2004 г. Суздаль), на итоговой научной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины — 2004» (26 апреля 2004, г. Санкт-Петербург), in European Human Genetics Conference (12-15 June 2004, Munich, Germany; 7-10 May 2005, Prague, Czech Republic), на 7-ом Международном симпозиуме «Шум и вибрация на транспорте» (8-10 июня 2004, г.Санкт-Петербург), на III Российской научно-практической конференции «Наука и практика в оториноларингологии» (16-17 ноября 2004, г.Москва), на заседании СПб научного общества аудиологов (3 февраля 2005, г.Санкт-Петербург), на научно-практической конференции с международным участием «Современные вопросы диагностики и реабилитации больных с тугоухостью и глухотой» (27 февраля-2 марта 2006, г.Суздаль).
Публикации
По материалам диссертации издана 1 монография (в соавторстве), опубликовано в изданиях, рекомендуемых ВАК МО РФ для публикаций статей, содержащих материалы диссертации, 16 статей, в прочих изданиях - 5 статей и 10 тезисов в материалах научно-практических конференций и симпозиумов.
Объем и структура диссертации
Рукопись диссертации представлена традиционным способом на 300 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, глав «Материалы и методы исследования», «Результаты исследований», «Обсуждение результатов исследования», заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографии. Работа содержит 45 таблиц, 94 рисунка и микрофотографий, 3 схемы. Список литературы включает 531 источник, из них - 184 работы отечественных авторов, 347 - зарубежных.
Диссертация выполнена в рамках плана научных исследований по отраслевой программе МЗ РФ лаборатории слуха и речи НИЦ СПбГМУ им. И.П.Павлова (N гос.регистрации 01.960.012178).
Исследование было поддержано грантами Администрации г. Санкт-Петербург для молодых кандидатов наук ВУЗов Санкт-Петербурга № PD 02-1.0-40 (2002г.), PD 03.-4.0-141 (2003 г.), PD 04-4.0-174 (2004 г.), PD 05-4.0-169 (2005).
Мутации, предрасполагающие к проявлению аминогликозидных ототоксических реакций
Впервые о "митохондриальном" типе наследования нарушений слуха стали говорить после открытия в 1992 году митохондриального фактора несиндромной формы постлингвальной детской тугоухости, передающейся по материнской линии (Jaber L. et al., 1992). Позднее стали известны и другие мутации в митохондриальном геноме, определяющие развитие «беспричинной» утраты слуха у взрослых (Estivill X. et al., 1998; Iwasaki S. et al., 2000; Reardon W. et al., 1995; Usami S. et al., 2000), среди которых наиболее изучена мутация A1555G в гене 12S рРНК мтДНК (Fischel-Ghodsian N. et al., 1993, 1999, 2003; Iwasaki S. et al., 2000). Эта мутация является причиной формирования фенотипа приобретенной СНТ в условиях воздействия различных внешних отопатогенных факторов, таких как шум, вирусные инфекции, стресс, ототоксичные лекарственные препараты (Iwasaki S. et al., 2000) или при сочетании с определенными полиморфизмами или мутациями нуклеарных генов (см. Гл. выше) (Abe S. et al., 2001).
В матриксе каждой митохондрии (Мт) содержится от 2 до 10 копий митохондриальной ДНК. МтДНК во многом отличается от нуклеарной: имеет кольцевую форму, сравнительно мала (состоит из 16569 пар нуклеотидов) и представлена генами 13 матричных, 2 рибосомальных и 22 транспортных РНК (Льюин Б., 1987) (рис.7), которые кодируют элементы митохондриальной протеинсинтезирующей системы, участвующей в окислительном фосфорилировании. Особенностью мтДНК по сравнению с нуклеарной является повышенная подверженность повреждениям, поскольку, во-первых, содержит значительно больше компактной информации, так как не имеет интронов и длинных некодирующих последовательностей. Во-вторых, в структуре мтДНК отсутствуют гистоновые белки, выполняющие в нуклеарной ДНК, кроме прочего, защитную функцию. В-третьих, в митохондриях отсутствует система репарации ДНК (Льюин Б., 1987; Allen J.A. etal., 1980).
Повреждение ДНК митохондрий происходит по свободнорадикальному механизму. Потребляя свыше 90% поступающего в клетку кислорода, митохондрии имеют больше шансов получить повреждение активными формами кислорода, накапливающимися в митохондриальном матриксе. Эти особенности мтДНК делают ее крайне подверженной воздействию мутагенных факторов. «Слабые звенья» в структуре и функционировании мтДНК определяют возникновение и кумуляцию в митохондриях различных приобретенных мутаций в результате спонтанного мутагенеза, возникающего в момент репликации или при повреждении мтДНК в условиях патологического некомпенсируемого роста продукции свободных радикалов (окислительного стресса) (см.Гл. 1.4).
Количество приобретенных мутаций положительно коррелирует с возрастом, то есть с увеличением длительности действия патогенного фактора, и чаще встречается среди неделящихся клеточных популяций. По сути, речь идет о приобретенной гетероплазмии - возникновении, существовании и, возможно, росте клеточного клона с теми или иными приобретенными генетическими дефектами. При этом клиническая картина митохондриальной патологии начинает формироваться при достижении в конкретной клеточной популяции критического числа клеток с мутационным грузом или критического числа митохондрий с мутациями в одной клетке. Для каждой тканевой популяции это свой определенный уровень измененных клеток (Ensink R.J.H. et al., 1998; http://www.mitomap.org). Такое прогрессирующее с возрастом накопление в клетке мутантных копий митохондриальных ДНК называют репликативной сегрегацией (Reardon W. et al., 1995). Последняя в частности, как полагают, является молекулярным базисом развития пресбиакузиса (Fischel-Ghodsian N. et al., 2003). Наиболее изученным фенотипом нарушения слуха при A1555G является тугоухость вследствие повышенной чувствительности к ототоксическим эффектам аминогликозидных антибиотиков (АА). Сайт мутации затрагивает высококонсервативный регион ДНК для различных организмов - от бактерий до человека (Neefs J.M. et al., 1991) - и отвечающий за кодирование генетической информации о малой субъединице рибосом. У человека структура гена 12S рРНК мтДНК гомологична подобным генам бактерий и дрожжей, отличаясь только нуклеотидом в положении 1555 (Li X. et al., 2002) (рис.8).
Таким образом, в результате мутации A1555G образуются конформационные перестройки молекулы рРНК, резко увеличивающие аффинность молекул АА к 12S субъединице рРНК человеческой митохондрии. Последняя при этом превращается в прямую мишень для действия антибиотика (Li X. et al., 2002; Prezant T.R. et al., 1993). Поскольку эпителиальные образования улитки (волосковый нейроэпителий, поддерживающие эпителиоциты и клетки сосудистой полоски) являются структурами с чрезвычайно высокой метаболической активностью (Sha S.H. et al., 2001), дефект в синтезе митохондриальных протеинов у человека приводит к их гибели, вследствие фатального дефицита синтеза энергии в митохондриях на этапе процесса трансляции, подобного тому, который определяет бактерицидный эффект АА у аминогликозид-чувствительных бактерий и дрожжей (Li X. et al., 2002; Tono Т. et al., 2001). При этом носительство A1555G вне аминогликозидного фактора является латентным.
Особенность мутации A1555G, как и любой другой митохондриальной мутации, в том, что она может встречаться как в гомоплазмическом (быть представленной во всех клетках организма), так и в гетероплазмическом варианте (мутация по-разному представлена как среди различных тканей организма, так и среди клеток одной гисто-генетической популяции) (Ensink R.J.H. et al., 1998; Takahashi К. et al., 2003). В последнем случае клиническая выраженность симптомов зависит от пропорции нормальных и мутантных копий ДНК митохондрий в ткани или клетке. Так, пациенты с числом мутантных копий до 20% имеют либо интактный слух, либо мягкую степень тугоухости. В тоже время гетероплазмические пациенты с числом мутантных копий более чем 52% имеют глубокую степень тугоухости (Del Castillo E.J. et al, 2003).
Интересной особенностью является градиент мутации A1555G в ряду поколений одной семьи - переход от гетероплазмии к гомоплазмии на протяжении, в частности, трех генераций (Ballana Е. et al, 2005).
Классической особенностью ототоксических реакций при мутации A1555G является развитие глубокой тугоухости непосредственно после первых же введений терапевтических доз АА. Подобные случаи тугоухости неоднократно описаны в больших семьях коренных жителей Африки, Китая, Израиля, Японии, Монголии, Испании, Италии, Северной Америки, Кубы, Индонезии, Турции и других стран, в которых на протяжении последних поколений (с момента начала применения АА) несколько членов по материнской линии имели глухоту после применения аминогликозидных антибиотиков, как правило, связанного с лечением туберкулеза легких (Hutchin Т. et al, 1993; Pandya A. et al, 1997; Abe S. et al, 1998; Estivill X. et al, 1998; Tekin M. et al, 2003).
Дистрофические изменения, некроз и апоптоз в спиральном органе
Зернистая дистрофия является первоначальной и еще обратимой «стандартной типовой клеточной реакцией» (Серов В.В., 1991) в ответ на внешнее раздражение - как физиологический стимул, так и повреждающее воздействие. На специфическом для СО гистологическом объекте плоскостном препарате - одним из проявлений дистрофии ВК является умеренное увеличение объема ядер ВК - частный случай, так называемого, «феномена пульсации клеточного ядра» (Хесин Я.Е., 1967).
Экспозиция интенсивных повреждающих факторов приводит к развитию более глубоких изменений, являющихся предшественниками некроза (Струков А.И. и др., 1990). Причинами возникновения некроза СО являются грубые высокоинтенсивные воздействия, вызывающие повреждение целостности макроструктуры улитки или следствия фатальных нарушений кровообращения (Васильев Н.А., 1968; Сакалинскас М.А. и др., 1971; Аничин В.Ф., 1972; Покотиленко А.К. и др., 1987; Глазников Л.А. и др., 1996). Частным примером ототоксического некроза СО является обсуждаемое ранее (см. Гл. 1.1.2), быстрое снижение слуха, вплоть до глухоты, у субъектов с генетически-детерминированной повышенной чувствительностью к ототоксическим свойствам АА, связанной с наследственной мутацией митохондриальной ДНК - A1555G в гене 12S рРНК, фатально лимитирующей внутриклеточную энергетику.
Учитывая условия возникновения, некроз захватывает, как правило, все тканевые структуры улитки. На плоскостных препаратах СО некроз нейроэпителия имеет картину тотальной дегенерации ВК на протяжении всей спирали или на значительных ее участках в виде кариопикноза, кариолизиса ядер ВК, слущивания слоев эпителия СО (чувствительных и поддерживающих клеток) (Аничин В.Ф., 1972; Покотиленко А.К. и др., 1987).
Морфологические особенности повреждения при некрозе СО давно известны и достаточно подробно описаны. При этом другой вариант гибели — апоптоз - для ВК во многом остается еще неизученным.
Термин «апоптоз» происходит от греческого apoptosis, что в переводе - «отпадение» (сбрасывание листьев). Традиционно апоптозом называют особую форму гибели клетки, связанную с генетически управляемым процессом ее самоустранения, для которого необходимы:
А) условия сохранности внутриклеточного энергетического синтеза, обеспечивающего адекватное количество АТФ для инициации синтеза «белков смерти» (Leist M.et al., 1997);
Б) условия активации и транскрипции определенных «генов смерти», белковые продукты которых выполняют триггерную и трансмиттерную функцию.
По образному представлению профессора В.П. Скулачева (1996) «для клетки апоптоз - деликатный способ уйти из жизни, когда она сделала свое дело. При этом клетка аккуратно и поэтапно разбирает саму себя на составляющие ее молекулы, которые затем могут использоваться другими клетками того же организма. Это не имеет ничего общего с некрозом — непреднамеренной гибелью клетки, которая оборачивается бедой не только для нее самой, но и для живого микроокружения. В противоположность апоптозу, некроз не контролируется регуляторными системами клетки, что приводит к хаосу метаболических процессов и ничем не ограниченному «разгулу» литических ферментов».
В отличии от некроза, апоптоз является широко распространенным в естественных условиях физиологическим противовесом клеточной пролиферации, механизмом устранения живых, но уже утративших свою функцию клеток при инволютивных процессах, гормональных перестройках (табл. 4) (Новиков B.C., 1996; Лушников Е.Ф. и др., 2001). Апоптозом «выбраковывается» клеточный пул, инфицированный вирусом, а также ставший продуцентом токсичных продуктов одноэлектронного восстановления кислорода - некомпенсируемого роста АФК.
Физиологический апоптоз запускается специфическими внешними рецепторными стимулами. В то же время при определенных патогенных ситуациях внутриклеточные повреждения становятся неспецифическими триггерами апоптоза. Природа подобных патологических факторов может быть аналогична тем, которые вызывают и некроз, с одной лишь особенностью - их интенсивность при апоптозе менее выражена, поскольку в противном случае возникает насильственная смерть (Лушников Е.Ф. и др., 1987; 2001; Новиков B.C., 1996).
Так, в частности, при высоких концентрациях АА (120-400 мг/кг.сут ) вводимых парентерально или особенно местно - интратимпанально, наблюдается мгновенная тотальная гибель СО - некроз как результат грубого и интенсивного повреждения, связанный с прямым токсическим действием (Плужников М.С., 1972). В то же время, при применении АА в значительно меньших - терапевтических дозах, - изолированное повреждение ВК, наблюдающееся на фоне сохранного микроокружения нейроэпителия, является следствием особого варианта гибели ВК - апоптоза (Johnson L.G. et. al., 1984; Lenner Н.Р. et al., 1986; Luo D., 1990; Usami S. et al.,1997; Vago P. et al., 1998; Forge A. et al., 2000). Можно ожидать, что клинической картиной СНТ, соответствующей гибели ВК СО по механизму апоптоза, является:
Аппаратурно-методическое обеспечение клинико- аудиологических исследований
Основной задачей данного раздела работы являлось: 1) установление генеза, топики и степени тугоухости у обследуемых больных; 2) оценка эффективности проводимого лечения.
Для установления генеза и топики слуховых расстройств (на уровне кондуктивного, сенсоневрального, ретролабиринтного поражения слуховой системы) применялись общепризнанные диагностические аудиологические тесты: тональная «пороговая» аудиометрия, специальные, в основном, «надпороговые» тесты, импедансная и речевая аудиометрия, шумометрия.
Все психоакустические (аудиометрические) исследования были по возможности стандартизированы, то есть проводились в одно и то же время дня, в относительно заглушённой камере, с общим уровнем окружающего шума не выше 32-34 дБ (данные усредненных измерений). Калибровка нулевого уровня аудиометра осуществлялась по стандарту ISO-64. Контакт с больным осуществлялся с помощью световой сигнализации. Врач находился в камере с испытуемым.
Тональная «пороговая» аудиометрия
Аппаратура. Клинический аудиометр МА-31 (Granert Praecitronic, Германия) с электродинамичесими телефонами TD-39 или MAICO МА 53 (Германия).
Методика исследований. Пороги слышимости устанавливались методом «границ» (Кравков СВ., 1946;) в диапазоне 125-8000 Гц по воздушной проводимости и 250 - 4000 Гц по костно-тканевой, по «восходящей» методике (Лопотко А.И. и др., 1986). Порогом слышимости считали интенсивность звука в дБ, получаемую как среднее арифметическое 3-х исследований на каждой частоте. Данные представлялись в виде тональной аудиограммы до и после прохождения курса лечения.
При односторонней или асимметричной тугоухости, с разницей порогов по воздуху на речевых частотах 40 дБ для исключения переслушивания другим ухом использовался широкополосный маскирующий «белый» шум. При исследовании костного звукопроведения заглушение лучше слышащего уха производили при разнице порогов 20дБ. Специальные тесты тональной аудиометрии.
Аппаратура. Клинический аудиометр МА-31 (Granert Praecitronic, Германия) с электродинамическими телефонами TD-39.
В данную группу тестов включались методики по выявлению феномена ускоренного нарастания громкости (ФУНТ, recruitment of loudness) и тест пороговой адаптации (tone decay - test).
Из методик по выявлению ФУНТ, являющегося патогномоничным для поражения нейроэпителиальных структур спирального органа (Luscher Е. et al., 1948; Hood J.D. et al., 1966; Лопотко А.И. и др., 1974; 1986), использованы три теста: а) установление дифференциальных порогов восприятия силы звука (ДПС) по Е. Luscher (1948); б) определение динамического диапазона громкости (ДДГ) (Hood J.D. et al., 1966; Лопотко А.И. и др., 1974); Ь) методика акустической рефлексометрии.
Величина ДПС определялась при интенсивностях 20 и 40дБ относительно порога слышимости больного. Вначале для сравнения больному предъявляли немодулированный, а затем модулируемый звук, при частоте модуляции 2 Гц и глубине от 6 до 0,2 дБ. Глубина модуляции менялась ступенчато с приращением 0,2 дБ. Предъявляемый сигнал длился 2-4 секунды. Перед очередным переключением глубины модуляции делалась пауза 5-10 сек. Минимальное значение глубины модуляции, при которой пациент воспринимал звук как немодулируемый, определяло значение дифференциального порога силы звука. Результаты оценивались по следующему принципу: 1) ФУНТ не выявлялся в случае, если полученные величины лежали в пределах 0,6-2,0 дБ; 2) ФУНТ выявлялся, если получаемые величины были 0,4 дБ.
Определение величины динамического диапазона громкости Определение динамического диапазона громкости (ДДГ) и уровня дискомфортной громкости проводят для диагностики сенсоневральных форм тугоухости, сопровождающихся ФУНГ ом. При четком инструктировании пациента определялся уровень дискомфортной громкости, за который принимали интенсивность звука, воспринимаемую как ощущение чрезмерной громкости, дальнейшее усиление которой является неприятным для больного (Лопотко А.И. и др., 1974). Разница (дБ) между уровнем дискомфортной громкости и порогом восприятия звука на данной частоте составляла ДДГ. В норме на речевых частотах ДДГ составляет 60-90дБ. Сужение ДДГ до 40дБ и менее указывает на наличие ФУНГ а (Сагалович Б.М. и др., 1974; Лопотко А.И. идр.,1974; 1986;).
Сравнительное исследование отопротективного потенциала препаратов различных фармакологических групп
Критериями верификации состояния ХПН являлись морфологическая картина изменений в почках (рис.57), изменения систолического артериального давления, измеряемого кровавым способом, а также, содержание гемоглобина и креатинина крови (табл.14).
При анализе гистологических препаратов почек оперированных животных отмечались следующие морфологические изменения диффузного характера. В просветах боуменовых клубочков и проксимальных канальцев наблюдался нерезорбированный белок, нередко в значительном количестве. Для большинства клубочков было характерным увеличение содержания межуточной ткани. Часть клубочков находилась в состоянии коллапса. Эпителий проксимальных канальцев почти повсеместно был набухшим, местами столь значительно, что просвет канальца не всегда определялся. В просвете некоторых дистальных канальцев выявлялись белковые цилиндры. В строме наблюдались инфильтраты из лимфоцитов и гистиоцитов, преимущественно располагавшиеся периваскулярно.
Подобная патоморфологическая картина указывает, что к 6-ому месяцу после операции нефрэктомии в оставшейся почке после электрокоагуляции формируются изменения, соответствующие морфологическим критериям тубуло-интерстициального нефрита {Серов В.В. и др., 1983). На этом фоне динамика нарастания уровня креатинина в сыворотке крови, снижение гемоглобина и повышение систолического артериального давления были расценены как гем один амические и лабораторные изменения, свойственные развивающейся почечной недостаточности в условиях стойкой депривации почечной функции.
В момент окончания эксперимента к концу 6-ого месяца после операции рефлекс Ргеуег а у животных не изменялся, показатели амплитуды ОАЭ также мало отличались от таковых до начала эксперимента.
При препарировании височных костей животных экспериментальной группы в 6 из 24 случаев ушей наблюдалась картина хронического гнойного отита. Материал таких улиток далее не обрабатывался. В остальных случаях состояние среднего уха оперированных животных макроскопически не имело отличий от контрольных животных.
В условиях модели хронических системных метаболических нарушений из-за стойкой депривации почечной функции повреждение СО затрагивало практически все завитки улитки, однако с преимущественной выраженностью в проксимальной части СО (основной завиток и первые две трети среднего завитка) (рис.58).
На плоскостных препаратах основных завитков улитки всех оперированных животных НВК имели полиморфное состояние ядер. Часть -с гиперхромными, уменьшенными ядрами, вплоть до пикноза. Часть НВК без грубых изменений ядер, однако с более светлой кариоплазмой и меньшей выраженностью кариоплазматической зернистости. Ядрышки четко определялись во всех ядрах гиперхромными, более крупными, чем у интактных животных, с преимущественно эктопическим расположением. В значительной части ядер ВК отмечалось расположение гетеро хроматин а у внутренней ядерной мембраны (рис.59), характерное для условий энергетического дефицита при гипоксии (Струков А.И. и др., 1990).
В условиях модели хронической дисметаболической патологии яркой особенностью патоморфологической картины СО являлись единичные ВК со своеобразной конденсацией материала ядра в форме полулуний (рис.60.). Подобные изменения ВК отмечались в проксимальной части СО, преимущественно в основном завитке, где клетки с ядрами в виде гиперхромных полулуний достигали 2-10% от всех ВК в одном поле зрения микроскопа. При этом в структуре СО у контрольных интактных животных подобная картина не наблюдалась.
Особенностью подобной гибели ВК также, как и при коагуляционном некрозе, является отсутствие признаков макрофагальной реакции.
Другой особенностью патоморфологической картины при экспериментальной ХПН являлась тотальная дегенерация НВК на достаточно протяженных участках СО - деструктуризация гетерохроматина, отек, деформация ядер, исчезновение ядрышек (рис.61, А).
Особенностью подобной гибели ВК также, как и при коагуляционном некрозе, является отсутствие признаков макрофагальной реакции.
Другой особенностью патоморфологической картины при экспериментальной ХПН являлась тотальная дегенерация НВК на достаточно протяженных участках СО - деструктуризация гетерохроматина, отек, деформация ядер, исчезновение ядрышек (рис.61, А).
Этап, отраженный на рис.61, А, кажется характерным для начала колликвационных процессов, в то же время его продолжение (рис.61, Б) демонстрирует коагуляционный механизм.
В условиях модели хронической СНТ чаще, чем при моделях острой СНТ (акустическая травма, аминогликозидное повреждение), встречались участки СО, где отсутствовали до 3-4 и более соседних НВК. Такие места чаще наблюдались в начале базального завитка улитки, где безъядерные зоны отмечались во всех трех рядах НВК, при этом чаще встречаясь в I ряду НВК. Для ВВК были характерны такие же изменения ядер, представленные, однако, в меньшей степени.
Таким образом, особенностями патоморфологической картины СО улиток животных в условиях модели ХПН являлось уменьшение клеточности популяции чувствительного волоскового нейроэпителия (преимущественно НВК), на фоне сохранных других структур спирального канала. Природа мозаичного характера подобных изменений определяется не грубым повреждением, вызывающим некроз, а дискретной гибелью наиболее уязвимой популяции ВК в условиях субпороговой эндогенной интоксикации
