Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 8
1.1 Изатин и его превращения 9
1.2 Реакция 12
1.3 Биологическая активность соединений с фрагментом хинолина 37
2. Химическая часть 42
2.1 Синтез замещенных 6-сульфамоилхинолин-4-карбоновых кислот и их производных 42
2.2 Синтез замещенных 2-оксо-6-сульфамоил-1,2-дигидро-хинолин-4-карбоновых кислот и их производных 54
2.3 Синтез замещенных 6-сульфамоилхинолин-3,4-дикарбоновых кислот и их производных 59
2.4. Биологическая активность 6-сульфамоилхинолин-4-карбоновых, 2-оксо-6-сульфамоил-1,2-дигидрохинолин-4-карбоновых кислот и 6-сульфамоилхинолин-3,4-дикарбоновых кислот и их производных 69
3. Экспериментальная часть 78
3.1 Исходные вещества, растворители 78
3.2 Методики синтеза 78
3.3 Антипротеазная (каспазная) активность синтезированных соединений 92
3.4 Методы аналитического контроля 93
3.5 Идентификация основных синтезированных прекурсоров
и целевых соединений 94
Выводы 106
Литература 108
- Биологическая активность соединений с фрагментом хинолина
- Синтез замещенных 2-оксо-6-сульфамоил-1,2-дигидро-хинолин-4-карбоновых кислот и их производных
- Биологическая активность 6-сульфамоилхинолин-4-карбоновых, 2-оксо-6-сульфамоил-1,2-дигидрохинолин-4-карбоновых кислот и 6-сульфамоилхинолин-3,4-дикарбоновых кислот и их производных
- Антипротеазная (каспазная) активность синтезированных соединений
Введение к работе
Разработка новых высокоэффективных биологически активных веществ вызывает неослабевающий интерес. Известно достаточно большое количество разнообразных лекарственных препаратов, в молекуле которых присутствует фрагмент хинолина. Хинолин-4-карбоновые кислоты и их производные представляют существенный интерес в плане синтеза биологически активных веществ, отсюда исследования по поиску новых высокоэффективных препаратов на этой основе интенсивно развиваются.
Наиболее эффективным методом синтеза указанных молекулярных систем, то есть построение скелета молекул с учетом дальнейшей функционали-зации, следует признать реакцию Пфитцингера и ее модификации. Данная реакция основана на доступных исходных соединениях - изатина и его замещенные аналогов с одной стороны и метиленкарбонильных соединений с другой, - и приводит к хинолин-4-карбоновым кислотам и их производным. Варьируя субстрат и реагент, можно синтезировать широкий круг различных хинолин- и 2-оксо-1,2-дигидрохинолин-4-карбоновых кислот, способных к дальнейшей функционализации.
Стоит проявить внимание к возможности введения сульфамидных функций в молекулярные системы хинолин- и 2-оксо-1,2-дигидрохинолин-4-карбоновых кислот, а также хинолин-3,4-дикарбоновых кислот, на одной из стадий; сведения о подобных молекулярных системах с сочетанием указанных функций в литературе ограничены. С точки зрения разработки высокоэффективных методов получения указанных классов соединений, особенно перспективной представляется возможность вовлечения в реакцию Пфитцингера с метиленактивными соединениями сульфо- и сульфанилзамещенных изатинов; сведения о подобных превращениях в литературе практически единичны.
Таким образом, учитывая высокий фармакологический потенциал 6-сульфанил-хинолин- и 2-оксо-1,2-дигидрохинолин-4-карбоновых, а также
хинолин-3,4-дикарбоновых кислот и их производных, актуальной задачей представлялось разработать эффективные методы синтеза этого класса соединений, создать комбинаторные библиотеки указанных молекулярных систем.
Важным и актуальным представляется оценка специфической физиологической активности этих соединений, позволяющей использовать их в качестве «молекулярных инструментов», а также активных лекарственных субстанций, селективно подавляющих программируемую клеточную смерть -апоптоз.
Работа выполнена в соответствии с планом научных исследовательских работ ООО «Исследовательский Институт Химического разнообразия» в период 2000-2005 гг. во исполнение программы «Биоскрининг активных веществ для создания готовых лекарственных средств и защиты растений» на базе ООО «Исследовательский Институт Химического Разнообразия» в рамках Федеральных целевых программ Министерства образования и науки РФ «Исследования и разработки по приоритетным направлениям науки и техники (2005-2006 годы) и «Развитие медицинской промышленности в 1998-2000 гг. и на период до 2005 года»
Цель работы
1. Разработка новых методов синтеза производных хинолин- и 2-оксо-1,2-
дигидрохинолин-4-карбоновых кислот в качестве биологически активных
веществ широкого спектра применения.
2. Синтез неизвестных ранее замещенных 2-оксо-6-сульфамоил-1,2-
дигидрохинолин-4-карбоновых кислот, 6-сульфамоилхинолин-4-карбоновых
и 6-сульфамоилхинолин-3,4-дикарбоновых кислот.
3. Создание комбинаторных библиотек разнообразных производных 2-
оксо-6-сульфамоил-1,2-дигидрохинолин-4-карбоновых кислот, 6-
сульфамоилхинолин-4-карбо-новых и 6-сульфамоилхинолин-3,4-
дикарбоновых кислот и подтверждение биологической активности представ
ленных молекулярных систем.
Научная новизна
Обнаружено необычное направление реакции Пфитцингера 5-сульфа-моилизатинов в водно-спиртовой щелочи с малоновым эфиром, приводящее к неизвестным ранее 6-сульфамоилхинолин-4-карбоновым кислотам.
Впервые на основе жидкофазного параллельного синтеза с использованием реакции Пфитцингера разработан способ получения неизвестных ранее замещенных 2-оксо-6-сульфамоил-1,2-дигидрохинолин-4-карбоновых кислот.
Впервые использованы в реакции Пфитцингера в качестве изатиновой компоненты коммерческие продукты - соль изатин-5-сульфокислоты и 3,3-дихлор-2-оксо-1,2-дигидро-1#-индол-5-сульфокислота, в результате чего стали легко доступными неизвестные ранее 2-замещенные 6-сульфохинолин-3,4-дикарбоновые кислоты.
На этой основе разработаны новые методы получения 6-сульфамоилхинолин-3,4-дикарбоновых кислот и 4-замещенных 8-сульфамоил-2,3-дигидро-1#-пирроло[3,4-с]-хинолин-1,3-дионов различных производных на этой основе.
Практическая значимость
В результате проведенных исследований стали легко доступными новые перспективные физиологически активные соединения, а именно, лекарственные препараты широкого спектра применения; патентоспособными являются эти соединения и методы их синтеза.
Обнаружен новый хемотип непептидных ингибиторов каспаз-3 - замещенные хинолинкарбоновые кислоты и их производные, обладающие физиологической активностью, в том числе специфической. Это позволяет использовать их в качестве «молекулярных инструментов», а также активных лекарственных субстанций, селективно подавляющих программируемую клеточную смерть (апоптоз).
Все синтезированные в ходе исследований целевые молекулярные системы протестированы на биологическую активность связи структура - in vitro ингибирующая каспазу-3-активность, найдены высокоэффективные ингибиторы каспазы-3, установлены наиболее перспективные для дальнейшей оптимизации лидеров сульфамоильные группировки.
Созданы комбинаторные библиотеки разнообразных производных хино-лин- и 2-хинолон-4-карбоновых кислот с подтверждением биологической активности представленных молекулярных систем.
Положения, выносимые на защиту
Новые замещенные 2-оксо-6-сульфамоил-1,2-дигидрохинолин-4-
карбоновые и 6-сульфамоилхинолин-3,4-дикарбоновые кислоты, 4-
замещенные 8-сульфамоил-2,3-дигидро-1Я-пирроло[3,4-с]хинолин-1,3-
дионы и способы их получения.
Необычное направление реакции Пфитцингера 5-сульфамоилизаинов в водно-спиртовой щелочной среде при образовании in situ этаналя, который выигрывает конкуренцию у диэтилмалоната, приводящее к неизвестным ранее 6-сульфамоилхинолин-4-карбоновым кислотам.
Использование в реакции Пфитцингера в качестве изатиновой компоненты соли изатин-5-сульфокислоты и 3,3-дихлор-2-оксо-1,2-дигидро-Ш-индол-5-сульфокислоты.
Комбинаторные библиотеки разнообразных производных 2-оксо-6-сульфамоил-1,2-дигидрохинолин-4-карбоновых кислот, б-сульфамоил-хинолин-4-карбоновых и 6-сульфамоилхинолин-3,4-дикарбоновых кислот с подтверждением биологической активности представленных молекулярных систем.
Биологическая активность соединений с фрагментом хинолина
Нельзя не отметить препарат класса амидов Х-4-КК: гидрохлорид N-(2-диэтиламидоэтил)амид-2-бутоксиХ-4-КК 1.143 или совкаин, применяемый как средство для спинномозговой анестезии.
Полученные реакцией Пфитцингера 2-арил-3-гидроксиХ-4-КК 1.46 (рис. 1.26) [96,97] заявлены как потенциальные иммунодепрессанты и антиаритмические препараты. Замещенные в ароматическом ядре 2-(пиридил)Х-4-КК 1.60 (рис. 1.32) предположительно проявляют антималярийную активность [98,108-110]. Na-Соль 2-(2-фторбифенил-4-ил)-6-фтор-Х-4-КК - DuP 785 -заявлен как противораковый препарат [177].
Кроме отмеченного нами совкаина 1.43, различные амиды Х-4-КК рекомендованы в качестве биологически активных веществ широкого спектра применения [178-182].
Описанный ранее метоксатин 1.86, синтезированный на основе диэтил-7,8-диметокси-6-метил-Х-2,4-диКК 1.85 [138,141], проявляет биологическую активность к дегидрогеназе. 1,3-Диоксо-2,3-дигидро1Н-пирроло[3,4-с]Х рекомендованы, как указано в патенте [183], в качестве цитотоксичных и CNS агентов, селективных агони-стов, антагонистов и инверсных агонистов для GABAA рецепторов.
Одна из приведенных ранее молекулярных систем 1.116, а именно 8-метил-Х-2-Он-4-КК, предложена в качестве регулятора роста растений [164]. Замещенные амиды Х--4-КК и Х-2-Он-4-КК (в которых, в числе самых разнообразных заместителей, представлены сульфамоильные группировки SO2NH2, S02NH-Py-2), как заявлено в патенте [184], являются антагонистами тахикининовых (Tachykinin NK2 and/or NK3) рецепторов и обладают широким спектром физиологической активности, позволяющей рассматривать их как потенциальные анальгетические, противовоспалительные, противоар-тритные, иммуномодулирующие препараты.
Алкилированные Х-2-Он-4-КК проявили себя как антагонисты сератони-на 5-НТ3, NMDA и ATi рецепторов [185]. Ряд Х-2-Он-6-сульфамидов показали нейропротекторную, противоинсультную и противоантираковую активность [186].
Таким образом, известно достаточно большое количество разнообразных лекарственных препаратов, в молекуле которых присутствует фрагмент хи-нолина. Х-4-КК и их производные (например, амиды) представляют существенный интерес в плане синтеза биологически активных веществ, и поиск новых высокоэффективных препаратов на этой основе интенсивно развивается. Наиболее эффективным методом синтеза указанных молекулярных систем, то есть построение скелета молекул с учетом дальнейшей функционали-зации, следует признать реакцию Пфитцингера и/или ее модификации. Стоит проявить внимание к сочетанию указанных функций и сульфамидных фрагментов в молекулярной системе Х-4-КК.
Так, кроме отмеченных выше, некоторые 6-сульфамоилхинолин-4-карбоновые кислоты и их производные, скажем, 2-фенил-6-сульфамоилХ-4-КК и 2-фенил-6-(2-пиридиламиносульфонил)Х-4-КК, были описаны в 1942 году в сообщении [187]. Известно также ограниченное число замещенных имидов Х-3,4-диКК (1,3-диоксо-1,3-ди-гидро-2#-пирроло[3,4-с]Х), в том числе обладающих ци-тотоксической активностью [144,155,188-190].
Одной из редких публикаций по вовлечению в реакцию Пфитцингера производного изатинсульфокислоты является работа [65]; в качестве субстрата выступает изатин-4-сульфокислый калий. Имеется лишь один пример реакции Пфитцингера, в которой в качестве изатиновой компоненты используется 5-(морфолино-4-сульфонил)изатин [191].
Учитывая высокий фармакологический потенциал 6 сульфамоилхинолин-4-карбоновых кислот и их производных, представляло интерес разработать методы синтеза широкого ряда данных соединений и их оценить их биологическую активность. 2. ХИМИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Определяющим направлением исследований, результаты которых представлены в данной работе, является использование реакции Пфитцингера в синтезе хинолин-4-карбоновых и хинолин-3,4-дикарбоновых кислот, а также 2-оксо-1,2-дигидрохинолин-4-карбоновых кислот, и их производных [192-205,207,208]. Главным фактором являлось введение в структуру целевых продуктов сульфамоильной группировки SO2NR R в сочетании с функцио-нализацией карбоксильных групп путем трансформации их в амидные CONR3R4 или сложноэфирные COOR4 в случае монокарбоновых и имидные (CO)2NR4 в случае дикарбоновых кислот. Сульфамидный фрагмент принято относить к «привилегированным фрагментам». Указанные молекулярные системы, таким образом, будут объединены общими структурными характеристиками и должны обладать определенным общими свойствами, здесь -определенными видами физиологической активности ввиду сочетания указанных функций и хинолиновой или хинолин-2-оновой основы молекулы.
Для решения поставленных задач использовали два стратегии синтеза. Первый путь заключался в вовлечении в реакцию Пфитцингера сульфамои-лизатинов, т. е. в формировании хинолинового фрагмента с заранее введенной в изатиновую компоненту сульфамоильной функцией. Второй путь предполагал построение скелета молекулы хинолина или хинолин-2-она с последующим сульфохлорированием и дальнейшей модификацией
Синтез замещенных 2-оксо-6-сульфамоил-1,2-дигидро-хинолин-4-карбоновых кислот и их производных
Первоначально предполагалось участие 5-сульфамоилизатинов общей формулы 2.4 в реакции с диэтилмалонатом CH2(C02Et)2, которая должна была привести к 2-оксо-1,2-дигидро-6-сульфамоил-Х-3,4-диКК 2.6 с их последующим декарбоксилированием и получением 2-оксо-1,2-дигидро-Х-4-КК 2.7, как это представлено на схеме:
В качестве условий проведения реакции были выбраны стандартные для реакции Пфитцингера условия: водно-спиртовый раствор КОН, нагревание.
Однако взаимодействие сульфамоилизатинов 2.4 с метиленкарбонильны-ми соединениями в щелочной водно-спиртовой среде имело свои особенности. Ожидаемая трансформация изатиновой компоненты 2.4 в замещенные 2-оксо-6-сульфамоил-1,2-дигидро-Х-4-КК 2.7 при введении диэтилмалоната не происходило. Основными продуктами являлись замещенные 6-сульфамоилХ 4-KK 2.5, образование которых - это результат реакции изатинов 2.4 с этана-лем МеСНО.
По методу А сульфамоилизатины 2.4 подвергали кипячению в водно-спиртовом (1:1, об.) растворе КОН (20 моль/моль 2.4) в течение 8-12 ч, после чего смесь подкисляли при охлаждении 1 N НС1 до рН 1. Целевые продукты выделяли экстракцией этилацетатом с последующей очисткой хроматогра-фированием на силикагеле или кристаллизацией с выходами около 40 %.
По данным ИКС, спектроскопии ЯМР Н и 13С, включая НМВС и HMQC-корреляции, было показано, что строение целевых продуктов соответствует формуле 2.5. По данным LCMS содержание основного вещества в целевых продуктах 2.5 составляло не менее 95 %.
Подтверждением образования именно 5-сульфамоилХ-4-КК 2.5 являлся встречный синтез или метод Б. Он заключался во взаимодействии субстратов 2.4 с этаналем (3.0 моль) в водном КОН (2.8 моль) с активацией реакционной массы микроволновым излучением (280 В, 2450 МГц) при 80 С в течение 15 мин. Выход продуктов реакции, идентифицированных как кислоты 2.5, был невысок и составил 15-30 %.
Сравнительные данные по синтезу этими методами представлены в таблице 2.1. Таблица 2.1 Результаты синтеза 5-сульфамоилхинолин-4-карбоновых кислот 2. Соеди нение Строение группы R N-SCfe Выход, % LCMS m/z (M+1) Содержание Метод А Метод Б основного вещества (УФ, 254 нм), % 2.5(1) 2.5(2) Et2N-S02 r"N-so2 41 40 15 30 309335 96 97 2.1.2.2 Механизм реакции С целью объяснения этих результатов и установления возможного механизма реакции были исследованы превращения субстрата 2.4 в водно-спиртовой среде в присутствии КОН с применением динамического LCMS-анализа реакционной массы и метода меченых атомов.
На основании анализа полученных данных мы полагаем, что механизм реакции образования 6-сульфамоилХ-4-КК 2.5 в данном случае можно представить схемой 2.3.
Для подтверждения постулируемого механизма превращений 5-сульфамоилизатинов 2.4 в водно-спиртовой щелочной среде использовали реагенты с меченым атомом углерода. Применение этанола, обогащенного С-изотопом, привело к образованию продуктов конденсации изатина с эта-налем - 6-(iV-R -N-R -сульфамоил)Х-4-КК 2.5, которые содержали метку С. С другой стороны, введение в реакционную массу меченого этим же изотопом диэтилмалоната 13CH2(C02Et)2 в присутствии этанола не вызывало обра-зования каких-либо продуктов, обогащенных С-изотопом.
Все указанные факты дают основания утверждать, что образующийся из этанола in situ этаналь в момент образования реагирует с аминокетокислотой 2.8, полностью выигрывая конкуренцию у другого вводимого в зону реакции метиленактивного соединения - диэтилмалоната. Очевидно, что электроно-акцепторная сульфамоильная группировка в положении 5 ароматического кольца изатина 2.4 (точнее, 5-положении изатовой кислоты 2.8) сильно активирует карбонильный атом углерода кетогруппы, дезактивируя, в свою очередь, аминогруппу в положении 1. Это и приводит к взаимодействию в начальный момент времени именно с молекулой этанола.
Логично предположить, что дальнейшие трансформации происходили in situ путем внутримолекулярной перегруппировки полуацеталя 2.9а без выхода из «клетки» молекулы этаналя. Этими же соображениями можно объяснить сравнительно низкий выход продуктов 2.5 при использовании этаналя в качестве реагента в традиционных для реакции Пфитцингера условиях.
Биологическая активность 6-сульфамоилхинолин-4-карбоновых, 2-оксо-6-сульфамоил-1,2-дигидрохинолин-4-карбоновых кислот и 6-сульфамоилхинолин-3,4-дикарбоновых кислот и их производных
Из общих соображений можно предположить, что в молекулярных системах 2.25 реакция нуклеофильного замещения при карбонильном атоме углерода протекала преимущественно в направлении образования амидокисло-ты 2.26а ввиду большей активации карбонильного атома углерода в положении 4 хинолинового фрагмента ввиду электроноакцепторного характера атома азота кольца. Соотношение количеств амидокислот 2.26а и 2.26Ь зависело также от донорно-акцепторного характера заместителя 2-R3.
Смесь амидокислот 2.26а и 2.26Ь без выделения из реакционной массы подвергались имидизации введением АсгО (75-80 моль) и выдержкой при 80С в течение 30 мин. Выходы целевых имидов Х-3,4-диКК {2-R3-4-R4-l,3-диоксо-1,3-дигидро-1#-пирроло[3,4-с]Х-8-(ЛЧ1 -N-R )сульфамидов} 2.27 составили 60-65 %.
По другому способу смесь эквимолярных количеств фуро[3,4-с]хинолин-1,3-дионов 2.25 и аминов R4NH2 кипятили 24 ч в толуоле с азеотропной отгонкой воды, после чего растворитель отгоняли в вакууме. Продукты экстрагировали дихлорметаном и выделяли обычными методами. После хромато-графирования на силикагеле (СНгСЬ, затем СНгСЬ-МеОН, 99:1, об.) имиды 2.27 выделены с выходами 11-78%.
Еще один вариант синтеза имидов 2.27 заключался в использовании 6-сульфамоилХ-3,4-диКК 2.24, которые подвергались действию CDI (2.2 моль) в JV-метилпирролидоне с последующим введением аминов R4NH2 и выдержкой в течение 1 ч при комнатной температуре, затем 2 ч при 80 С. После выделения и очистки известными способами соединения 2.27 были получены с выходами 45-92 %.
Другой подход к синтезу имидов 2.27 заключается в использовании коммерчески доступной Na-соли 2,3-диоксо-2,3-дигидро-1Я-индол-5 сульфокислоты (5-изатинсульфокислоты) 2.28 согласно схеме 2.14:
Прежде всего, на этой основе разработан способ получения 6-сульфоХ-3,4-диКК 2.29. Реакцию субстратов 2.28 с метиленактивным эфирами р-кетокислот R СОСНгСОгМе (2.8 моль) проводили в атмосфере азота в воде при 20 С в течение 12-24 ч в присутствии LiOH-H20 (11 моль). После под-кисления концентрированной НС1 до рН 5, отделения и сушки осадка, выходы 6-сульфоХ-3,4-диКК 2.29 составили 80-95%. Целевые продукты содержали по данным LCMS не менее 95% основного вещества.
Предложен альтернативный путь синтеза имидов 2.27 - на основе 6-сульфо-Х-3,4-диКК 2.29 синтезированы пиридиниевые соли сульфокислот (в сочетании с фрагментом ангидрида Х-диКК)2.30. Способ заключался в том, что диКК 2.29 в пиридине (10-12 моль) при введении Ас20 (15-20 моль) пре вращалась за 3 ч при 50-60 С в пиридиний 1,3-диоксо-1,3-дигидрофуро[3,4-с]-Х-6-сульфонаты 2.30 выделены после отделения осадка и промывания его ацетоном или эфиром с выходами 71-95%.Данные соединения кипятили 3-5 ч в АсОН с эквимолярными количествами первичных аминов R4NH2, в результате чего, после отгонки части растворителя в вакууме, выделяли Ру-соли имидосульфокислот 2.31 с выходами 75-97 %.
При кипячении этих соединений в сульфолане в присутствии РОСЬ (7.5 моль) с последующим высаживанием на лед выделяли сульфохлориды 2.32, выходы которых после очистки составили 55-85%. Соединения 2.32 раство-ряли в диоксане, и к полученному раствору добавляли амин R R NH (1.1 моль) и iV-метилморфолин в качестве основного катализатора (акцептора НС1). Реакционную массу нагревали при 60 С 3 ч, прибавляли воду, осадок отделяли, и, в случае необходимости, очищали кристаллизацией или флэш-хроматографией на силикагеле. В результате синтезирован ряд имидов 2.27 с выходами 35-95 %.
Еще одна модификация соединения 2.25 заключалась в синтезе на его основе имида 2.27 последовательными реакциями с 2-аминоэтанолом и обработкой полученной смеси амидокислот избытком Ас20 и имида 2.27Ь, полученного конденсацией имида 2.27а, (по типу кротоновой) с п трифторметилбензальдегидом в Ас20 в присутствии ZnCl2.
Продуктом этого превращения являлась 6-(1-морфолино)сульфонил-Х-2,3,4-триКК 2.33. Ангидридизацию с одновременным декарбоксилированием проводили действием избытка Ас20 аналогично описанному выше (п. 2.3.1), без выделения промежуточной дикислоты 2.34 причем единственным продуктом этой реакции являлся ангидрид 2.25 (R3=H).
Наиболее вероятным путем протекания этой реакции следует признать первоначальное декарбоксилирование с образованием Х-3,4-диКК 2.34, дегидратация которой приводила к ангидриду 2.25. Данное заключение следует из того, что декарбоксилирование в подобных молекулярных системах протекает уже при сравнительно низких температурах (50-60 С) [29], и наиболее активированной карбоксильной группой является таковая в положении 2. Она активирована акцепторными 1-атомом азота и 3,4-С02Н-группами сильнее, чем 4-карбоксильная.
По данным LCMS содержание основного вещества в целевых продуктах составляло не менее 95 %. Описание спектров ЯМР Н и LCMS соединении 2.27 представлены в п. 3.5 Экспериментальной части и Приложении.
Антипротеазная (каспазная) активность синтезированных соединений
Хлорид [2-[2-ацетилоксиэтил]-8-(морфолиносульфонил)-1,3 диоксо-2,3-дигидро-1#-пирроло[3,4-с]хинолин-4-ил]-сульфанил(амино)-метаниминия 2.40а. Смесь 117 мг (0.25 ммоль) соединения 2.39 и 23 мг (0.30 ммоль) тиомочевины в 3 мл пропанола-2 кипятили 30 мин, затем охлаждали. Образующийся осадок отфильтровывали, промывали пропанолом-2 и высушивали. Выход соединения 2.40а 95 мг (75 %).
Метил 2-[2-(2-ацетилоксиэтил)-8-(морфолиносульфонил)-1,3 диоксо-2,3-дигидро-1Я-пирроло[3,4-с]хинолин-4-ил]сульфанилацетат 2.40Ь. К смеси 374 мг (0,8 ммоль) соединения 2.39 и 95 мг (0,9 ммоль) ме-тилмеркаптоацетата в 10 мл диметоксиэтана прибавляли 600 мг карбоната цезия и перемешивали 1 ч, выливали в 50 мл ледяной воды, образующийся осадок отфильтровывали, промывали водой, перекристаллизовывали из метанола и высушивали. Выход соединения 2.40Ь 278 мг (65 %).
Метил 2-{2-[2-ацетилоксиэтил]-8-(морфолиносульфонил)-1,3 диоксо-2,3-дигидро-1//-пироло[3,4-с]хинолин-4-ил}-сульфинилацетат 2.40с. Смесь 107 мг (0,2 ммоль) соединения 2.40Ь и 115 мг (0,4 ммоль) 60 %-ной лі-хлорпербензойной кислоты в 2 мл хлористого метилена перемешивали 1 ч при 0 С, добавляли 4 мл воды, органический слой отделяли, водный слой дважды экстрагировали хлористым метиленом. Органические слои сушили сульфатом натрия и упаривали. Остаток очищали перекристаллизацией из пропанола-2. Выход соединения 2.40с 77 мг (70 %).
Метил 2-{2-[2-ацетилоксиэтил]-8-(морфолиносульфонил)-1,3 диоксо-2,3-дигидро-1Я-пирроло[3,4-с]хинолин-4-ил}-сульфонилацетат 2.40d. Смесь 107 мг (0,2 ммоль) соединения 2.40Ь, 173 мг (0,6 ммоль) % л/-хлорпербензойной кислоты в 2 мл хлористого метилена перемешивали 5 ч при комнатной температуре и 1,5 ч при 40 С. Смешивали с 4 мл воды, органический слой отделяли, а водный слой дважды экстрагировали хлористым метиленом. Объединенные органические слои сушили сульфатом натрия и упаривали. Остаток очищали перекристаллизацией из пропанола-2. Выход соединения 2.40d 64 мг (56 %).
Общий метод получения 2-(2-Ацетилоксиэтил)-4-амино-8 (морфолиносульфонил)-2,3-дигидро-2Я-пирроло[3,4-с]хинолин-1,3-дионов 2.41. Смесь (0,25 ммоль) соединения 2.39 и 0,50 ммоль амина в 3 мл пропанола-2 перемешивали 20 мин при 60 С, охлаждали и выливали в 10 мл воды. Образующийся осадок отфильтровывали, промывали водой, пропа-нолом-2 и высушивали. Выходы соединений 2.41 45-77 %.
Общий метод получения 2-(2-Ацетилоксиэтил)-4-арил(гетерил)-8 (морфолиносульфонил)-2,3-дигидро-2#-пирроло[3,4-с]хинолин-1,3-дионов 2.42 реакцией Судзуки. К раствору 245 мг (0,5 ммоль) соединения 2.39 в 5 мл диметоксиэтана прибавляли (0,55 ммоль) арил(гетерил)борной кислоты, (PPl PdCb (35 мг) и 3 мл насыщенного раствора карбоната натрия, кипятили 4 ч в атмосфере аргона при интенсивном перемешивании. Органический слой отделяли, смешивали с 3 мл уксусного ангидрида и 3 мл пиридина, кипятили 1 ч, охлаждали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали препаративной ТСХ (этилацетат) с последующей перекристаллизацией из пропанола-2. Выходы соединения 2.42 30-60%.
Составили фокусированную библиотеку, включающую известные анти-протеазные лиганды и все синтезированные соединения, частично представленные в приложении в таблицах ПІ, П2 и ПЗ.
Антипротеазная активность синтезированных соединений определялась на 9 сериновых протеазах (Каспазы 1-9), которые вовлечены в регуляцию программированной клеточной смерти (апоптоз) и воспалительных процес сов. Активность Каспаз определялась по скорости расщепления соответствующего субстрата представляющего собой пептид со специфичной для каждой используемой каспазы последовательностью аминокислот с присоединенной флуоресцентной группой (метилкумарин) [221]. Отщепление метил-кумарина от пептидной молекулы в результате протеолитической реакции фермента сопровождается усилением интенсивности флуоресценции, измерения которой производились с помощью флуоресцентного параллельного считывателя VICTOR V (PerkinElmer, USA) при длине волны возбуждения 355 нм и длине волны эмиссии 460 нм. Для проведения реакций использовались оптические 96-луночные микроплаты. Каспазы 1, 4, 5, 6 и 9 были приобретены у Calbiochem (USA); каспазы 2, 7 и 8 - у R&D Systems (USA) и кас-паза 3 была получена от UPSTATE (USA).
Большинство испытанных хинолинкарбоновых кислот и их производных показали высокую способность ингибирования каспаз с разной степенью селективности по отношению к другим каспазам, при этом в зависимости от структуры соединений значения IC50 колебались от единиц пМ до десятков тМ.
Антиапоптозная активность синтезированных соединений определялась на клеточной линии ЗТЗ полученной из АТСС (American Type Culture Collection) по методу описанному в [222]. Цитотоксичныи эффект соединений определялся с использованием стандартной методики описанной в [224].
Синтезированные соединения проявляли антиапоптозную активность в диапазоне концентраций от 1 нМ до 100 мкМ, в то же время, цитотоксичныи эффект активных соединений проявляется при концентрация 100 мкМ и выше.
