Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 9
1.1 Со-азолилалкановые кислоты и их производные 9
1.1.1. Получение co-азолилалкановых кислот и их сложных эфиров 9
1.1.2. Получение гидразидов 19
1.1.3.Синтезсо-(азол-1-ил)ацилгидразонов 23
1.1.4. Получение азолилацетанилидов 27
1.1.5. Получение N-гетероциклилацилпроизводных со-алкановых аминокислот ...31
1.2. Азолилалканолы и их производные 34
1.2.1. Синтез азолилалканолов 34
1.2.2. Получение азолилалкил-И-фенилкарбаматов 37
1.2.3. Получение азолилалкил-№фенилтиокарбаматов 38
1.3. Р-азолил-а-аминокислоты и их производные 39
1.3.1. Получение а-аминокислот, содержащих гетероциклы 39
1.4. Биологическая активность 47
ГЛАВА 2. Обсуждение результатов 65
2.1. Получение сложных эфиров со-азолилалкановых кислот 69
2.2. Синтез со-азолилалкановых кислот 71
2.2.1. Квантово химические расчеты взаимодействия у-бутиролактона с азолами и азолатами 74
2.3. Получение гидразидов со-(азол-1-ил)алкановых кислот 76
2.4. Изучение взаимодействия гидразидов со-(азол-1-ил)алкановых кислот с карбонильными соединениями 78
2.4.1. Квантово химические расчеты строения и энергетических характеристик азолилацетгидразонов 81
2.5. Исследование альтернативных методов получения ю-(азол-1-ил)алканамидов, разработка оптимального метода синтеза 83
2.6. Получение N-азолилацилпроизводных со-алкановых аминокислот 86
2.7. Получение азолилалканолов 88
2.8.СинтезО-[со-(азол-1-ил)алкил]-Ы-фенилкарбаматов 89
2.9.СинтезО-[со-(азол-1-ил)алкил]-Ы-фенилтиокарбаматов 91
2.10. Получение азолилалкилзамещенныха-аминокисл от 92
2.11. Результаты биологических испытаний 100
2.11.1. Испытания на фунгицидную активность 100
2.11.2. Испытания на антимикробную активность 106
2.11.3. Испытания на рострегуляторную активность 107
2.11.4. Расчет геометрических параметров структур с потенциальной антиагрегационной активностью 111
2.11.5. Испытания на антиагрегациогнную активность 115
2.11.6. Испытания на иммуномодуляторную активность 123
ГЛАВА 3. Экспериментальная часть 125
3.1. Синтез исходных соединений 125
3.2. Получение сложных эфиров со-азолилалкановых кислот и синтез со-азолилалкановых кислот 127
3.3. Синтез производных со-азолилалкановых кислот 136
3.4. Синтез производных со-азолилалканолов 158
Выводы 175
Список литературы 177
- Получение N-гетероциклилацилпроизводных со-алкановых аминокислот
- Получение а-аминокислот, содержащих гетероциклы
- Изучение взаимодействия гидразидов со-(азол-1-ил)алкановых кислот с карбонильными соединениями
- Получение сложных эфиров со-азолилалкановых кислот и синтез со-азолилалкановых кислот
Введение к работе
Разработка и создание новых лекарственных препаратов является важной совместной задачей органической химии и фармакологии. Ежегодно химики синтезируют, выделяют и характеризуют до 200 тысяч новых веществ, многие из которых проходят первичные испытания на выявление той или иной биологической активности (скрининг). Основными подходами, используемыми при создании новых синтетических лекарственных веществ, являются: принцип химического модифицирования структуры природных веществ, введения фармакофорной группы, молекулярного моделирования, машинного скрининга, стратегия пролекарств, концепция антиметаболитов и методология комбинаторной химии [1].
Азотсодержащие гетероциклические соединения широко распространены в природе и играют важную роль в процессах функционирования живых организмов. Среди синтетических физиологически активных соединений существует огромное количество препаратов, нашедших свое применение, как в медицине, так и в ветеринарии и в сельском хозяйстве, и по химической структуре являющихся азотсодержащими гетероциклами [2]. Анализ фармакологических свойств известных групп азотсодержащих гетероциклических соединений позволил сделать вывод о том, что имидазольный и триазольный заместители являются важными фармакофорными фрагментами, ответственными за проявление разнообразной физиологической активности [3].
С 80-тых годов прошлого века пристальное внимание исследователей привлекают ю-азолилалкановые кислоты, которые характеризуются умеренной токсичностью и, вследствие этого, перспективны для дизайна лекарств [4]. Известно, что сами по себе многие со-азолилалкановые кислоты обладают высокой биологической активностью, например, 8-(имидазол-1-ил)-октановая кислота проявляет антиагрегационные свойства [5, 6], 4-(имидазол-1-ил)-бутановая кислота является агонистом ГАМК [4], а 3-(бензимидазол-2-ил)пропионовая кислота -эстимулоцел проявляет высокую иммуномодулирующую активность [7]. Одним из высокоэффективных современных препаратов, получивших распространение в качестве ингибитора костной резорбции, а также для лечения остеопороза, является выпускаемая фирмой «Novartis» золендроновая кислота, получаемая в одну стадию из 1Я-(имидазол-1-ил)уксусной кислоты [8].
Важную роль в организме человека играет дипептид р-аланил-Ь-гистидин -карнозин [9]:
NH /—NH2
карнозин
Примечательно, что в составе своей молекулы карнозин содержит с одной стороны имидазольный цикл, а с другой - аминогруппу от гистидина, ацилированную Р-аланином - аминокислотой, которая образуется в организме в результате необратимых превращений пиримидиновых оснований урацила и тимина. Спектр биологического действия карнозина огромен. Наряду с антиоксидантными, ранозаживляющими и иммунорегулирующими эффектами, карнозин обладает также радиопротекторным, геропротекторным, противоопухолевым и противоязвенным действием. В связи с этим представляет интерес получение различных а-аминокислот, содержащих в своей структуре гетероциклическое кольцо, а именно -азольный фрагмент, в целях проведения последующего синтеза абиогенных «дипептидов».
Среди препаратов, применяющихся при нарушении гомеостаза, важное место занимают антиагреганты - лекарственные средства, предназначенные для сохранения реологических свойств крови - её текучести. Они ингибируют агрегацию тромбоцитов, снижают их способность к склеиванию и прилипанию (адгезии) к эндотелию кровеносных сосудов. Антиагреганты способны не только предупреждать агрегацию, но и вызывать дезагрегацию уже агрегированных кровяных пластинок, поэтому они находят применение для предупреждения образования послеоперационных тромбов, при тромбофлебитах, тромбозах сосудов сетчатки, нарушениях мозгового кровообращения, а также для предупреждения тромбоэмболических осложнений при ишемической болезни сердца и инфаркте миокарда [10].
Одними из первых фармапрепаратов, влияющих на содержание тромбоксана в организме, появились нестероидные противовоспалительные средства (НПВС), угнетающие циклооксигеназу. Следует отметить, что ингибиторы циклооксигеназы, например, ацетилсалициловая кислота, тормозят образование не только тромбоксана, но и простациклина. Простациклин активирует аденилатциклазу, снижая в
тромбоцитах содержание ионизированного кальция - одного из трёх главных посредников агрегации, тем самым, оказывая благоприятное влияние на микроциркуляцию [11]. Встаёт задача поиска селективных ингибиторов тромбоксансинтетазы в ряду производных со-азолилалкановых кислот. Анализ литературных данных, а также проведённые квантово-химические расчёты показали, что наибольшей активностью обладают соединения, в которых расстояние между атомом N азольного цикла и карбонильным атомом кислорода карбоксильной группы составляет 10,5-11,0 нм.
Важное место среди антиагрегантов, препаратов предупреждающих развитие тяжелых сердечно-сосудистых осложнений, снимающих бронхоспазм, занимают производные азолов, в первую очередь имидазола, являющиеся ингибиторами тромбоксансинтазы. В частности, высокоселективными ингибиторами тромбоксансинтазы являются препараты озагрел [6] и дазоксибен [2]:
озагрел дазоксибен
После стимуляции клетки, арахидоновая кислота высвобождается из мембранных фосфолипидов и превращается в результате последовательности ферментных реакций (каскад арахидоновой кислоты) во множество различных производных метаболитов по двум основным путям - липоксигеназному и циклооксигеназному. Продуктами циклооксигеназного пути являются широко распространенные простагландины, из устойчивого простациклина PGH2, образуется как простациклин (PGI2), образующийся в эндотелии сосудов, так и тромбоксан (ТхА2), который синтезируется в тромбоцитах. При ряде заболеваний наблюдается дисбаланс между этими двумя эйкозаноидами, перепроизводство тромбоксана А2, выявлено при многих паталогических состояниях. Ингибиторы тромбоксансинтетазы, например, дазоксибен, блокируют биосинтез тромбоксана, при этом наблюдается конверсия тромбоцитарных эндоперекисей (PGH2) в простациклин PGI2, что способствует повышению атромбогенных свойств сосудистой стенки, ингибированию адгезии тромбоцитов, их агрегации и коагуляции, а также может сопровождаться понижением давления [12].
С целью повышения продуктивности сельского хозяйства в условиях фитосанитарного оздаровления агроэкосистем возникает задача по созданию и применению биорациональных химических средств защиты растений в рамках интегрированной защиты сельскохозяйственных культур. Важное значение имеет разработка фунгицидных препаратов, применение которых позволяет, как снизить потери урожая из-за болезней растений, так и уменьшить загрязнение продуктов микотоксинами.
Многие используемые системные фунгициды - ингибиторы биосинтеза стероидов - являются соединениями, включающими в свой состав азотсодержащие гетероциклы. Весьма многочисленны среди них производные 1,2,4-триазола и имидазола. На рынке агрохимических препаратов присутствует производное азолилтионуксусной кислоты (имибенконазол) [13]. В литературе имеются данные о фунгицидной активности а-алкилзамещенных производных а-азолилациланилидов [14,15]:
R R
где R, R' - алкил
Ряд 5-нитрофурфурилиденазолилацетгидразонов проявляет бактерицидные свойства [16,17].
где Az - пиразолил, имидазолил, 1,2,4-триазолил
Некоторые 2-(5-нитро-2-метил-имидазол-1 -ил)ацетгидразоны послужили прекурсорами для получения высокоактивных антимикробных препаратов [18].
С другой стороны гетероциклилалкановые кислоты нашли применение в качестве регуляторов роста растений.
Наибольшую известность получили ретарданты - препараты, блокирующие синтез гиббереллинов и тормозящие рост растений. Применение ретардантов позволяет существенно сокращать потери урожая от полегания зерновых, улучшать качество рассады овощных и декоративных культур, стимулировать цветение и плодоношение плодовых [19]. Эффект синтетических регуляторов реализуется через
изменение эндогенного уровня природных фитогормонов, что и позволяет сдвинуть
рост и развитие растений в необходимых направлениях [20]. В практику сельского
хозяйства вошли ретарданты из группы производных 1,2,4-триазола - униконазол
(сумагик) и паклобутразол (4,4-диметил-2-(1,2,4-триазол-1-ил)-
1-(4-хлорфенил)пентанол-3, клиппер), которые уже при малых нормах расхода увеличивают продуктивность пшеницы, овощей и фруктовых деревьев.
В то же время производные со-(азол-1-ил)алкановых кислот, в частности, анилиды, амиды, пептидомиметики - М-[(азол-1-ил)ацил]аминокислоты мало изучены, сведения о них не многочисленны. С другой стороны почти неизвестны их ближайшие изостерные аналоги производные со-(азол-1-ил)алканолов, а именно О-азолилалкил-И-фенилкарбаматы, О-азолилалкил-Ы-фенилтиокарбаматы с потенциальной антиагрегационной, фунгицидной и бактерицидной активностью.
Таким образом, основной целью данной работы является разработка эффективных методов получения о)-азолилалкановых кислот и поиск на их основе новых биологически активных производных: со-(азол-1-ил)^-фенилалкиламидов (I), ю-(азол-1 -ил)ацетгидразонов (И), Ы-(ш-азол илацил-производных)-со-аминокисл от (пептидомиметиков) (III), а также их ближайших изостерных аналогов (0-[ю-(азол-1 -ил)алкил]-]Ч-фенил(тио)карбаматов (IV):
/(СН2)п^
Az'
/(CH^r^N^^ _^А^ " д,/(СН2)П^^%<Ач^'%1
О о
^(CH2)n N J! ^(CH2)nN
III IV
где Az: имидазол, 1,2,4-триазол, безимидазол; п = 1-5; т,= 1-3; X = О, S; R2 = Alk, AlkO, BnO, PhO, HO, Et02C, F, CI, Br, CF3, N02
Биологические испытания ряда синтезированных нами соединений продемонстрировали наличие антиагрегационной, фунгицидной и рострегуляторной активности, превосходящей соответствующие эталонные препараты.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка использованной литературы. Результаты
исследований и данные по биологической активности изложены в следующих разделах диссертации:
оптимизация условий получения сложных эфиров ш-(азол-1-ил)алкановых кислот;
синтез со-(азол-1 -ил)алкановых кислот;
квантово-химический расчет взаимодействия у-бутиролактона с азолами и азолатами методом ab initio в базисе RHF/6-31G* пакета HyperChem 6.03;
синтез замещенных со-(азол-1 -ил)-Ы-фенилалкиламидов;
получение (о-(азол-І-ил)ацетгидразонов;
квантово-химический расчет относительной устойчивости возможных изомеров и конформеров азолилацетгидразонов ab initio в базисе RHF/STO-3G;
синтез Н-[ю-(азолил)ацил]-(о-аминокислот;
получение 0-[со-(азол-1-ил)алкил]-№фенил(тио)карбаматов;
получения азолилалкилзамещённых а-аминокислот;
результаты биологических испытаний на фунгицидную, рострегуляторную, иммуномодуляторную активность;
расчет геометрических параметров структур с потенциальной анти-агрегационной активностью;
результаты биологических испытаний на антиагрегационную активность.
Получение N-гетероциклилацилпроизводных со-алкановых аминокислот
Для гидразонов известны примеры как пространственной, так и структурной изомерии, а в некоторых случаях наблюдается и таутомерное равновесие двух или даже трех форм.. Так Китаев Ю.П. и Бузыкин Б.И. [71] указывают на другие виды изомерии, такие как изомерия положения в гидразонном фрагменте (превращение в азосоединение, в енгидразины), кольчато-цепная изомерия, а так же неразрывно связанные с этими превращениями вопросы таутомерного превращения.
По аналогии с оксимами, изомер, в котором замещенная аминогруппа и метанный атом водорода у производных альдегидов или меньший радикал (X) у производных кетонов находятся в i/wc-положении относительно связи ON, обычно считают сш-изомером (Е-изомер), а в транс-положении - ш/яш-изомером (Z-изомер).
При сложных R и X называют радикал, по отношению к которому аминогруппа занимает то или иное положение, например: син-фенилизомер 2,4-динитрофенилгидразона ацетофенона. Многие гидразоны, особенно содержашие нитроарильный заместитель, склонны к полиморфизму. Так, например, сш-2,4-динитрофенилгидразон ацетальдегида существует в четырех полиморфных модицикацияхтТпл= 145-146,157-158, 160-161,165-166С.
Кроме того, известно образование смешанных кристаллов, циклических форм или перемещение кратной связи у производных ненасыщенных карбонильных соединений. Здесь же следует отметить, что гидразонам присуще и явление фототропии. Фенилгидразон бензальдегида при стоянии на солнечном свету приобретает оранжево-красную окраску, которая исчезает при длительном хранении в темноте. Повышение температуры увеличивет скорость фототропных превращений.
Применение совокупности современных физических методов исследования, особенно ПМР-спектроскопии, позволило установить наличие геометрических изомеров практически для всех видов гидразонов: незамещенных, алкил-, арил-, гетерил-, ацилгидразонов и др..Изучение ПМР-спектров жидких гидразонов и их растворов показало, что они существуют обычно в виде смеси син- и анти-изомеров. Метановый протон син-изомера гидразона альдегида дает сигнал в более слабых полях, чем протон анти-томера в гидразонах несимметричных кетонов; наоборот, протоны группы, находящеся в смн-положении, поглощают в более сильных полях, нежели а www-изомерах.
Например, в работе Лозинского с сотр. [72] указывается на то, что син- и -изомеры могут находится в разных конформациях, относительно алкильной группы у метанового углерода:
По константам спин-спинового взаимодействия, найденым из ПМР-спектров метанового протона и протона соседней алкильной группы и син-изомерах гидроазонов замещенных альдегидов, определены конформации алкильных групп. Наиболее стабильной оказалась конформация А (в которой протон соседней алкильной группы лежит в плоскости связи C=N), которая обычно находится в равновесии с конформацией В (заместитель в алкильной группе в плоскости C-N). При повышении температуры от -30С до 80С содержание формы А уменьшается с 76% до 69%.
Изложенный выше материал позволяет сделать вывод о возможности независимого существования различных геометрических изомеров и о способности их к взаимным переходам. Переход сіш-изомера в анти- или наоборот для некоторых гидразонов происходит в растворах спонтанно, для других -необходимо присутствие катализатора: едкого кали, алкоголятов, иода, двуокиси серы, желтой окиси ртути, наиболее же часто - кислот. Нагревание, иногда выше температуры плавления, и особенно облучение видимым и УФ-светом так же вызывает изомеризацию гидразонов.
Взаимное превращение геометрических изомеров гидразонов наблюдается и в процессе химических превращений: при бромировании, ацилировании, омылении и других реакциях:
Изомерия гидразон-азосоединение обусловлена перемещением протона, который, в зависимости от строения карбонильной компоненты, может мигрировать как в пределах гидразонной группы (изомерия гидразон-азоалкан с 1-3 миграцией протона), так и в пределах всей молекулы. При изомерии гидразон-азосоединение происходит изменение гибридизации аминного атома азота (sp3-+sp2). У иминного атома азота тип гибридизации остается прежним, но изменяется характер кратной связи, в которой он участвует.
Однако простейшие расчеты показывают, что гидразонная структура выгоднее, чем структура азо-алкана в ряду арилгидразонов на 9 ккал/мль, а в ряду семикарбазонов - на 15 ккал/моль. Изомеризация азоалканов, арилазоалканов, арилазостероидов, ацилазоалканов в алкил-, арил- и соответственно ацилгидразоны происходит при действием кислот, щелочей, свободных радикалов и даже спонтанно. При синтезе азолилацетанилидов чаще алкилируют азолаты хлорацетанилидами. а-Алкилсодержащие азолилацетанилиды получают взаимодействием азолята натрия с галогенацетанилидом при кипячении и перемешивании в течение 2 ч в метаноле, этаноле или ацетонитриле. Согласно патенту [15] был получен ряд триазольных и одно имидазольное производные ацетанилида, ближайших гомологов интересующих нас соединений: сожалению, выходы целевых продуктов не приведены.
Иове и др. [73] получали различные производные пиразолов. Так, например, о (пиразол-1-ил)-2-нитроацетанилид получают с выходом 33% по реакции сс-йод-2-нитроацетанилида с пиразолом, в присутствии карбоната натрия, при нагревании до 60С в течение 5 часов. о v J — - 4 Аналогично получены: а-(3,5-диметилпиразол-1-ил)-2-нитроацетанилид, а-(3,5-диметил-4-йодпиразол-1-ил)-2-нитроацетанилид и а-(3,5-диметил-4-нитропиразол-1-ил)-2-нитроацетанилид с выходом 41%, 54% и 32% соответственно.
Станковский и Жедловска [74] получали замещенные производные (1,2,4-триазол-1-ил)ацетанилидов реакцией 1-хлорацетанилидов с 1,2,4-триазолом в присутствии карбоната натрия в ацетонитриле. Выхода составили 65-85%. Турецкие авторы Актюрк и Килик [75] изучали ор/яо-замещенные со-(имидазол-1-ил)ацетанилиды, пропионанилиды, бутиранилиды:
Получение а-аминокислот, содержащих гетероциклы
Английские авторы [145] изучили биохимическое и фармакологическое действие (имидазол-4-ил)уксусной кислоты (ИУК). Исследуя гипнотическое действие ИУК при испытаниях in vivo при внутрибрюшинном введении на мышах, было установлено, что при более низких концентрациях (ЕС5о=0.6 ммоль/кг) ИУК проявляет анальгетическую активность, а при более высоких (ЕС5о=0.9 ммоль/кг) -снотворное действие. При концентрации выше 1.6 ммоль/кг 100% животных засыпает. При испытаниях на нейрорецепторе растяжения лангуста Pacifastacus leniusculus ИУК проявляет ингибирующее действие в отличие от близких аналогов таких, как имидазолилпропионовая кислота, гистидин, гистамин и гистинол.
Сравнительное исследование влияния ИУК и гаммагидроксимасляной кислоты (ГГМК) [146] показало, что в концентрации 400 мг/кг при введении внутрибрюшинно ИУК увеличивает уровень ГАМК, не влияя на биосинтез ГАМК из глютамата, за счет неконкурентного ингибирования ГАМКтрансаминазы (К, = 3.4х10"4 М).ИУК влияет и на уровень биогенных аминов - нейромедиаторов, увеличивая уровень сератонина на 70%, что меньше, чем ГГМК (125%); допамина на 122%, что существенно ниже, чем ГГМК (250%); в тоже время ИУК увеличивает уровень норадреналин на 130%.
Итальянские авторы Варази и Тарзиа [4] при помощи радиолигандного метода с использованием Н-ГАМК определили 1С5о ряда агонистов ГАМК, таблица 1.4.2. аналог, но уступает 4-(диметилпирол-1-ил)бутановой кислоте. Ларсеном и Коннелом при создании противодиабетических препаратов было изучено воздействие на организм 3-гуанидинпропановой кислоты и ее изостерных аналогов [147]. Данные соединения оказывают действие как на транспорт креатина, так и на работу креатинкиназы. Наиболее активны - 3-гуанидинпропановая кислота и N-фосфорилированная 3-гуанидинпропановая кислота. Наиболее активные структуры приведены в таблице 1.4.3.:
Баба и соавторы [148] на основе эфиров азолилкарбоновых кислот синтезировали хиназолины, обладающие противовоспалительной активностью. При циклизации 4-фенил-2-гетерил-3-хинолинкарбоновых кислот взаимодействием с магниевой солью этилмалоновой кислоты получали гетерилалканоилацетаты, которые конденсировали с 2-бензоиланилинами в кислой среде с образованием целевых соединений. Противовоспалительная активность хиназолиновых кислот, содержащих во втором положении (1,2,4-триазол-1-ил)метил и (имидазол-1-ил)метильный фрагменты одна из самых высоких. При дозе 12,5 мг/кг эти соединения на 70 и 65% подавляют развитие отека, вызываемого 0,5% суспензией убитых микобактерий туберкулеза в жидком парафине, при этом ED5o составляет 7,7 и 2,6 мг/кг соответственно. В то время как используемый в качестве эталона Justicidine, содержащий во втором положении 1-метил-имидазол-2-илтиометильный фрагмент, имеет ED5o 25 мг/кг:
Японские авторы Касаи и Нагасава [50] разработали ряд (2-нитроимидазолил)ацетамидов, которые эффективно ингибируют рост раковых клеток in vitro при дозе 0.4 мг/г (мыши), особенно в сочетании с радиооблучением в дозе 30 Gy. При сравнении с этанидазолом большую активность демонстрируют его N-метильный аналог - М-(2-гидроксиэтил)-К-метил-2-(2-нитроимидазолил)ацетамид: н сн Исследование серии бис-(нитроимидазолил)алканкарбоксамидов с помощью теста гипоксияселективной цитотоксичности и радиосенсибилизации в условиях клеточной гипоксии как in vitro так и in vivo на мышах позволило выявить в качестве наиболее перспективного противоракового препарата - М-[2-(2-метил-5-нитро-1 Н-имидазолил)этил] -4-(2-нитро-1 Н-имидазол ил)бутанамид [34]. Последующее исследование близких соединений показало, что наибольшей активностью обладает бис-3-(2-нитро-1 Н-имидазолил)пропиламин, природа механизма цитотоксичности которого не ясна, известно, что она не связана с тем, что он является ДНК-сшивателем [33]:
Пелициари [49] показал, что (2-циклопентил-1-бензимидазолил)-Ы,М-диэтилацетамид проявляет антиспазмолитическую активность, вытесняя 3Н-диазепам (0.765 пМ) с константой 150 2.5 10"6 М.
С целью поиска новых лекарственных веществ, применяемых при нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера, были синтезированы аналоги такрина - ингибитора обратного захвата холина. Из синтезированных N-алканоил- и Ы-гетероциклил-Ы-алканоиламинопиридинов наибольшую активность показали производные масляной, 2-пирролидон-1-илуксусной и имидазол-1-илуксусной кислот [149]. Испытания проведены in vitro на синоптосомах, выделенных из гиппокампа крыс, таблица 1.4.4.:
Изучение взаимодействия гидразидов со-(азол-1-ил)алкановых кислот с карбонильными соединениями
Исходя из этого, можно предположить, что в сильно полярные растворители: метанол, абсолютный этанол, в первую очередь, переходит целевой продукт Р-(имидазол-1-ил)-а-фенил-а-аланин, о чём свидетельствуют наличие и интенсивность пиков, характерных для аминокислоты, продукта её декарбоксилирования и исходного гидантоина. Это отчасти подтверждается тем, что при снижении интенсивности пика, соответствующего р-(имидазол-1-ил)-а-фенил а-аланину, температура плавления вещества увеличивается, а при его отсутствии, но при 100%-ной интенсивности пика, соответствующего продукту декарбоксилирования, температура плавления вещества минимальна. Из приведённых данных (таблица 2.10.2.) видно, что примесь исходного гидантоина и продукта декарбоксилирования образующейся аминокислоты присутствует во всех образцах. Однако, интенсивность полос, характерных для аминокислот, значительно превышает интенсивность полос, характерных для побочных веществ, за исключением образца 2, где в основном присутствует продукт декарбоксилирования аминокислоты. Таким образом, результаты различных методов анализа соответствуют друг другу.
Щелочной гидролиз в присутствии каталитических количеств имидазола проводили при атмосферном давлении в кипящей воде. Несмотря на то, что синтез протекал сравнительно долго (около 55 часов), недостаточно жесткие условия не привели к ожидаемым результатам, поскольку степень превращения исходного гидантоина, как следует из анализа ТСХ и данных хроматомасс-спектроскопии, составила всего лишь около 8%. С целью увеличения полноты протекания реакции нами была проведена аналогичная реакция в стальной ампуле при повышенном давлении при температуре 150С в течение 4 часов. Однако, как следует из данных ТСХ, при этом оказалась велика доля продукта декарбоксилирования образующейся аминокислоты. Таким образом, можно сделать вывод о том, что столь продолжительное нагревание в жёстких условиях отрицательно сказывается на выходе целевого продукта, резко повышая тем самым вероятность протекания побочного процесса декарбоксилирования аминокислоты.
Исходя из этого, можно сказать, что для получения азолилалкилзамещённых а-аминокислот методом гидролиза соответствующих 5,5-дизамещённых гидантоинов, процесс необходимо вести в жёстких условиях, чётко контролируя время протекания реакции. С целью получения 1-замещенных азолов - близких аналогов гистидина, необходимо было получить р-(азол-1-ил)аланины.
Из природных источников были выделены некоторые р-(азолил)-аланины, которые являются аминокислотами небелкового происхождения. Как показало изучение литературных источников ряд аминокислот - аналогов гистидина, обладает потенциальной антибактериальной и противоопухолевой активностью. В связи с этим нами предпринята попытка синтеза аминокислот, принадлежащих к ряду Р-(азол-1-ил)-аланинов. Целевые соединения, с одной стороны, могут проявить биологическую активность как новые аналоги гистидина, а с другой стороны, обладают потенциальной фунгицидной активностью. Нашей целью также являлось получение аминокислот аналогов гитидина, у которых азольное кольцо было связано с аминокислотным остовом через N -атом гетероцикла.
Одним из основных методов получение аминокислот является метод Серенсена. По методу предложенному Айнсвордом [115], для получения триазольного аналога гистидина, оксиметилированые азолы подвергаются хлорированию тионилхлоридом, за которым следует взаимодействие с натриевой солью диэтилового эфира N-формиламиномалоновой кислоты, что приводит к азолилзамещенным аланинам (схема 2.10.3.).
Взаимодействие N-метилформилдиэтилмалоната с хлорметилтриазолом по методу Айнсворда в этаноле в присутствии этилата натрия не привело к получению целевого продукта, отрицательный результат был в диметилформамиде в присутствии гидрида натрия. Алкилирование протекало, но выделить целевой продукт после проведения в первом случае кислотного, а во втором основного гидролиза не удалось.
В качестве альтернативной, была выбрана схема синтеза, предложенная Сугимото [138]. Полученный из винилацетата 2-бромо-1,1-диэтоксиэтан взаимодействовал с азолятами натрия в кипящем абсолютированном диоксане в течение 36-40 часов с образованием 2-(1,1-диэтоксиэтил)-1Я-азолов (97-99) с выходами 40-72% (Rf=0,3 8-0.42) (схема 2.10.4).
Гидролиз ацеталей в кислой среде не привел к образованию а-(азолил-Ы)-ацетальдегидов, вследствие их малой стабильности так, как наряду с основной реакцией протекала побочная реакция кротоновой конденсации, что приводило к осмоленню реакционной массы. Чтобы исключить стадию выделения альдегида мы решили вводить в реакцию Бухерера-Бергса более устойчивый оксим азолилацетальдегида по аналогии с [126]. Гидрохлорид гидроксиламина взаимодействовал с (а-имидазолил)диэтилацеталем в воде при катализе соляной кислотой. При этом первоначально протекает гидролиз ацеталя до альдегида, который немедленно вступает в реакцию с гидрохлоридом гидроксиламина с образованием оксима (100) с количественным выходом. По данным Н ЯМР-спектроскопии продукт, вероятно, представляет собой смесь двух изомеров в aHTH-(Z) и син-(Е)-формах, с преобладанием Z-изомера (4:1). Прохиральные протоны метиленовой группы наблюдаются в виде двух дублетов 5.03 (анти) и 5.12 (син) м.д. (./=4.6 и 4.1 Гц соответственно). Соответствующие метановые протоны наблюдаются в виде триплетов с хим. сдвигом 7.00 (син) и 7.58 (анти) м.д. с такими же константами спин спинового взаимодействия 4.1 и 4.6 Гц.
Была предпринята попытка получить 5-(имидазол-1-илметил)имидазолидин-2,4-дион в стальной ампуле под давлением 10 атм. из оксима, синильной кислоты и карбоната аммония аналогично [190]. Но осуществить это превращение с образованием гидантоина не удалось.
Получение сложных эфиров со-азолилалкановых кислот и синтез со-азолилалкановых кислот
Соединения были испытаны к.м.н. В.Н. Журавлевым и Д.Д. Зыбиным под руководством д.м.н. проф. Е.Г. Лобановой на кафедре фармакологии лечебного факультета МГМСУ. Агрегацию тромбоцитов изучали методом светорассеяния по методу Born [213,214].
Богатую тромбоцитами плазму (в среднем 3x108 в 1 см3 тромбоцитов) получали центрифугированием свежеполученной крови здоровых доноров (стабилизатор -3.8%-ный цитрат натрия, соотношение крови и раствора цитрата 9:1) в течение 10 минут при 1000 об/мин при комнатной температуре. До проведения эксперимента и в конце его, в каждом образце подсчитывали количество тромбоцитов. В том случае, если плазма содержала большее количество кровяных пластинок, то ее разводили до необходимого количества безтромбоцитарной плазмой, полученной центрифугированием цитратной крови в течение 10 минут при 3000 об/мин. В качестве индуктора агрегации использовали АДФ (НПО «РЕНАМ», Россия). Условия проведения эксперимента: 37С, объем богатой тромбоцитами плазмы 450 мкл, объем исследуемого раствора вещества 50 мкл, время прединкубации с препаратом ингибитора 5 минут при перемешивании, объем индуктора агрегации 50 мкл, конечная концентрация для АДФ 1x10 5 М. (В качестве контроля использовали богатую тромбоцитами плазму в объеме 450 мл.). Количественной характеристикой степени агрегации служило относительное падение оптической плотности на максимуме амплитуды агрегатограммы. В процессе записи наблюдали изменение оптической плотности исследуемой плазмы в диапазоне 100% (богатой тромбоцитами плазмы) до 0% (безтромбоцитарная плазма) (длина волны зондированного светового потока 660 нм). Результат выражали в процентах падения оптической плотности на максимуме амплитуды агретограммы.
С целью исследования влияния на агрегацию тромбоцитов (о- азолилалкановых кислот, возможных продуктов метаболизма азолилалкананилидов, были проведены опыты in vitro. Результаты которых показали (рис. 3.), что в диапазоне концентраций от 10" до 10 М 4-(имидазол-1-ил)бутановая (62) и 2-(имидазол-1-ил)уксусная кислоты (6) подавляли агрегацию тромбоцитов в большей степени, чем дазоксибен. Имидазолилуксусная кислота (6) активнее дазоксибена во всем диапазоне концентрации вплоть до 10 7М, в то время как ближайший гомолог 3-(имидазол-1-ил)пропионовая кислота (52) полностью лишена подобного типа активности. Среди новых производных со-азолилалкановых кислот выявлено семь соединений, а в ряду ю-азолилалкилкарбаматов - четыре соединения, проявляющих антиагригационную активность in vitro в условиях АДФ- (lxlO"7 М) (таблица 2.11.4.1. и рис.4,5) и коллаген-индуцированной (0,2 мг/л) агрегации тромбоцитов. Установлено, что наибольшей антиагрегационной активностью обладают соединения с расстоянием между фармакофорными фрагментами равным 10.82-11.14 нм (квантово-химический расчет методом AMI).
Эффект ш-(Ш-азол-1-ил)-Ы-фенилалкиламидов и 0-[ш-(азол-1-ил)алкил]-N-фенилкарбаматов в экспериментах in vitro проявлялся в диапазоне фармакологически приемлемых концентраций 10 5-10"7 М, при этом оптическая плотность плазмы снижалась до 14,0%. Исследуемые соединения, например, 65ф, 13х , 12х , 92ае превосходили эталон дазоксибен при агрегации вызываемой АДФ во всем диапазоне концентраций.
Испытания на антиагрегационную активность in vivo. Для этой серии экспериментов, было выбрано соединение 65ф, проявившее ингибирующую активность как на модели АДФ-индуцированной, так и на модели коллаген-индуцированной афегации тромбоцитов и превосходившие по действию препарат сравнения дазоксибен.
Выбранное соединение вводились кроликам породы Шиншилла внутривенно в краевую вену уха в дозах 11, 16, 21 мг/кг. Первый забор крови для исследования осуществлялся через 30 мин. после введения, далее через 1, 3, 5, 7, 9, 11 и 24 часа. В том случае если оптическая плотность плазмы через 11 часов после введения исследуемого соединения значительно отличалась от контрольных значений, то забор крови делали еще через 13 и 15 часов после введения. В качестве индуктора использовали АДФ в пороговой концентрации (1x10"5 М). Полученные результаты суммированы и представлены в таблице 2.11.5.1.
Сравнительное изучение действия новых производных азолилалкановых кислот и дазоксибена на плазменные факторы свертывания крови in vivo.
Для этой серии экспериментов, были выбрано соединение 65ф, проявившее наибольшую активность при проведении предыдущих тестов как в экспериментах in vitro, так и in vivo. Соединение вводили кроликам и проводили забор порции крови для исследования аналогично вышеупомянутому. Полученные результаты суммированы и представлены в таблице 2.11.5.1.
Сравнительное исследование 4-(1#-Имидазол-1-ил) ЦЗ-этоксикарбонилфенил)бутанамида (65ф) и дазоксибена при внутривенном введении кроликам {in vivo) говорит о дозозависимом подавлении АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов под действием этих препаратов (рис. в.). В то время как дазоксибен проявляет максимальный эффект при наибольшей дозе от 0.5 до 5 часов, снижая афегацию на 30%, анилид (65ф) превосходит по выраженности препарат сравнения - дазоксибен, демонстрируя пролонгированное действие, почти совпадающее с дазоксибеном через 0.5 часа и достигающее максимального эффекта через 11 часов (подавление афегации на 43%). Значительно большая продолжительность действия нашего анилида (подавление афегации на 35% и меньше) наблюдается с 3 до 15 часов. Такое продолжительное действие может быть обусловлено тем, что in vivo проявляется «ргос1п »-эффект, то есть в организме происходит постепенный гидролиз эфира до активной 3-[4-(имидазол-1-ил)бутаноиламино]бензойной кислоты.
По влиянию на активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) при сравнительной оценке дазоксибена и 65ф наблюдается схожая картина (см. рис.7). Максимальное увеличение АЧТВ в случае дазоксибена (60%) наблюдается через 2.5 часа. При введении анилида (65ф) АЧТВ достигает максимума через 8-13 часов при этом оно возрастает ( 52%) почти вдвое.
Инкубацию богатой тромбоцитами плазмы с фрагментом аорты крыс приводили с целью определения возможного синергического действия препаратов с таким широко применяемым антиагрегантом как ацетилсалициловая кислота (АСК [215]). Обработка фрагмента аорты АСК в высокой концентрации полностью устраняет его антиагрегационные свойства, при этом эффект сочетанного влияния на АДФ-индуцированную агрегацию с соединением 65ф не отличается от такого при изолированном использовании, последнего. После инкубации фрагмента аорты с АСК в концентрации 2 и 0,3 мг/мл регистрируется достоверное подавление АДФ-индуцированной (1x10"6 М) агрегации, при этом соединение 65ф в значительной и большей по сравнению с дазоксибеном степени потенцирует этот эффект.
Наиболее перспективными антиагрегационными препаратами из ряда исследованных соединений являются 4-(1#-имидазол-1-ил) Ы-(3-этоксикарбонилфенил)бутанамид (65ф) и 0-[2-(1#-имидазол-1-ил)этил]-М-(3-трифторметилфенил)карбамат(92ае).
![Синтез и реакционная способность азоло[5,1-c]-1,2,4-триазин-7-онов](/i/i/4267/436795.png "Синтез и реакционная способность азоло[5,1-c]-1,2,4-триазин-7-онов Деев Сергей Леонидович")