Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор. Природные тритерпеноиды: структура, биосинтез и химические модификации 7
1.1. Структурные типы тритерпеноидов 7
1.1.1. Тритерпени, выделенные из морских организмов 9
1.1.2. Растительные тритерпеноиды 12
1.1.3. Био- и геогопаноиды 18
1.2. Биосинтез тритерпеноидов 19
1.3. Биологическая активность тритерпеноидов 24
1.3.1. Противоопухолевая активность тритерпеноидов 24
1.3.2. Антифлогистическая и антибактериальная активность 26
1.3.3. Противовирусные, противоязвенные и другие свойства тритерпеноидов 27
1.4. Химические модификации тритерпеноидов 29
1.4.1. Синтетические трансформации гидрокси - тритерпенов 29
1.4.2. Окислительные трансформации тритерпеноидов 32
1.4.3. Синтез пентациклических тритерпенов и их А-нор производных 37
Глава 2. Обсуждение результатов 42
2.1. Выделение пентациклических тритерпеноидов из растения татарника колючего Onopordwn acanthium L. 42
2.2. Идентификация выделенных тритерпеноидов с помощью ЯМР Н и ,3С высокого разрешения 47
2.3. Рентгеноструктурное исследование тараксастерилацетата 51
2.4. Вероятный маршрут биосинтеза выделенных тритерпеноидов в растении Onopovdum acanthium L. 55
2.5. Синтетические трансформации тараксастерола и его ацетата 58
2.5.1. Синтетические трансформации тараксастерола 58
2.5.2. Синтез и селективные превращения 20-оксопроизводных 30-иортараксаетери л ацетата 61
2.6. Противовоспалительная активность тараксастерола и его ацил- производных 68
Глава 3. Экспериментальная часть 70
3.1. Выделение и идентификация тритерпеноидов из татарника колючего Onopordum acanthium L. 71
3.2. Рентгеиоструктурное и рентгенофазовое исследование кристаллов тараксастерилацетата 74
3.3. Синтетические трансформации тараксастерола 76
3.4. Синтез 20-оксопроизводных 30-нортараксастерилацетата 82
3.5. Окисление 3/?-ацетоки-30-нортараксастан-20-она по Байеру-
Виллигеру системой Se02-H302 и /я-СРВА 87
Выводы 89
Литература 91
Приложение 109
- Противовирусные, противоязвенные и другие свойства тритерпеноидов
- Синтез пентациклических тритерпенов и их А-нор производных
- Вероятный маршрут биосинтеза выделенных тритерпеноидов в растении Onopovdum acanthium L.
- Рентгеиоструктурное и рентгенофазовое исследование кристаллов тараксастерилацетата
Введение к работе
Неослабевающий интерес к лекарственным препаратам природного происхождения стимулирует поиск растений богатых физиологически активными метаболитами.
На территории России, в том числе в республике Башкортостан, произрастает множество видов лекарственных растений, используемых в народной медицине. Так, кардиотонические, противоопухолевые и противовоспалительные свойства татарника колючего Onopordum acanthium L., издавна применяемого как эффективное лекарственное средство, позволяют сделать предположение о высоком потенциале биосинтеза соединений, ответственных за терапевтический эффект. Недавно фармацевтическая компания Аи-ravita (Англия) представила новый гомеопатический препарат на основе экстракта татарника колючего "Onopordon Comp В Drops," регулирующий деятельность сердечно-сосудистой системы.
Ранее в составе метаболитов надземной части Onopordum acanthium L. обнаружены пентациклические тритерпеновые спирты ряда лупана и олеана-на и сесквитерпеновые лактоны (арктиопикрин и онопордопикрин), что позволяет рассматривать Onopordum acanthium L, как перспективный возобновляемый источник биологически активных терпенов. Между тем, до настоящего времени, полный состав тритерпеноидов растения Onopordum acanthium L. малоизучен.
Согласно имеющимся в литературе сведениям, пентациклические три-терпеноиды и их синтетические аналоги успешно применяются в составе антибактериальных и анти-ВИЧ препаратов. В этой связи, изучение тритерпенового состава корневой и надземной частей татарника колючего Onopordum acanthium L., выделение и идентификация тритерпеноидов, а также синтез фармакологически значимых аналогов на их основе представляется важной и актуальной задачей.
Целью работы является изучение тритерпенового состава надземной части растения Onopordum acanthium L., выделение, установление структуры
5 и проведение синтетических трансформаций полученных тритерпеноидов, а также исследование противовоспалительной активности синтезированных соединений.
В результате проведённых исследований из Onopordum acanthium L. впервые выделены пентациклические тритерпеноиды тараксастанового ряда - тараксастерол и тараксастерилацетат с выходами 1% и 2.8% соответственно. Установлено, что наибольшее содержание тараксастерола находится в вегетативных частях растения, а его ацетата - в генеративных. Разработан эффективный способ выделения тараксастерилацетата с применением колоночной хроматографии (КХ) на силикагеле, импрегнированном AgN03.
Впервые выполнено рентгеноструктурное исследование тараксастерилацетата, для которого выявлен полиморфизм кристаллов. Одно- и двумерным экспериментами ЯМР Ни С проведено полное отнесение стереохимически важных сигналов тараксастерилацетата.
Исследованы некоторые трансформации тараксастерола, а именно, осуществлены окисление тараксастерола с помощью пиридиниихлорхромата (РСС) в 3-оксо-20(30)-тараксастен и оксимирование последнего в Е- и 2-изомерные оксимы (2:1). Показано, что перегруппировка Бекмана полученных изомерных кетоксимов реализуется по механизму второго рода с образованием смеси стереоизомеров (1:2) 3,4-секо-5(5УЙ)-нитрилов.
Ацилированием тараксастерола получены новые 3/?-бензоилокси- и 3/?-трифторацетокси-20(30)-тараксастены.
При озоиолизе тараксастерилацетата в хлороформе происходит дегидрирование по С(21)-С(22) углеродным атомам в кольце Е, приводящее к 3/?-ацетокси~30-нортараксаст-21(22)~ен-20-ону. Озонолиз тараксастерилацетата в присутствии метанола (СНС13-МеОН, 80:1) приводит к образованию 20,20-диметокси-30-нортараксаст-3/?-ил ацетата. Селективный синтез 20-гидрокси-и 20-оксо-30-нортараксастерилацетатов осуществлён озонированием хлороформного экстракта цветоложа цветков Onopordum acanthium L., содержащего наряду с сопутствующими компонентами тараксастерилацетат, с после- дующим восстановлением продуктов озонолиза LiAlH4, Me2S соответственно,
Оксимирование З/ї-ацетокси-ЗО-нортараксаст-20-она протекает с низкой конверсией (-15%). Перегруппировка Бекмана для 20-кетоксима не реализуется, вероятно, вследствие стерических препятствий (коиформация кольца Е - скрученная ванна). Окисление 3/?-ацетокси-30-нортараксаст-20-она по Байеру-Виллигеру приводит к соответствующему 20519-()-лактону с выходами -20% под действием m-хлорпербевзойной кислоты (т-СРВА) и 65% под действием Se02-H202.
Выявлена противовоспалительная активность 3/?-гидрокси-20(30)-тараксастена и его ацилатов (на модели формалинового отёка задней лапы крыс), сравнимая по фармакологической эффективности с преднизолоном. Антифлогистическая активность ацилатов достоверно больше на 5-10%, чем у 3/?-гидрокси-20(30)-тараксастена.
Литературный обзор посвящен разнообразию тритерпеноидов природного происхождения, их биологической активности и химическим трансформациям полициклических тритерпен ов.
Работа выполнялась как плановая в Институте нефтехимии и катализа РАН по теме «Природные и синтетические гетероатомные соединения - выделение, синтез и свойства» регистрационный номер 01.200.204388 (2003-2005) при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант №02-03-97901).
Автор выражает искреннюю признательность Л.М. Халилову, С.А. Башкатову, И.А. Литвинову, Т.П. Парфёновой и Р.Ш. Суфияровой, принимавших участие при выполнении отдельных разделов данной работы. Особая благодарность за активное участие при выполнении данной работы - В.Р. Ахметовой и А.З. Халиловой.
Противовирусные, противоязвенные и другие свойства тритерпеноидов
Особое положение среди пентадиклических тритерпеноидов занимают "гопаноиды". Впервые гопан 64 был выделен в 1955 г. из растения Нореа dammar (Dipterocarpaceae) [45]. Большое удивление вызвали результаты, полученные при исследовании осадочных органических веществ: в сырой нефти и в некоторых осадочных породах были обнаружены, в большом разнообразии, производные гопана - геогопаноиды 65 (более 200 структурных типов). Было установлено, что геогопаноиды являются своеобразными биомаркерами и могут использоватся в качестве показателей зрелости органического вещества или нефтей в недрах земли и морских отложениях.Различные биогопаноиды 66, обнаруженные в микроорганизмах, играют существенную роль в жизнедеятельности бактерий {Acetobacter xylinum, Bacillus acidocaldarius и т.д.), являясь составной частью бактериальных ли-пидов мембран, выполняя в них функцию холестерола [46]. Открытие биого-паноидов привело к рождению гипотезы о биохимической эволюции составляющих липидов мембран [47].
Анализ вышеизложенных данных позволяет охарактеризовать тритер-пеноиды как составляющие биологических объектов: высших растений, морских организмов, бактерий и геохимических отложений земной коры, Разнообразие структур и функциональных групп, взаимосвязь между отдельными классами тритерпеноидов и источниками их накопления раскрывают многие эволюционные и функциональные аспекты происхождения и биосинтеза тритерпеноидов.
Осветить в полной мере и всесторонне биосинтез тритерпеноидов практически невозможно. Существует большое количество научных работ, посвященных данному вопросу [48-54]. Тонкие детали механизмов биосинтеза тритерпеноидов осуществлены на основе генной инженерии с исследованием ферментов-синтаз, кодирующих циклизации сквалена 1 и оксидосква-лена 67 в стеролы и тритерпены [48-50].
Сейчас известно, что ланостерол 3, обнаруживаемый у животных и грибов, и циклоартенол 2 у растений образуются благодаря циклизации (35)-оксидосквалена 67 и, что циклизация инициализирована кислотным катализом за счёт раскрытия кольца окиси этилена с участием соседней тг-связи. В то время как формирование ланостерола 3 и циклоартенола 2 проходит через конформацию кресло-лодка-кресло (35)-оксидосквалена, циклизация пентациклических тритерпенов проходит через конформацию кресло-кресло-кресло. Таким образом, циклизация сначала приводит к образованию тетра-циклического даммаренил С(20)-катиона 68, сопровождаемая в дальнейшем перестройками, формирующими производные а- и/7-амирина [51-52]. Недавно японскими учёными [53] при исследовании молекулярного клонирования тритерпеновых ферментов-синтаз, отвечающих за биосинтез пентациклических тритерпенов, выделенных из гороха Pisum sativum, был предложен следующий путь (схема 4) биосинтеза пентациклических тритерпенов через даммаренил С(20)-катион 68. Метиленовые перегруппировки и дегидрирование даммаренил С(20)-катиона 68 приводит к образованию бутироспермола 69, дегидрирование лупеиил катиона 70 к лупеолу 71. Дегидрирование С(19)-олеанил катиона 72 образует германикол 73, С(18)-олеанил катиона формирует (5-амирин 74 и С(13)-олеанил катиона формирует/7-амирин 75. Подобное дегидрирование С(13) только урсанил катиона 79 образует а-амирин 80. Дегидратация тараксастерил катиона 76 приводит к тараксастеролу 77 и у/-тараксастеролу 78. По мнению авторов, подобные тетрациклические и пента-циклические тритерпеноиды, образованные из такого рода катионных соединений, аналогичным образом формируются в природе. Механизм биосинтеза /?-амирина и а-амирина был подтвержден экспериментами по встраиванию натрий[2-13С2Н3]ацетата-и[5-13С2Н2] -мевалонолактона в клеточные суспензии культуры Rabdosiajaponica с использованием -дейтерового изотопа и выделением промежуточных продуктов эксперимента кислот олеананового и ур-санового типа [54, 55].
Биосинтез соединений мадейранового типа, также происходящий через образование С(20)-даммаренил катиона 68 объясняется авторами [29] на основании биосинтетического изопренового правила Ружички. Характерная циклизация 2,3-оксидосквалена 67 в С(20)-катион даммаренила 68 сопровождается перемещением водорода от С(17) к С(20) приводящим к образованию С(17)-катиону даммаренила 81, который необычно циклизуется, связывая С(17)-катионный центр с С(24) метилиденовой группой, образуя новый С(25)-катион спиродаммаранила 82 (схема 5). Последующий антиперипла-нарный водородный сдвиг от С(24) к С(25) формирует спиродаммаранил С(24)-катион 83, в котором сдвиг С(16)-С(17) связи приводит к образованию С(16)-С(24) связи и сопровождается расширением кольца D и формированием С(18)-катиона мадейранола 84, являющимся базовым каркасом мадейрана 42. Катион 84 при последующих антиперипланарных 1,2-миграциях Н-С(13), Ме-С(]4), и Ме-С(8) образует й-фриэдомадейранол С(14)-катион 85 и D:C-фриэдомадейранол С(8)-катион (86).
Следует отметить, что существенным отличием соединений мадейра-нового типа от типичных представителей лупаиового и гопанового рядов, заключается в необычном расположении заместителей в циклопентан ов ом кольце Е, наличии метальной группы при С(19), изопропильной группы в ан-гулярном положении при С(17) а также цис-сочленении колец D и Е.
Были проведены исследования по изучению сквален-циклазы и окси-доскваленовых ферментов. Исследования Бартона с сотрудниками [56] показали, что эукариотические оксид о сквален-циклазы воспринимали только (3S)- и не воспринимали (Зй)-энантиомеры оксидосквалена в качестве субстрата. Последующие исследования уже на бактериальной сквален-циклазе показали, что эти фермешы проявляют очень низкую субстратную специфичность. Оказалось, что они могут катализировать циклизацию не только самого сквалена, но и (35)- и (ЗІ?)- энантиомеров оксидосквалена [45, 57].
Блох [58] предположил, что в пред биотической атмосфере путь химической эволюции терпенов остановился на стадии сквалена из-за отсутствия кислорода в атмосфере, тогда как биосинтез гопаноидов осуществлялся от сквалена до конечных продуктов и в отсутствие (. При гидратации сквалена или продуктов его циклизации образовывались полигидр оксидированные производные гопаноидов. Кислород требуется не только на стадии циклизации, но и для удаления трёх метальных групп ланостерола 3 или циклоарте-нола (2). Очень важно то, что именно деметилированная циклопентанопер-гидрофенантреновая структура оказалась функционально наиболее соответствующей для построения мембран, поскольку стереохимически нет разницы между холестеролом и ланостеролом 3 или циклоартенолом 2. Предположительно, прокариотические сквален-циклазы уже существовали в анаэробном периоде эволюции и циклизация сквалена 1 через оксидосквален 67 является относительно недавним эволюционным приобретением, которое произошло после эволюции фотосинтетических организмов [59]. В протозоях или бактериях циклизация сквалена 1 в тетрагиманол 87 происходит в процессе перестроек углеродного каркаса молекулы, циклизация в 87 инициализирована протонной атакой терминальной двойной связи с участием молекулы Н20 (схема 6) [60].
Синтез пентациклических тритерпенов и их А-нор производных
Часто химические трансформации тритерпеноидов нацелены на синтез биологически активных аналогов природных тритерпенов, а также на проведение химических модификаций более доступных и распространённых тритерпеноидов с целью получения новых или редко встречаемых соединений. Так, Ваххаб с сотрудниками [118] провёл полный синтез лупановых производных. Трёхстадийным синтезом из бетулина 143 каталитическим гидрированием (Н2, 10% Pd/C) в этилацетате был получен дигидробетулин 144, его окисление пиридинийхлорхроматом (РСС) в СН2СІ2 приводит к кетоальдеги-ду 145, последующее восстановление которого по Кижнеру-Вольфу образует лупан 146 с общим выходом 47.2% (схема 19).
Окисление 145 с помощью КМ11О4 в ацетоне проходило с получением кетокислоты 147, восстановительное декарбоксилирование по радикальному механизму хлорангидрида кислоты 147 в течении 20 мин в системе натрий N-гидроксипиридин-2-тион/трега-бутил меркаптан в бензоле приводило к 3-оксо-28-норлупану (148). Последующее восстановление С(3)-кето-группы 148 по Кижнеру-Вольфу давало смесь (9:1) изомеров 17/?(#)-28-норлупана (149) и \1а(Н). Серией реакций из 148, путём формирования З-оксима-28-норлупана (150) (солянокислый гидроксиламин в пиридине), затем образования из 150 3,4-сэконитрила 151 с помощью/?sCl в пиридине, окисления 151 т-СРВА в хлороформе до эпоксинитрила 152, циклизацией 152 в системе BF3"OEt2 до 3-оксо-24,28-биснорлупана 153 и восстановлением по Кижнеру-Вольфу С(3)-кетона был получен целевой 24,28-биснорлупан 154 (схема 19). Каметани с сотрудниками [119] сообщает о синтезе фриделина 135. Синтез целевого соединения 135 состоит из серии реакций, включающей реакции конденсации, восстановления, декарбоксилирования и т.д. Так, из 2-бром-5-метоксибензальдегида (155) реакцией Кневенагеля получена а-цианокоричная кислота 156, декарбоксилирование и восстановление которой приводит к производному бензоциклобутена 157. Затем циклоприсоединени-ем 157 к изопрену получено производное тетралина 158 состоящее из А и В колец. А конденсация 157 с 2-бромэтоксиТГП образует тетрагидропиранил производное бензоциклобутена 159. Построение колец С, D и Е было проведено путём внутримолекулярного циклоприсоединения бензоциклобутеново-го радикала и внутримолекулярной двойной циклизацией. Из соединения 159 получен йодид 160, конденсация которого с 158 приводит к 2-циано-бензоциклобутенилтетралину 161. Термолиз последнего образует пентацик-лический динитрил 162. Восстановление последнего i-Bu2Al.H даёт диимин, последующее восстановление которого по Кижнеру-Вольфу и каталитическое гидрирование (Н2, Pd/C) ароматических колец приводит к ключевому синтону 163. Авторы предлагают использовать 163 в дальнейшем синтезе фриделина 135 (схема 20).
Джонсон с сотрудниками [120] в 1993 году сообщали о направленном синтезе іі/-/?-амйрина 75, где в качестве основного момента они использовали циклизацию полиолефина имеющего атом фтора в качестве стабилизирую щего катиона (C-S), влияющего на региохимизм циклизации шестичленного С кольца в синтезе 75. На начальном этапе синтеза 75 исходили из фтористо го диенинола 165, полученного с 20% выходом из окиси мезитила 164 в 9 стадий. Перегруппировка транотризамещённого алкена в г./ш изомер сопро вождается эпоксидированием, предварительная защита гидрокси-группы предотвращает циклизацию эфира, образуя mpem-бутил-диметилсилиловый эфир 166. Циклопентенол 167 был получен из 166 с выходом 35% серией ре акций, включающей в себя окисление, алкилирование, бромирование, изомеризацию и т.д. (всего 14 стадий). Кислотно-каталитическая циклизация 167 в присутствии ТФУК в дихлорметане приводит к пентациклическому тритерпену /3,23-динор-13-фтор о-22 винилиден-олеан-4-єну (168), имеющему шесть из восьми хиральных центров /?-амирина 75. Конверсия 168 в 75 сопровождается окислением в присутствии ПиСІз и натрия метай одн оки ел ого до трикетона 169, затем кротоновой конденсацией в тона 169, затем кротоновой конденсацией в присутствии NaOH образуется дикетон 13-фтор 23,24-диноролеана-4-ен-3,22-диона (170) (схема 21). Региоселективное С(13) дегидрофторирование 170 в присутствии SnC]4 даёт С(12)-алкен 23,24-диноролеано-4,12-диен-3,22-дион (171). Последующее селективное восстановление кето-группы в кольце Е, метилирование кольца А приводит к образованию через С(3)-кетон 172 #-/?-амирииа 75 с выходом 26%, с тя да/с-сочлеиением колец А и В (схема 21).
Из рассмотренных превращений тритерпеноидов можно сделать заключение, что синтетические трансформации пентациклических тритерпеноидов распространены и представляют интерес для получения фармакологически значимых аналогов. Широко используются трансформации тритрепеноидов путём окисления перкислотами, Se02, причём использование Se02 упоминается реже несмотря на лучшие выхода и окислительную способность. Редко упоминается озонирование тритерпеноидов, особенно пентациклических, хотя это удобный и эффективный способ внедрения кето-групп в исследуемое соединение. Также возможен и полный химический синтез тритерпеноидов [121, 122], хотя сам процесс получения, как правило, многостадиен и трудоёмок. На основании анализа литературных данных установлено, что пента-циклические тритерпеноиды тараксастанового типа - тараксастерол и тарак-састерилацетат - мало изучены на предмет их химических трансформаций, несмотря на их разнообразную биологическую активность. Следовательно, зная о широком фармакологическом действии данных тритерпеноидов, актуальным является выделение их из растений с приемлемым общим выходом, разработка путей эффективной функционализации природных тритерпенов и определение их биологической активности, что послужило предметом исследования данной диссертационной работы.
Вероятный маршрут биосинтеза выделенных тритерпеноидов в растении Onopovdum acanthium L.
В народной медицине татарник колючий имеет широкое применение. Надземную часть применяют при различных заболеваниях кожи [123], как кардиотоническое и антигипотензивное средство [124], при болезнях моче-выделительной системы [125], в реабилитационный период при злокачественных новообразованиях кожи и матки [126]. Из литературных данных известно, что в листьях татарника колючего содержатся сесквитерпеновые лак-тоны арктиопикрин и онопордопикрин [127, 128], а в семенах - тритерпено-вые спирты лупеол и амирин с их ацетатами [129].
Как правило, большинство известных способов выделения пентацик-лических тритерпеноидов основано на экстракции их из натурального сырья различными растворителями. Так, в работе [130], выделение тритерпеноидов из корней Centaurea ptosimopa.ppoid.es производили путем измельчения воздушно-сухого сырья с последующей экстракцией смесью растворителей СбНй-Еі20-ЕЮН в соотношении (1:1:1) при комнатной температуре в течение 48 ч. Полученные фракции хроматографировали на колонке с силикагелем, Недостатком этого метода является состав растворителей, используемый для экстракции тритерпеноидов из растительного сырья и, как следствие, невысокие выхода тритерпеноидов (-0.002% на воздушно-сухое сырье).
Согласно способу [131, 132], первичную экстракцию надземной части растений проводили МеОН при комнатной температуре в течение недели, затем после удаления растворителя, получали смолообразный метанольный остаток, который растворяли в воде (1:1) и водный экстракт последовательно промывали С6Н]2, ЕЮАс и л-ВиОН (150 мл х 3). Затем бутанольный экстракт упаривали и хроматографир овали на колонке с силикагелем, с последующей рехроматографией выделенных фракций. Многостадийно сть данного метода, низкий выход тритерпеноидов (-0.004% на воздушно-сухое сырьё), а также использование большого количества растворителей не перспективно для практического применения.
Известно [133, 134] о извлечении тритерпеноидов урсанового, лупано-вого и тараксастанового ряда, вышеуказанным методом дифференциальной экстракции из растений Chinese Changzhu и Viburnum sargentii Koehne,, где для первичной экстракции сырья использовали ацетон вместо метанола. Ранее [129] из гексанового экстракта (полученного экстракцией при комнатной температуре методом настаивания) семян растения татарник колючий Onopordum acanthium L. была выделена смесь тритерпеновых спиртов - а-амирин и лупеол с их ацетатами.
Выделение пентациклических тритерпеноидов из растений Onopordum acanthium L., произрастающих на территории республики Башкортостан (Туймазинский район) проводили по разработанному нами способу [135], основанному на применении многократной экстракции высушенного растения с последующей КХ полученного экстракта на силикагеле, импрегниров айном AgN03. Преимуществом данного метода является использование в качестве экстрагента хлороформа, что позволяет увеличить суммарный выход экстракта, и как следствие получить максимальное количество тритерпеноидов по сравнению с другими исследованными растворителями (гексан, этанол, бутанол, метанол и ацетон), Надземную часть татарника колючего (отдельно - листья, соцветия и стебли) высушивали в тени при 30-35С (остаточная влажность сырья 8.3-11.6%), затем измельчали с помощью электрического гомогенизатора и экстрагировали хлороформом (100 г сырья, 400 мл х 5). Полученный экстракт концентрировали упариванием на роторном испарителе до трети первоначального объёма, из которого полярные вещества извлекали 70%-ным этиловым спиртом (150 мл х 3). Обработанный хлороформный остаток затем концентрировали, и разделяли методом КХ на Si02, используя градиентное элюирование системой w-C6H14-EtOAc. При этом выделили три фракции А, В и С.
Фракция А (0,5%) хлороформного экстракта листьев татарника колючего содержала смесь высших н-алканов (элюент н-Сб&\$-ЕЮАс, 20:1, Rf=0.83). В ИК-спектре присутствовали полосы валентных СН-, СН2-колебаний в области 1370, 1470, 2830 и 2910 см"1. В спектре ЯМР ]Н химические сдвиги протонов наблюдались в области сильного поля, в виде уширенного триплета концевых метальных групп при 0.86 м.д. ( тсн=7 Гц) и интенсивного сигнала метиленовых групп в области 1.16 - 1.28 м.д. В спектре ЯМР 13С наблюдался характерный набор сигналов в сильном поле при 14.16 (2С, СН3), 22.69 (2С, СН2), 29.43 (2С, СН2), 29.76 (13С, СН2), 31.64 (2С, СН2). Согласно данным ГХ-МС анализа смесь содержала H-C2TH5 «-С Нбо, H-QHH64 В соотношении 1:3:2.6.
Фракция В (0.2%) хлороформного экстракта листьев по данным спектров ЯМР Н и ПС, представляла собой смесь тритерпеновых спиртов: тарак-састерола 1, /ї-амирина 2, а-амирина 3, лупеола 4 (элюент к-С6Н!4-ЕЮАс, 10:1, Rf=0.31-0.48), трудноразделимую методом КХ. Идентификация смеси спиртов 1-4 проводилась по описанным спектральным характеристикам. Соотношение спиртов 1, 2, 3, 4 в смеси (12:4:2:1) определялось по интегральным интенсивностям характеристичных тест-сигналов протонов двойных связей концевых метилиденовых групп и метановых протонов эндоцикличе-ских двойных связей в спектрах ЯМР Н.
Фракция С (1%) хлороформного экстракта листьев представляла собой индивидуальный тараксастерол 1 (элюент н-СбНн-ЕЮАс, 10:1, Rf=0.48). Идентификацию проводили сравнением с литературными данными ТСХ, ИК, ЯМР Ни 13С спектроскопии. Фракция А (0.55%) хлороформного экстракта цветоложа цветков растения содержала смесь высших алканов состава Н-С27Н56, н-С29Нбо, н-СзіН6«і.
Фракция В (0.38%) хлороформного экстракта цветоложа цветков по данным спектров ЯМР Н и 3С, представляла собой смесь тритерпеновых ацетатов: тараксастерилацетата 5, ацетата /7-амирина 6, ацетата а-амирина 7 и лупеолацетата 8 (элюент H-C6H,4-EtOAc, 15:1, Rf=0.35-0.49). Идентификация смеси ацетатов 5-8 проводилась по известным спектральным характеристикам. Соотношение ацетатов 5, 6, 7, 8 в смеси составило 12:4:2:1.
Фракция С (1.5%) хлороформного экстракта цветоложа цветков представляла собой индивидуальный тараксастерилацетат 5 (элюент н-С6Н,4-EtOAc, 15:1, Rf=0.49). Идентификацию проводили сравнением с литературными данными ТСХ, ИК, ЯМР Н и 13С спектроскопии.
При разделении хлороформного экстракта цветоложа цветков татарника колючего на хромато графической колонке с 8іОг пропитанным 5%-ным водным раствором AgN03 [136] выход тараксастерилацетата повышается до 2.8% (на вес воздушно-сухого сырья), превышая выход 5 при хроматографи-ческом разделении на колонке с обычным необработанным S1O2 (выход составлял 1.5%о на вес воздушно-сухого сырья) и выход пентациклических три-терпеноидов, приведённый в литературе [123-128], при выделении из других растений.
Рентгеиоструктурное и рентгенофазовое исследование кристаллов тараксастерилацетата
Генетическим предшественником терпеноидов является мевалоновая кислота, которая под действием фермента мевалонаткиназа фосфорилируется до изопентенилпир о фосфата и олигомеризуется до фарнезилп про фосфата. Конденсация двух молекул фарнезилпирофосфата по типу голова к голове приводит через сквален к образованию сквален-2,3-эпоксида 9 [53]. Циклизация эноксида 9 приводит к образованию тетрациклического даммаренил ка 57 тиона 10, последующая циклизация боковой цепи которого завершается образованием лупенил катиона И. Прямое дегидрирование лупенил катиона 11 приводит к лупеолу 4. Перегруппировка в 11 с расширением кольца Е до шестичленного приводит к образованию С(13)-олеанил катиона 12, дегидрирование которого даёт /?-амирин 2. В результате 1,2-метильного сдвига в 12 образуется тараксастерил катион 13 дегидратация метильной группы при С(20) которого приводит к тараксастеролу 1. Перегруппировка катионного центра в 13 с С(20) на С(13) приводит к образованию урсанил катиона 14, дегидрирование которого завершается образованием ot-амиринаЗ (схема 1).
За несколько лет наблюдений за растением татарник колючий Onopordum acanthium L., под цветоложе цветков было найдено большое количество личинок насекомых из семейства настоящие мухи Muscidae, род луковые мухи Choriophila, которые активно питаются цветоложем растений. Как видно из таблицы 1 в цветоложа татарника колючего содержится наибольшее количество тараксастерил ацетата 5, что, вероятно, объясняет хемо-коммуникационное взаимодействие биологической пары «растение-хозяин и насекомое». Учитывая структурную и генетическую близость тритерпенои-дов и стероидов молено предпололшть, что соединение 5 участвует в процессах метаморфоза этих насекомых, также как экдистероиды, например, для гусениц тутового шелкопряда.
Изложенные выше данные свидетельствуют о том, что тритерпеноиды в больших количествах обнаруживаются в тех органах и тканях растения, которые интенсивно функционируют или содержат большое количество делящихся клеток: хлоропласты, меристематические участки, семена и т.д. В зависимости от физиологического состояния растения содержание тритерпе-ноидов и скорость их биосинтеза изменяется в достаточно больших пределах. Можно предположить, что они включаются в метаболизм в процессе роста и развития растения, выполняя еще не изученные до настоящего времени регу-ляторные функции, что указывает на то, что соединения этого класса не являются просто балластными веществами.
Учитывая доступность тараксастерола 1 и его ацетата 5 из Onopordum acanthium h., а таюке биологическую активность некоторых производных соединений 1 и 5, представлялось перспективным исследовать химические трансформации с целью поиска эффективных путей синтеза биологически активных веществ на основе соединений 1 и 5,
В настоящее время из химических трансформаций тритерпеноидов та-раксастанового типа в основном известны лишь реакции по двойной связи кольца Е и по 3/?-положению кольца А [107]. Нами установлено, что А20 двойная связь обладает низкой реакционной способностью в реакциях присоединения. Из рассмотренных в литературном обзоре превращений соединений 1 и 5 сообщалось, в основном, об окислительных трансформациях, приводящих в большинстве случаев к смеси продуктов [103]. Нами исследована реакционная способность функциональных групп в 3/?-положеиии и при атоме С(20) в 20(30)-тараксастенах.
Поскольку не ослабевает интерес к азатерпеноидам ввиду их цитоток-сической, антибактериальной и фунгицидной активностей [111, 115, 147-149], проведён целенаправленный синтез азотсодержащих тараксастанов на основе Зу?-гидрокси-20(30)-тараксастена 1. Для этой цели мы использовали 3-оксопроизводное, которое было легко получено окислением 1 с помощью РСС в СН2С12 (25С, 3 часа). Образование тараксаст-20(30)-ен-3-она 15 подтверждается появлением характерного сигнала кето-группы при С(3) с 5 217.89 м.д. в спектре ЯМР ,3С.
Тараксастановые оксимы и их производные ранее описаны не были. Нами установлено, что при взаимодействии 3-оксо-20(30)-тараксастена 15 с солянокислым гидроксиламином в пиридине образуется смесь изомерных тараксастановых оксимов - E/Z- 16 (2:1), что следует из соотношения интен-сивностей сигналов С(3) с 5 167.00 м.д. -изомера и 5 166.89 м.д. 2-изомера в спектре ЯМР 13С (схема 2).
Перегруппировка Бекмана является удобным способом получения различных N-замещёниых карбоксилированых аминов. Установлено, что для изомерных оксимов 16 перегруппировка Бекмана под действием SOCb в абсолютном диоксане протекает по реакции второго рода и сопровождается де-циклизацией кольца А с образованием нитрила 17. Обнаружено, что из Е и 2-оксимов 16 образуется смесь (2:1) 3,4-секо-5(/й) нитрилов 17, что следует из соотношения интенсивностей сигналов атомов углерода метилиденовой группы кольца А при С(4) с 8 147.01 и б 146.87, при С(24) с 5 114.07 м.д. и 5 113.94 м.д., а также появлением сигнала C=N фрагмента с 5 120.31 м.д. в спектре ЯМР 13С. В спектре ЯМР !Н наблюдается расщеплённый мультиплет метиленовых протонов при С(2) с о 2,14-2.41 м.д., отвечающий Н(2)-Н(2 ) части сильно связанных протонных систем Н(2)-Н(2 УЩ1 ) Н( 10 для двух сте-реоизомеров (схема 2).
При исследовании гидролиза соединения 5 установлено, что омыление в условиях (1 н NaOH в МеОН, 60С, 24 ч) приводит к соединению 1 с выходом 82%. Полученный спирт 1 идентичен по физико-химическим константам и спектральным данным (т.пл., [a]D, ЯМР Ни С) нативному тараксастеролу 1 (схема 3). Ацилирование нативного 1 Ас20 в пиридине приводит к получению тараксаст-20(30)-ен-3/?-ил ацетату 5 с конверсией 30%. Применение более сильного ацилирующего агента СН3СОС1 в пиридине, в присутствии каталитических количеств JV-диметиламинопиридина и увеличение времени реакции до 48 ч позволяет повысить выход соединения 5 до 84%. Синтезированный ацетат 5 идентичен по физико-химическим константам и спектральным данным (т.лл., [a]D, ЯМР Н и ,3С) нативному тараксастерилацетату 5 (схема 3).
