Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Современная классификация и основные дифференциальные признаки микобактерий 9
1.2. Общая характеристика морфологии микобактерий, их циркуляции, патогенности и устойчивости во внешней среде 12
1.3. L-трансформация микобактерий под влиянием различных факторов 20
1.4. Биологические свойства L-форм микобактерий возникших in vitro и invivo 23
1.5 Методы индикации и культивирования типичных и измененных (L-) форм микобактерий 25
1.6. Заключение по обзору литературы 33
2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 35
2.1. Материалы и методы исследования 35
2.2. Распространенность и видовой состав L-форм микобактерий, изолированных из объектов внешней среды 40
2.3. Изыскание новой питательной среды (ПС-1), для ускоренной изоляции L-форм микобактерий из биоматериала от лабораторных и сельскохозяйственных животных 47
2.3.1. Сравнительная характеристика солевых растворов, взятых за основу питательных сред 47
2.3.2. Характеристика используемых углеводородов 55
2.3.3. Изучение влияния предельных углеводородов на рост L-форм микобактерий полученных из музейных культур 55
2.3.4. Изучение влияния углеводородов на скорость выделения L-форм микобактерий из биологического материала от лабораторных животных 60
2.3.5. Выделение L-форм микобактерий из биологического материала от крупного рогатого скота на питательной среде с солевым раствором Хенкса 64
2.4. L-трансформация патогенных и атипичных микобактерий под действием химических веществ 66
2.4.1. L-трансформация с использованием модифицированной питательной среды И.Р. Дорожковой 66
2.4.2. L-трансформация с использованием питательной среды ВНИИБТЖ (ПС-1) 72
2.5. Культурально-морфологические свойства L-форм микобактерий, полученных под воздействием дезинфектантов и лекарственных средств 75
2.6. Вирулентные и сенсибилизирующие свойства L-форм микобактерий 85
2.7. Динамика реверсии L-форм патогенных и атипичных микобактерий in vitro и in vivo 88
3. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 93
4. ВЫВОДЫ 104
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 106
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 107
ПРИЛОЖЕНИЕ 127
- Современная классификация и основные дифференциальные признаки микобактерий
- L-трансформация микобактерий под влиянием различных факторов
- Материалы и методы исследования
Введение к работе
Актуальность проблемы. Диагностика является одним из основных звеньев как профилактических, так и оздоровительных мероприятий при туберкулезе животных, в том числе крупного рогатого скота. Арсенал средств и методов диагностики туберкулеза достаточно богат и разнообразен.
Основными методами первичной диагностики туберкулеза животных в настоящее время являются аллергический, патологоанатомический и бактериологический, результаты, которых предопределяют окончательный эпизоотический статус исследуемого поголовья животных, а также в целом фермы или хозяйства (А.С. Донченко с соавт., 1994, 2004; К.В. Шумилов, Н.П. Овдиенко, А.Х. Найманов и др. 2002; В.И. Околелов, 2000, 2002; Л.А. Таллер, 1995, 2001 и др.). Заболевание туберкулезом считается установленным, если подтверждается данными патологоанатомической экспертизы, а при отсутствии характерных для туберкулеза видимых изменений - положительными результатами бактериологического исследования. Бактериологическое исследование, в свою очередь, осуществляется бактериоскопическим, культуральным и биологическим методами.
Вместе с тем, выделение микобактерий туберкулеза из патологического материала связано с определенными трудностями в силу генетических и фенотипических особенностей возбудителя. Основные из них — медленный рост на искусственных питательных средах и способность к L-трансформации и длительной персистенции возбудителя в измененной (L-) форме. L-трансформация микобактерий может происходить под воздействием самых различных факторов внешней среды, применяемых химиопрепаратов, защитных реакций организма (З.Н. Кочемасова, М.Н. Дыхно с соавт., 1980; B.C. Федосеев с соавт., 1975, 1981; В.Г. Ощепков с соавт., 2001, 2003 и др.). При этом микробная клетка частично или
полностью утрачивает свою клеточную стенку. Изменение морфологии микобактерии и понижение метаболизма предполагают и особые требования к условиям культивирования их L-форм, так как они либо вообще не растут на обычных питательных средах, применяемых при лабораторной диагностике туберкулёза, либо растут лишь отдельные культуры. Необходимы щадящие методы обработки биоматериала и элективные питательные среды, в которых обязательно присутствуют нативные белки и вещества, стабилизирующие осмотические свойства среды (B.C. Федосеев, 1975; Л.В. Галатова, 1993; Ю.А. Макаров, 1997 и др.). В настоящее время в ветеринарной и медицинской практике для выделения L-форм микобактерии из исследуемого материала используют полужидкую питательную среду Школьниковой в модификации Дорожковой (И.Р. Дорожкова с соавт. 1974, Ю.А. Макаров, 1997; Наставление по диагностике туберкулеза животных, 2002, 2004). Однако эта среда обладает сравнительно низкой информативностью (Л.А. Таллер, 2001), то есть позволяет изолировать из биоматериала и объектов внешней среды патогенные микобактерии лишь в малом количестве. Более того, эта среда не пригодна для экспериментального получения и длительного культивирования L-форм, требуемых для проведения научных опытов. Не решают этих проблем и другие известные нам питательные среды, предложенные для изоляции L-форм патогенных микобактерии: Н.П. Овдиенко, Е.А. Асташова, B.C. Суворов, 1995; Г.Г. Мордовской и Е.А. Птицина, 1982 и др..
Актуальность усовершенствования существующих питательных сред для изоляции, экспериментального получения и длительного культивирования L-форм патогенных микобактерии, а также отсутствие необходимых научных сведений о распространенности явления L-трансформации у патогенных и атипичных микобактерии, обнаруживаемых во внешней среде, и предопределили направленность нашей работы.
Цель исследований. Изучить распространенность L-форм микобактерий во внешней среде, а также динамику их образования и свойства при культивировании на разных питательных средах.
Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:
изучить распространенность L-форм микобактерий в различных объектах внешней среды и их видовой состав;
определить динамику образования L-форм патогенных и атипичных микобактерий под воздействием химических препаратов;
разработать новые питательные среды и способы для ускоренной изоляции, экспериментального получения и длительного культивирования L-форм микобактерий и провести их сравнительную оценку;
изучить сенсибилизирующие, реверсибельные и вирулентные свойства L-форм патогенных и некоторых видов атипичных микобактерий.
Научная новизна.
Полученные данные расширяют представление об условиях и видовом составе микобактерий, способных к L-трансформации; о способах существования и биологических свойствах патогенных и атипичных микобактерий и должны учитываться при разработке общей теории инфекционного и эпизоотического процессов туберкулеза животных.
Найден более надежный способ предпосевной обработки биоматериала при изоляции L-форм патогенных и атипичных микобактерий.
Получены патент «Питательная среда для выделения и
культивирования L-форм микобактерий туберкулеза» патент РФ № 2242511 от 20.12.2004 г. и решение ФИПС о выдаче патента «Способ реверсии L-форм микобактерий» № 2004113930/13(023123) от 02.11.2005 г.
Дана сравнительная оценка питательных сред И.Р. Дорожковой и ВНИИБТЖ.
7 Практическая значимость и внедрение результатов исследований.
Разработанная питательная среда ПС-1 и способ предпосевной обработки исследуемого биоматериала позволяют сократить сроки появления первичного роста L-форм микобактерий, что ускоряет проведение комплекса бактериологической диагностики туберкулеза в 1,5-2 раза. Результаты исследований использованы при составлении методических рекомендаций по изоляции и идентификации L-форм микобактерий из биоматериала животных (2005 г.), а также при подготовке ветеринарных специалистов в ИВМ ОмГАУ.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на ученых советах ВНИИБТЖ (г. Омск, 1999 - 2005 гг.), координационных совещаниях, проходивших в НИИЭВ (г. Москва, 2003-2005 гг.), на научных конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов института ветеринарной медицины ОмГАУ (2000, 2001 гг.), на конференции молодых ученых ВНИИБТЖ (г. Омск, 2000 г.), на «Всероссийской научной конференции по проблемам хронических инфекций», ВНИИБТЖ (г. Омск, 2001 г.), Международной научно-практической конференции «Современные проблемы диагностики и профилактики туберкулеза животных» (г. Москва, 2003 г.). Основные положения диссертации, выводы и практические предложения доложены, обсуждены и рекомендованы к защите на межлабораторном заседании сотрудников ВНИИБТЖ (2005 г.). Основные положения, выносимые на защиту;
1. Видовой состав и распространенность L-форм микобактерий во
внешней среде.
2. Динамика образования L-форм патогенных и атипичных
микобактерий под действием химических веществ.
3. Разработка и перспективность применения питательных сред ПС-1 и ПС-2 для изоляции и изучения биологических свойств L-форм патогенных и атипичных микобактерий.
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 8 научных статей и описание патента РФ на питательную среду ПС-1 (ВНИИБТЖ).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах компьютерного набора и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, списка использованной литературы и приложения. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 17 рисунками. Список литературы включает 184 источника, в том числе 47 иностранных авторов
Современная классификация и основные дифференциальные признаки микобактерий
Возбудитель туберкулеза был открыт немецким ученым Р. Кохом в 1882 г. В начале его назвали бациллой Коха (БК). В дальнейшем микобактерии туберкулеза были выделены от больных людей, многих видов животных и птиц. Со времени открытия систематика туберкулезных и других кислотоустойчивых микобактерии и по настоящее время остается, к сожалению, несовершенной (Е.Л. Головлев, 1998).
Микобактерии являются обширной группой микроорганизмов, которые по своим морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам отнесены к порядку Actinomycetales, семейству Mycobacteriaceae, к роду Mycobacterium (Грассели Дж., 1984).
Род микобактерии включает 30 самостоятельных видов, кроме того, имеются несистематизированные виды (С.А. Гулевская, Е.В. Милованова, 1977). Некоторые исследователи (Q. Kubica, 1979 и др.) насчитывают около 200 несистематизированных видов.
Микобактерии туберкулеза теплокровных животных и человека (определитель D. Bergey, 1980) по вирулентности, культурально-биологическим и биохимическим свойствам разделены на 4 вида:
М. tuberculosis - возбудитель туберкулеза человека,
М. bovis - возбудитель туберкулеза рогатого скота,
М. avium - возбудитель туберкулеза птиц,
М. microti (OVS, bkb Oxford vole strain) - возбудитель туберкулеза полевых мышей. Последний вид некоторые исследователи рассматривают, как вариант бычьего, адаптировавшийся в организме полевой мыши.
В настоящее время к патогенным микобактериям относят также виды М. poykilothermorum - паразитирующий у холоднокровных (лягушки, рыбы, змеи и т.п.), М. paratuberculosis - возбудитель паратуберкулеза, М. leprae — возбудитель проказы и М. africanum - возбудитель туберкулеза на африканском континенте.
Согласно современной классификации (www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxomomy/wgetorg) в группу Mycobacterium tuberculosis complex входят следующие виды и подвиды микобактерий:
Mycobacterium tuberculosis complex
- Mycobacterium africanum
- Mycobacterium bovis
- Mycobacterium bovis subsp. bovis
- Mycobacterium bovis subsp. bovis AF 2122/97
- Mycobacterium bovis subsp. caprae
- Mycobacterium canettii
- Mycobacterium microti
- Mycobacterium pinnipedii
- Mycobacterium shottsii
- Mycobacterium tuberculosis
- Mycobacterium tuberculosis 210
- Mycobacterium tuberculosis CDC 1551
- Mycobacterium tuberculosis H37Rv
- Mycobacterium tuberculosis subsp. Tuberculosis
- Mycobacterium sp. 9502227
- Mycobacterium sp. N256
- Mycobacterium sp. N405
- Mycobacterium sp. N406
Кроме этих, истинно патогенных видов, в природе существует большая группа, так называемых, атипичных (условно патогенных) микобактерий, которые не вызывают, как правило, у человека и животных сильных патологий, но часть видов (М. smegmatis, М. fortuitum и др.) способны индуцировать у животных аллергические реакции, выявляемые туберкулином, а у человека локальные поражения кожи и легких (Л.П. Бараускене, 1977; А.С. Донченко, В.Н. Донченко, 1994; К.В. Околелов, 2003; www.tuberculosis.ru/sci-pubs-l.pdf и др.).
На сегодняшний день отсутствует научная классификация микобактерий, полностью учитывающая как фено -, так и генотипические их особенности.
Наиболее распространенной рабочей классификацией атипичных микобактерий остается классификация по Е. Ranyon (1959), который выделил 4 группы:
группа 1 - фотохромогенные микобактерий, характерным признаком которых является пигментация колоний после экспозиции культуры на свету. Типичным представителем этой группы является М. kanzasii.
группа 2 - скотохромогенные, отличительной особенностью их является образование желто-оранжевого пигмента в темноте. Эта самая большая группа среди атипичных микобактерий (60-70%).
группа 3 - нефотохромогенные, представители этой группы имеют слабую пигментацию или непигментированы.
L-трансформация микобактерий под влиянием различных факторов
Вопрос изменчивости микробов является одним из главных в современной микробиологии. Основы учения об изменчивости микробов были заложены И.И. Мечниковым, связавшим изменчивость микробов с приспособлением их к различным условиям существования (цитировано по П.А. Вершиловой, 1975).
К измененным формам бактерий, имеющим значение в патологии человека и животных, относятся различные варианты, дефектные по морфологическим или биохимическим свойствам. Повреждения, связанные с дефектом, клеточной стенки, обычно приводят к значительным морфологическим и функциональным изменениям, проявляющимся в появлении протопластов, сферопластов, форм гетероморфного роста и L-форм бактерий стабильных или нестабильных (В.Д. Тимаков, Г.Я. Каган, 1973; Ю.К. Вейсфеллер, 1975 и др.).
Первые сообщения в нашей стране о способности бактерий существенно изменять морфологию и существовать в измененном состоянии довольно длительное время были сделаны Н.Ф. Гамалея ещё в 1894 году. Он описал формы гетероморфного роста холерного вибриона, полученные под влиянием литиевых солей. Впервые L-формы, или большие тельца, обнаружила Клинеберг Нобл в 1935 г. в культурах Streptobacilles moniliformes и назвала эти варианты микроорганизмов L-формами. В 1939 г. L.Dienes подтвердил, что L-культуры S.moniliformes — новый морфологический вариант. Вскоре было установлено, что эти формы являются потомками типичных бактерий и способны возникать либо спонтанно, либо после воздействия когого-либо фактора.
L-формы представляют собой измененные варианты микроорганизмов, утративших частично или полностью клеточную оболочку (стенку) или способность к ее формированию, но сохраняющих способность расти и размножаться в условиях питательной среды, обладающих потенциальной способностью к реверсии в исходные бактериальные формы. Они являются закономерной, своеобразной формой адаптации микроорганизмов к изменившимся условиям среды обитания (СВ. Прозоровский, 1981; В.Д. Тимаков, Г.Я. Каган 1973). В составе L-колоний имеются разнообразные по форме, консистенции и размерам микроструктуры: сферические тела, элементарные тельца или гранулы, извитые и нитевидные структуры (В.Д. Тимаков, Г.Я. Каган, 1983). Т. Hybrid, L. Dienes (1953), R. Fuluse (1960) рассматривают такие структуры колоний как промежуточные формы между L-формами и обычными бактериальными.
Вариабельность морфологической структуры, характера роста на питательных средах, способности воспринимать окраску, особенностей размножения, биохимизма обмена веществ, антигенной структуры и патогенности, склонность к стабилизации и реверсии составляют, видимо основу существования всех бактерий. Измененные формы бактерий, имеющие дефекты клеточной стенки, заслуживают особого внимания, так как знания о них актуальны не только в теоретическом отношении, но и для решения ряда практических задач, в частности, диагностики этого заболевания (B.C. Федосеев, 1980).
Всесторонним изучением возбудителя туберкулеза также неоспоримо доказаны многообразие форм его существования, чрезвычайно большая вариабельность его морфологии и широкий диапазон изменчивости его биологических свойств.
Что касается микобактерий туберкулеза, то в отечественной литературе их L-формы, как таковые, впервые были получены in vitro и описаны З.Н. Кочемасовой и др. в 1965-1980 гг. В зарубежной литературе первые сообщения по L-формам микобактерий были опубликованы М. Rubio-Huertos (1957) и L. Mattman с соавт. (1960) (цитировано по СВ. Прозоровскому, 1981).
В дальнейшем в отечественной и зарубежной литературе появились многочисленные сведения о L-трансформации микобактерий под влиянием самых различных факторов. И.Р. Дорожкова (1972) описала индукцию L-форм микобактерий под влиянием циклосерила и его производных. Затем А.В. Волк с соавт. (1973) сообщила об образовании L-форм микобактерий под влиянием этамбутола.
Описана L-трансформация под действием пенициллина, стрептомицина и дегидрострептомицина (СВ. Прозоровский с соавт., 1981; З.Н. Кочемасова, 1980; Б.Ф. Керимжанова, Г.Т. Шейко (1983)). И.Р. Дорожковой предложен метод получения сферопластов микобактерий при помощи лизоцима и лаурил-натрия сульфата. Ю.А. Макаровым (1997) описана спонтанная L-трансформация в организме лабораторных животных, a B.C. Федосеевым с соавт. в организме сельскохозяйственных животных. Т.И. Бейтерякова, И.Н. Рубцова (1982); Л.В. Галатова, В.Г. Ощепков (2001) выявляли спонтанные L-формы микобактерий во внешней среде. А.С Донченко, В.Н. Донченко (1994) описали L-трансформацию М. bovis под воздействием ниазона. Б.И. Коган (1990 г.) наблюдал образование L-форм микобактерий под воздействием альдозона в концентрации от 0,1 до 1 мкг/мл среды. Сведений о L-трансформации под влиянием химических веществ, применяемых для дезинфекции животноводческих объектов при туберкулезе, мы в литературе не нашли.
Материалы и методы исследования
Работа выполнялась в лаборатории клеточной биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института бруцеллеза и туберкулеза животных (ВНИИБТЖ) в соответствии с заданием 02.01.09. «Разработать теоретические и практические основы молекулярно-генетической диагностики туберкулеза животных, индикации и идентификации микобактерий из различных объектов». Электронно-микроскопические исследования проводились в лаборатории электронной микроскопии института ветеринарной медицины Омского Аграрного Университета (ИВМ ОмГАУ). Биологический материал для исследования отбирали в хозяйствах Омской, Новосибирской областей с различным эпизоотическим состоянием по туберкулезу животных, а также на Омском мясокомбинате в период с 1998 по 2005 гг.
Для проведения биологических исследований использовали лимфатические узлы и кусочки паренхиматозных органов от 120 голов крупного рогатого скота и 56 морских свинок. Кроме этого, с целью изучения распространенности и видового состава, полевых L-форм микобактерий на территории Омской, Челябинской, Курганской, Кустанайской областей было отобрано и исследовано совместно с сотрудниками кафедры эпизоотологии и организации ветеринарного дела УралАВМ (Л.В. Галатова и др.) 223 пробы из объектов внешней среды (кормовые проходы, кормушки, поилки, скопления навоза и др.).
Для экспериментальной L-трансформации были использованы культуры музейных штаммов: М. bovis шт. 8, М. bovis шт. 14, М. avium шт. 9, М. smegmatis, М. phlei, М. intracellularae.
L-трансформацию проводили двумя способами: с использованием лекарственного препарата и дезинфектантов.
В опытах с лекарственным препаратом использовали изониазид. Препарат добавляли в среду Школьниковой в модификации Дорожковой непосредственно перед посевом биологического материала в следующих концентрациях: 0,01-20 мкг/мл. среды. Далее приготовленный посевной материал засевался на пробирки с вышеуказанной питательной средой. Посевы помещались в термостат при 37. Наблюдение за посевами проводили 1 раз в сутки до появления видимого роста, затем 1 раз в неделю. При появлении роста готовили мазки, которые просматривали под фазовым контрастом светового микроскопа, при наличии L-форм в исследуемом материале проводили пересев культур на питательную среду Дорожковой с повышенным содержанием L-трансформирующего препарата.
Дезинфектанты подбирали с учетом их использования в лабораторных и производственных условиях: 1) щелочной раствор формальдегида в 3%-ной концентрации, 2) едкий натр в концентрации 3%, 3) хлорамин Б 0,5-1%, 4) карболовая кислота - 5%-ный раствор. Опыты по L-трансформации под действием вышеназванных веществ проводили согласно методическим указаниям о порядке испытания новых дезинфицирующих веществ для ветеринарной практики (1976 г.).
Музейные культуры микобактерий выращивались на плотной среде Гельберга, ФАСТ-ЗЛ, Левенштейна-Иенсена. Затем из них готовили суспензию с физиологическим раствором до концентрации микробных тел равной 10 Ед. по оптическому стандарту мутности. Суспензией микобактерий обрабатывались батистовые тест-объекты и погружались в дезинфекционный раствор на 10, 20, 30 мин., 1-3 часа. По истечении экспозиции тест-объекты извлекали из раствора, отмывали в стерильной дистиллированной воде 5 мин. или в соответствующем нейтрализующем растворе (0,5% раствор уксусной кислоты и смесь 0,3% раствора нашатырного спирта и 0,3% уксусной кислоты) в зависимости от используемого дезинфектанта и засевали в пробирки со средой Дорожковой и на питательные среды, разработанные во ВНИИБТЖ (ПС-1и ПС-2).
Посевы инкубировали в термостате при 37С в течение 30 дней. Просмотр проводили ежедневно до появления первичного роста, далее 1 раз в неделю. Одновременно с опытом ставили контроли. В качестве контроля служили эти же культуры, не обработанные дезинфектантами, но для чистоты эксперимента выдержанные в дистиллированной воде с экспозицией соответствующей опытным культурам.
