Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Фуллерен и фото динамическая инактивация вирусов 12
1.1. Фотосенсибилизируемые реакции 12
1.2. Фотодинамическая терапия, активные формы кислорода 14
1.3. Инактивация вирусов в плазме и препаратах плазмы крови 18
1.4. Фотосенсибилизаторы: фуллерен или красители 23
1.5. Функционализированные фуллерены 26
1.6. Особенности применения твердофазных фотосенсибилизаторов 27
1.7. Влияние степени агрегации молекул фуллерена на времена жизни уровней Ті и Si 28
1.8. Влияние агрегации молекул фуллерена на генерацию активных форм кислорода 35
1.8.1. Снижение квантового выхода синглетного кислорода при агрегации молекул фуллерена 35
1.8.2. Образование радикалов фуллерена 36
1.9. Выводы 38
Глава 2. Разработка и получение твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллеренов. Изучение их структурных свойств 41
2.1. Введение 41
2.2. Методическая часть 42
2.3. Электронные спектры поглощения фуллеренов и агрегация 43
2.4. Получение и структурные свойства суспензии раздробленного кристаллического фуллерена в воде 49
2.5. Получение и структурные свойства водной суспензии «аморфного» фуллерена 54
2.6. Покрытия на основе фуллеренов на плоских поверхностях 63
2.7. Фуллерены, нанесенные на микрочастицы силикагеля 64
2.8. Выводы 69
Глава 3. Генерация синглетного кислорода твердофазными фотосенсибилизаторами на основе фуллерена 70
3.1. Введение 70
3.2. Методы обнаружения синглетного кислорода 71
3.3. Импульсная люминесценция 73
3.4. Выбор химического метода обнаружения 102 78
3.5. Модификация фотохимического метода определения синглетного кислорода. Экспериментальная установка 82
3.6. Метод расчета стационарной концентрации синглетного кислорода с помощью эталонного фото сенсибилизатора 87
3.7. Генерация синглетного кислорода твердофазными фотосенсибилизаторами на основе фуллеренов 90
3.8. Анализ удельных величин стационарной концентрации синглетного кислорода 94
3.9. Потенциальные возможности фуллерена, нанесенного на микрочастицы силикагеля, в качестве фотосенсибилизатора синглетного кислорода в модельной водной среде, не содержащей электронодонорных соединений 102
3.10. Выводы 107
Глава 4. Изучение фотостабильности фуллереновых покрытий в составе твердофазных фотосенсибилизаторов синглетного кислорода 109
4.1. Введение 109
4.2. Методическая часть 110
4.3. Результаты и обсуждение 113
4.4. Выводы 120
Глава 5. Изучение принципиальных возможностей твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллеренов для фото динамической инактивации вирусов in vitro 121
5.1. Введение 121
5.2. Сродство фуллерена к вирусу 122
5.3. Фотодинамическая инактивация вирусов немодифицированными фуллеренами в модельных водных системах 124
5.4. Особенности инактивации вирусов в реальных биологических жидкостях 130
5.5. Выводы 135
Выбор твердофазного фотосенсибилизатора на основе фуллеренов для фотодинамической инактивации вирусов биологических жидкостях 136
Выводы 140
Заключение 142
Литература 143
- Снижение квантового выхода синглетного кислорода при агрегации молекул фуллерена
- Получение и структурные свойства суспензии раздробленного кристаллического фуллерена в воде
- Метод расчета стационарной концентрации синглетного кислорода с помощью эталонного фото сенсибилизатора
- Фотодинамическая инактивация вирусов немодифицированными фуллеренами в модельных водных системах
Введение к работе
Исследование различных фотосенсибилизаторов и условий протекания фото сенсибилизируемых химических реакций является традиционным научным направлением, разрабатываемым в ГОИ им. СИ. Вавилова в течение нескольких десятилетий. Научная школа ГОИ в этой области знаний связана, в первую очередь, с именами таких академиков, как И. С. Вавилов и А.Н. Теренин.
Известно, что фотосенсибилизиация применяется в различных типах фотохимических реакций (фотоприсоединение, фотополимеризация и др.), причем решение общей задачи нахождения оптимального фотосенсибилизатора невозможно. Наоборот, в каждом случае необходимо решать конкретную задачу, учитывающую тип фотохимической реакции, среду, в которой проходит соответствующая реакция, и предполагаемую область приложения реакции. В настоящей работе рассматривается вопрос использования фотосенсибилизатора для возбуждения синглетного кислорода, который в настоящее время находит широкое применение, например, в лазерной технике - для возбуждения йода в газовых лазерах, а также в биологии и медицине - для окисления органических соединений.
Одним из актуальных применений реакции фотосенсибилизированного окисления органических соединений является метод фотодинамической инактивации болезнетворных организмов (вирусы, бактерии, простейшие и т.д.) в донорской крови и продуктах крови. В числе инфекционных агентов, контаминирующих кровь и препараты крови, достаточно упомянуть особо опасные вирусы иммунодефицита человека, гепатитов В и С, цитомегаловирус человека и др. [1, 2]. Роль этих агентов в структуре инфекционной патологии человека в последнее десятилетие возрастает в связи с изменением образа жизни, экологической обстановки и, кроме того, естественного процесса вирусной эволюции в человеческой популяции.
В настоящее время доноры, как и препараты крови, проходят многоступенчатый и дорогостоящий контроль на отсутствие вирусной контаминации. В связи с этим разработка доступных методик инактивации плазмы донорской крови и препаратов крови могла бы стать важным шагом к обеспечению безопасности процедуры гемотрансфузии. Обработка типа ультрафиолетового облучения вызывает повреждение терапевтических компонентов крови, поэтому для инактивации патогенов необходимы иные, более специфические, подходы.
Ранее было показано, что оболочечные вирусы могут быть эффективно инактивированы соединениями, производящими активные формы кислорода, среди которых красители являются наиболее заметным и широко используемым типом веществ. Способность к инактивации вирусов была описана для красителей различной химической природы, в частности, фталоцианинов, мероцианинов, производных порфирина, тиазинов, оксазинов, и некоторых других [3].
Благодаря преимущественному воздействию на вирусы, а не на компоненты биологической жидкости, метод фотодинамической инактивации вирусов, на наш взгляд, является оптимальным для целей очистки плазмы и препаратов плазмы крови. Однако, несмотря на все преимущества этого метода, использование фотосенсибилизаторов на основе красителей имеет ряд существенных недостатков, ограничивающих применение этого метода инактивации.
Недостаток, присущий большинству красителей - их растворимость в водных средах, которая приводит к загрязнению целевых продуктов инактивации следами используемого красителя. По нашему мнению, эта ситуация не отвечает современным требованиям, предъявляемым к лечебным препаратам, поскольку большинство красителей обладает свойствами пито- и генотоксичности [4]. Дополнительным недостатком является низкая стабильность красителей при освещении, что может приводить к появлению продуктов фото деструкции [5].
В связи с вышесказанным, при использовании таких водорастворимых красителей, остро стоит проблема удаления нежелательных и вредных примесей из биологических жидкостей после процесса фотодинамического воздействия. Это требует разработки методов селективной фильтрации таких веществ из вязких растворов, например плазмы, а, следовательно, разработки специальных фильтров, обеспечивающих полное удаление примесей [6]. Однако, учитывая масштабность потребности современной медицины в плазме донорской крови и белковых препаратах плазмы, создание и использование таких селективных фильтров неминуемо приведет к снижению объемов обрабатываемых целевых продуктов.
Проблематичность использования процесса инактивации плазмы и препаратов плазмы донорской крови с помощью красителей становится тем более очевидной при множественной трансфузии (в связи с неминуемым накоплением токсичных веществ у реципиента) и при очистке белковых препаратов из плазмы крови (в связи с проведением процесса в больших объемах, делающих нецелесообразным применение селективных фильтров).
Облегчить задачу применения метода фотодинамической инактивации вирусов в препаратах плазмы крови и плазме крови для множественной трансфузии позволит создание нового класса фотостабильных фотосенсибилизаторов твердофазного типа, обеспечивающих получение целевых продуктов, гарантированно свободных от вредных и нежелательных примесей.
Новые возможности для современных методов фото динамической инактивации вирусов в плазме и препаратах плазмы крови открывает применение фуллеренов в качестве эффективных фотосенсибилизаторов для образования синглетного кислорода. В настоящее время фуллерены стали объектом активных исследований в различных областях науки и техники. Необычайные свойства этого класса соединений вызвали значительный интерес к их применению в качестве биологически и фармакологически активных веществ. Кроме того, твердофазные фотосенсибилизаторы на основе фуллерена
нерастворимы в воде и при необходимости могут быть легко удалены из водной среды.
Однако, получение твердофазной композиции, содержащей мономеры
немодифицированного фуллерена, представляется достаточно сложной задачей.
В свою очередь агрегация фуллерена в композиции может повлиять на
эффективность генерации активных форм кислорода, в том числе синглетного
кислорода. Дополнительная трудность проведения процесса
сенсибилизированного окисления в водных средах состоит в коротком времени жизни синглетного кислорода в воде по сравнению с органическими растворителями и тем более с вакуумом. Благодаря этому обстоятельству исследователям ранее не удавалось зафиксировать образование синглетного кислорода в воде при участии высоко агрегированного фуллерена.
Высокая сенсибилизирующая способность твердофазного
фотосенсибилизатора на основе фуллерена является только необходимым, но недостаточным условием проведения эффективного технологического процесса селективной инактивации вирусов. Помимо вопросов обеспечения сродства твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллеренов к вирусу и их фотостабильности может возникнуть проблема, связанная с обеспечением высокой вероятности контакта фуллерена с кислородом и вирусом в водной среде, особенно в вязкой биологической жидкости, каковой является плазма крови.
Таким образом, настоящая работа посвящена созданию новых твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллеренов, обладающих способностью генерировать синглетный кислород в водных средах, селективно воздействовать на вирусы и быть фотостабильными и легко извлекаемыми из биологических жидкостей после процедуры фотовоздействия.
Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, заключения, списка литературы и трех приложений.
В первой главе представлен обзор литературы, посвященный вопросам возможности и особенностей применения фуллерена в качестве
сенсибилизирующего агента в фотодинамических процессах, в частности инактивации вирусов. На основе анализа литературных данных сформулированы основные задачи настоящей работы.
Во второй главе сформулированы основные требования, предъявляемые
нами к твердофазным фуллеренсодержащим фотосенсибилизаторам,
предназначенным для использования в установках по очистке плазмы и
препаратов плазмы крови. На основании этих требований были предложены и
изготовлены новые твердофазные фотосенсибилизаторы: раздробленный
кристаллический фуллерен; кластеры «аморфного» фуллерена; пластины и
микрочастицы, покрытые фуллереном. Кроме того, во второй главе описаны
процессы изготовления и результаты изучения структурных свойств этих
сенсибилизаторов. По результатам исследований было показано, что во всех
исследуемых композициях фуллерен находится в агрегированном виде, что
может привести, в частности, к уменьшению эффективной концентрации
фуллерена и времени жизни триплетного состояния фуллерена. Кроме того,
показано, что наилучшей среди исследованных композиций с точки зрения
хорошей смачиваемости водными средами, простоты получения,
воспроизводимости физико-химических свойств, технологичности
практического использования в процессах инактивации вирусов и извлекаемости фотосенсибилизаторов из биологической среды после процедуры фото динамического воздействия, являются фуллерены, нанесенные на микрочастицы силикагеля.
В третьей главе описаны результаты обнаружения синглетного кислорода, образованного при облучении твердофазных фуллеренсодержащих фотосенсибилизаторов, помещенных в модельную водную среду, не содержащую электронодонорных соединений. Показано, что все исследуемые твердофазные фотосенсибилизаторы способны генерировать синглетный кислород. Обнаружено, что агрегация фуллерена, присущая всем разработанным композициям, способствует снижению эффективности генерации синглетного кислорода. Несмотря на это, теоретически показано, что
сенсибилизирующей способности фуллерена, нанесенного на микрочастицы силикагеля, может быть достаточно для проведения эффективного технологического процесса инактивации вирусов в модельной водной среде, не содержащей электронодонорных соединений.
В четвертой главе приведены результаты исследования фотостабильности покрытий фуллерена на микрочастицах силикагеля (наиболее перспективного из разработанных твердофазных фотосенсибилизаторов) и на стеклянных пластинах по сравнению с эталонным фотосенсибилизатором (метиленовым синим). Была показана высокая фотостабильность покрытий фуллерена Сбо как в водной, так и в газовой среде, которая обуславливает перспективность их применения в фото динамической терапии.
В пятой главе на основании исследований, проведенных совместно коллективами сотрудников Института лазерной физики ФГУП «НІЖ «ГОИ им. СИ. Вавилова» (с участием автора) и НИИ Гриппа РАМН, продемонстрирована принципиальная возможность применения твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллеренов для фотодинамической инактивации оболочечных вирусов in vitro. Показана инактивирующая способность полученных композиций в отношении оболочечных вирусов (на примере вирусов гриппа H0N1 и H1N1) в модельных водных средах в отсутствии электронодонорных соединений, а также в реальной биологической жидкости.
В первом приложении приведены методики проведения биологических экспериментов по инактивации вирусов гриппа.
Во втором приложении описан подбор условий получения полной инактивации вируса гриппа в аллантоисной жидкости куриного эмбриона с помощью твердофазного сенсибилизатора на основе фуллерена.
В третьем приложении представлен список специальных терминов.
Результаты работы прошли апробацию на следующих Международных конференциях: 8th International Conference on Solar Energy and Applied Photochemistry "Solar - 05, Luxor, Egypt, 2005; 7 Biennial International Workshop
on Fullerenes and Atomic Clusters, St-Petersburg, Russia, 2005; IX Международная конференция ICHMS — 2005, Водородное материаловедение и химия углеродных наноматериалов, Севастополь, Крым, Украина, 2005; XII (XIII) Conference on Laser Optics, St.-Petersburg, Russia, 2006 (2008).
По теме диссертации опубликовано 5 работ в реферируемых журналах и сделано 8 докладов на Международных конференциях.
На защиту выносятся:
Способность агрегированных фуллеренов при их возбуждении видимым светом в водных средах генерировать синглетный кислород.
Твердофазный фотосенсибилизатор на основе фуллерена, при облучении видимым светом генерирующий синглетный кислород в водных средах.
Фотостабильность твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллеренов в условиях облучения, характерных для процесса фотодинамической инактивации вирусов (длительность облучения < 2 ч., 100 мВт/см , видимый диапазон спектра).
Фотодинамическая инактивация оболочечных вирусов в водных средах при использовании твердофазных фото сенсибилизаторов на основе фуллеренов.
Снижение квантового выхода синглетного кислорода при агрегации молекул фуллерена
В связи с вышесказанным, при использовании таких водорастворимых красителей, остро стоит проблема удаления нежелательных и вредных примесей из биологических жидкостей после процесса фотодинамического воздействия. Это требует разработки методов селективной фильтрации таких веществ из вязких растворов, например плазмы, а, следовательно, разработки специальных фильтров, обеспечивающих полное удаление примесей [6]. Однако, учитывая масштабность потребности современной медицины в плазме донорской крови и белковых препаратах плазмы, создание и использование таких селективных фильтров неминуемо приведет к снижению объемов обрабатываемых целевых продуктов.
Проблематичность использования процесса инактивации плазмы и препаратов плазмы донорской крови с помощью красителей становится тем более очевидной при множественной трансфузии (в связи с неминуемым накоплением токсичных веществ у реципиента) и при очистке белковых препаратов из плазмы крови (в связи с проведением процесса в больших объемах, делающих нецелесообразным применение селективных фильтров).
Облегчить задачу применения метода фотодинамической инактивации вирусов в препаратах плазмы крови и плазме крови для множественной трансфузии позволит создание нового класса фотостабильных фотосенсибилизаторов твердофазного типа, обеспечивающих получение целевых продуктов, гарантированно свободных от вредных и нежелательных примесей.
Новые возможности для современных методов фото динамической инактивации вирусов в плазме и препаратах плазмы крови открывает применение фуллеренов в качестве эффективных фотосенсибилизаторов для образования синглетного кислорода. В настоящее время фуллерены стали объектом активных исследований в различных областях науки и техники. Необычайные свойства этого класса соединений вызвали значительный интерес к их применению в качестве биологически и фармакологически активных веществ. Кроме того, твердофазные фотосенсибилизаторы на основе фуллерена нерастворимы в воде и при необходимости могут быть легко удалены из водной среды.
Однако, получение твердофазной композиции, содержащей мономеры немодифицированного фуллерена, представляется достаточно сложной задачей. В свою очередь агрегация фуллерена в композиции может повлиять на эффективность генерации активных форм кислорода, в том числе синглетного кислорода. Дополнительная трудность проведения процесса сенсибилизированного окисления в водных средах состоит в коротком времени жизни синглетного кислорода в воде по сравнению с органическими растворителями и тем более с вакуумом. Благодаря этому обстоятельству исследователям ранее не удавалось зафиксировать образование синглетного кислорода в воде при участии высоко агрегированного фуллерена. Высокая сенсибилизирующая способность твердофазного фотосенсибилизатора на основе фуллерена является только необходимым, но недостаточным условием проведения эффективного технологического процесса селективной инактивации вирусов. Помимо вопросов обеспечения сродства твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллеренов к вирусу и их фотостабильности может возникнуть проблема, связанная с обеспечением высокой вероятности контакта фуллерена с кислородом и вирусом в водной среде, особенно в вязкой биологической жидкости, каковой является плазма крови. Таким образом, настоящая работа посвящена созданию новых твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллеренов, обладающих способностью генерировать синглетный кислород в водных средах, селективно воздействовать на вирусы и быть фотостабильными и легко извлекаемыми из биологических жидкостей после процедуры фотовоздействия. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, заключения, списка литературы и трех приложений. В первой главе представлен обзор литературы, посвященный вопросам возможности и особенностей применения фуллерена в качестве сенсибилизирующего агента в фотодинамических процессах, в частности инактивации вирусов. На основе анализа литературных данных сформулированы основные задачи настоящей работы. Во второй главе сформулированы основные требования, предъявляемые нами к твердофазным фуллеренсодержащим фотосенсибилизаторам, предназначенным для использования в установках по очистке плазмы и препаратов плазмы крови. На основании этих требований были предложены и изготовлены новые твердофазные фотосенсибилизаторы: раздробленный кристаллический фуллерен; кластеры «аморфного» фуллерена; пластины и микрочастицы, покрытые фуллереном. Кроме того, во второй главе описаны процессы изготовления и результаты изучения структурных свойств этих сенсибилизаторов. По результатам исследований было показано, что во всех исследуемых композициях фуллерен находится в агрегированном виде, что может привести, в частности, к уменьшению эффективной концентрации фуллерена и времени жизни триплетного состояния фуллерена. Кроме того, показано, что наилучшей среди исследованных композиций с точки зрения хорошей смачиваемости водными средами, простоты получения, воспроизводимости физико-химических свойств, технологичности практического использования в процессах инактивации вирусов и извлекаемости фотосенсибилизаторов из биологической среды после процедуры фото динамического воздействия, являются фуллерены, нанесенные на микрочастицы силикагеля.
Получение и структурные свойства суспензии раздробленного кристаллического фуллерена в воде
Дальнейшая очистка лечебных препаратов может осуществляться обработкой с помощью растворителей и детергентов (P/D метод) [31]. Этот метод в настоящее время получил широкое распространение и разрешен к применению. Метод заключается в инактивации оболочечных вирусов посредством разрушения структуры липидной оболочки при помощи используемых в процессе растворителя и детергента. Для этой цели применяют растворитель три-Н-бутилфосфат (TNBP) в сочетании с детергентом ("Полисорбатом 80" и холатом натрия или Тритоном). Имеются обширные данные, которые доказывают эффективность использования P/D метода против вирусов гепатита В, гепатита С и ВИЧ при производстве препаратов иммуноглобулина и антигемофилических факторов. В последствии остаточные количества химических средств, используемых в этом процессе, удаляются из конечного продукта ультрафильтрацией, диафильтрацией или колоночной хроматографией. При таком процессе инактивации неминуемо частичное разрушение белков, являющихся основной составляющей целевых продуктов.
Если для инактивации лечебных препаратов плазмы P/D метод используется достаточно давно, то для инактивации свежезамороженной плазмы применяется сравнительно недавно, на протяжении последнего десятилетия [31]. В настоящее время таким способом в ряде стран заготавливается плазма крови для трансфузии, а также для производства на ее основе лечебных препаратов.
Однако следует отметить, что P/D метод инактивации вирусов имеет существенные недостатки, которые, прежде всего, заключаются в проблеме полного удаления используемых химических средств из целевых продуктов. Наличие нежелательных примесных химических компонентов (следов растворителя и детергента) снижает качество целевых продуктов и резко ограничивает их использование, особенно, если речь идет о множественных трансфузиях.
В ряде случаев используются методы инкубирования препаратов при низких значениях рН в присутствии этанола [32, 33], поскольку вирусы, как известно, теряют инфекционность при нахождении в кислой среде. Например, это одна из стадий процесса производства препарата иммуноглобулина или альбумина. Серьезным недостатком такого процесса является необходимость длительного выдерживания реакционного раствора при низком значении рН, иногда вплоть до 2-3 недель.
Тепловая обработка также приводит к инактивации вирусов, однако, такая процедура допускается исключительно для термостабильных белков плазмы, например альбумина, и практически исключается для обработки собственно плазмы донорской крови из-за возможной термической денатурации белков плазмы [34].
Методы фильтрации вирусов [35] обладают определенным преимуществом снижения концентрации вирусов ввиду отсутствия неблагоприятного воздействия на структуру белков. Однако в этом случае технологический процесс получения целевых продуктов ставится в прямую зависимость от скорости протекания вязких биологических жидкостей через микропористые фильтрационные материалы, удерживающие вирусы. Ультрафильтрация через мембранный фильтр является методом, аналогичным стерильной фильтрации. Для эффективной элиминации вирусов наименьших размеров величина пор фильтра должна быть не более 20 нм. Однако применение таких фильтров может создавать проблемы в отношении белков большого молекулярного веса. На практике часто используются каскадные фильтрационные системы, состоящие из набора фильтров различной пористости. Такой подход несколько облегчает протекание вязкой жидкости через каскадную мембрану, но все равно остается проблема закупоривания пор, приводящая к остановке процесса фильтрации. Кроме того, создание таких уникальных фильтров само по себе представляет собой достаточно сложную и дорогостоящую операцию.
Существуют еще несколько методов инактивации и удаления вирусов из плазмы донорской крови и лечебных препаратов из плазмы, которые не получили широкого распространения ввиду проблем, связанных прежде всего с низкой эффективностью инактивации, с нетехнологичностью их использования, а также из-за существенного разрушения белковых компонентов плазмы [36].
Анализируя приведенные выше методы инактивации вирусов, можно отметить ряд существенных недостатков, ограничивающих их применение. Прежде всего, традиционные методы инактивации вирусов не обладают селективностью воздействия на вирусы, что приводит к значительной денатурации белков плазмы крови. Кроме того, для этих методов могут быть характерны длительность процесса обработки и наличие в целевых продуктах нежелательных примесей.
В последнее время широкое развитие получил метод фото динамической инактивации вирусов в плазме донорской крови. Облучение фотосенсибилизаторов, применяемых для обработки биологических жидкостей, приводит к генерации активных форм кислорода, которые в свою очередь оказывают разрушающее воздействие на инфекционные агенты. В таком методе в качестве фотосенсибилизатора используют водорастворимый краситель — метил еновый синий [6]. Важным преимуществом фотодинамического метода инактивации является избирательное воздействие на вирусы, а не на белковую среду за счет тропности сенсибилизатора к вирусам. Кроме того, облучение осуществляется достаточно непродолжительное время (около 20 минут) в диапазоне длин волн 450-500 нм, что практически исключает разрушающее действие излучения на белки плазмы крови.
Метод расчета стационарной концентрации синглетного кислорода с помощью эталонного фото сенсибилизатора
Снижение степени агрегации способствует увеличению времени жизни возбужденных состояний Сбо- Так, в работе [18] были исследованы возбужденные состояния фуллерена Сбо, помещенного из насыщенного раствора хлорбензола в мезопористую силикатную матрицу, изготовленную по золь-гель технологии. Типичный размер пор матрицы составлял 3.7 нм, объем — 0.5 см /г. Спектр поглощения наполненной матрицы показал, что фуллерен находится в ней частично в мономерном, частично в агрегированном состоянии. Об этом свидетельствовало наблюдение пика на длине волны 405 нм, свойственного мономеру фуллерена, а также значительного поглощение в области 450 нм, характерного для агрегированного состояния фуллерена [53].
В исследованных образцах при лазерном облучении время жизни уровня Si сократилось более, чем на порядок величины, и составляет 150 пс, в то время как в растворе в хлорбензоле оно характеризуется величиной в 1000 пс (1 не). Квантовый выход в триплетное состояние меньше, чем в случае раствора Сбо в ароматических растворителях, однако, его нельзя считать пренебрежимо малым, как в кристаллических пленках Сбо- Квантовый выход в триплетное состояние составляет 0.25, указывая на то, что скорость внутрисистемного перехода должна была возрасти. По мнению авторов, изменение квантового выхода в триплетное состояние и ускорение динамики процесса внутрисистемного перехода объясняется двумя факторами: 1) отсутствием ароматического растворителя, влияние которого выражается в стабилизации возбужденных состояний фуллерена; 2) изменением энергетических уровней молекул фуллерена за счет их взаимодействия с твердотельным окружением силикатной матрицы.
Также авторами [18] изучены возбужденные состояния моноаддукта С6о, внедренного в мезопористые силикатные матрицы из раствора в тетрагидрофуране (ТНР)/НгО при соотношении 1:1 непосредственно в процессе гелеобразования. Полученное производное фуллерена в этом растворе и, следовательно, в полученной силикатной матрице, в основном находится в виде кластеров.
В этой композиции также наблюдается уменьшение времени жизни синглетного возбужденного состояния фуллерена, что в данном случае авторами связывается со взаимодействием между соседними молекулами С6о, образующими агрегаты, существование которых доказано с помощью малоуглового рентгеновского рассеяния. Обнаруженная степень агрегации Сбо соответствует промежуточному состоянию фуллерена, находящемуся где-то между состоянием изолированной молекулы (как в растворе) и состоянием высоко агрегированного фуллерена в кристалле, следовательно, влияние твердотельных эффектов также должно быть промежуточным. Действительно, сокращение времени жизни уровня Si по мнению авторов было не таким значительным, как в кристаллических пленках, а квантовый выход в триплетное состояние нельзя было назвать пренебрежимо малым. Поскольку конкретная величина квантового выхода не указывается, молено предположить, что ситуация с возбужденными состояниями фуллерена здесь хуже, чем в случае фуллерена, помещенного в силикатную матрицу из раствора хлорбензола.
В работе [64] рассматриваются возбужденные состояния Сбо «fine particles» (CeoFP), представляющих собой микрокристаллы фуллерена нанометровых размеров. C6oFP были получены методом переосаждения: 0.2 мл раствора Сбо в CS2 (1 мМ) вводили в 10 мл этанола при постоянном перемешивании при комнатной температуре. Средний диаметр образованных частиц по данным динамического светорассеяния составляет 270 нм. Суспензия окрашена в слабо коричневый цвет, что характерно для агрегатов Сбо- Спектр суспензии также характерен для агрегатов фуллерена: в нем присутствует пик на 350 нм, а также широкие полосы около 450 и 620 нм, пик на 405 нм отсутствует; степень агрегации меньше, чем у кристаллического Сбо с большим размером частиц, диспергированного в КВг.
При изучении возбужденных состояний фуллерена выявлено наличие триплетного состояния Сбо в этих агрегатах. При этом отмечается, что Т-Т аннигиляция в данном случае значительно отличается от таковой для молекулы Сбо в растворах благодаря влиянию кристаллической структуры. Время жизни триплетного состояния было оценено на уровне 22 мкс, в то время как в растворе Сбо в CS2 оно составляет 47 мкс. Было экспериментально доказано, что изучаемые агрегаты способны участвовать в фотоиндуцированных процессах таких, как передача энергии и передача электрона, наравне с изолированными молекулами Сбо, однако скорость реакции в случае микрокристаллов ниже из-за малой вероятности столкновений с триплетом CeoFP.
В работе [65] показано влияние диэлектрической проницаемости є различных растворителей на время жизни возбужденных состояний фуллерена. Растворы С6о в чистых растворителях и в смесях ароматических и неароматических растворителей приготавливались быстрым растворением с помощью ультразвука или медленным растворением в течение ночи, что не влияло на структуру полученных растворов.
Как в чистых растворах, так и в смесях растворителей проходило образование агрегатов Сбо, начиная с некоторой критической концентрации фуллерена, если величина диэлектрической постоянной растворителя была 13. При низкой полярности растворителя (смеси) раствор содержал С6о только в молекулярной форме.
Фотодинамическая инактивация вирусов немодифицированными фуллеренами в модельных водных системах
Таким образом, использование метода электронной микроскопии в модификации негативного контрастирования и применение свежеприготовленных углеродных подложек для фиксации образца позволило более корректно установить, что средний размер частиц в этом случае составляет приблизительно 27 нм.
Полученный мицеллярный раствор фуллерена в воде, характеризуясь более однородным распределением частиц по размеру, представлялся авторам как более удачная фуллеренсодержащая композиция для использования в процессах инактивации вирусов. Однако из литературы известно, что в мицеллярных растворах фуллерена в воде, в частности, образованных с помощью поверхностно - активного соединения Тритон Х-100 и характеризующихся аналогичным видом спектра, не удалось зафиксировать образование синглетного кислорода [52]. Проведенные исследования люминесценции водного мицеллярного раствора фуллерена, полученного по методу Андриевского, привели к аналогичным результатам [87].
Принимая во внимание тот факт, что процессы инактивации вирусов происходят в среде, содержащей определенное количество неорганических солей, было изучено поведение и свойства мицеллярного раствора фуллерена при добавлении в водный раствор физиологического количества хлористого натрия (0.9%).
В результате такой модификации гидратная оболочка мицелл разрушается, и мицеллярный раствор превращается в суспензию однородных по размеру частиц фуллерена (рис.2.10.). Методом электронной микроскопии было показано, что средний размер таких частиц приблизительно составляет 20-30 нм.
Поскольку в результате модификации устойчивость системы снижается, то достаточно быстро (в течение трех суток) происходит агломерация исходных частиц до образования рыхлого осадка. Следует отметить, что наблюдаемая агломерация частиц фуллерена носит обратимый характер. При последующем интенсивном перемешивании или кратковременном воздействии ультразвуком образованный осадок практически полностью распадается на исходные частицы размером 20-30 нм, которые образуют достаточно однородную и устойчивую суспензию фуллерена в водном растворе. В связи с этим представляется возможным считать суспензию фуллерена, полученного таким образом, «динамически агломерированной» формой частиц фуллерена.
Спектр поглощения полученной суспензии фуллерена, приведенный на рис.2. П., характерен для агрегированного состояния фуллеренов.
Для получения сухого порошка фуллерена использовали метод лиофильной сушки. Структура полученного порошка была исследована рентгено-графическим методом, полученная рентгенограмма представлена на рис.2.12. На рентгенограмме четко видны пики, характеризующие кристаллический фуллерен, вместе с гало, которые могут трактоваться как характеристика аморфной составляющей полученного порошка. Таким образом, методом модификации водного мицеллярного раствора фуллерена получена дисперсная фуллереновая композиция, представляющая собой аморфный фуллерен ( 67%) с примесью кристаллического фуллерена ( 33%), и условно называемая в данной работе «аморфный» фуллерен. Таким образом, в настоящей работе предлагается новая возможность получения высоко аморфизованного фуллерита Сбо путем модификации водного мицеллярного раствора фуллерена.
Здесь следует отметить тот факт, что, механохимическая дезинтеграция фуллерита в предельном случае, по утверждению авторов работы [89], может оказывать влияние не только на межмолекулярные, но и на внутримолекулярные связи и приводить, таким образом, к образованию аморфного углерода. Однако, в рамках настоящих исследований, ни при дроблении фуллерита ультразвуком, ни при модификации водного мицеллярного раствора Сбо, не происходило превращения фуллерена в аморфный углерод. Об этом говорило наблюдение характерных полос фуллерена в спектрах поглощения полученных суспензий (рис. 2.5 и 2.11), а также сохранение свойства растворимости полученных частиц в толуоле, присущее Сбо и нетипичное для углерода.
Результаты изучения структурных свойств водной суспензии «аморфного» фуллерена показывают, что, в отличие от суспензии раздробленного кристаллического фуллерена, данная композиция характеризуется воспроизводимостью размеров, а, следовательно, свойств, что может способствовать большему удобству ее практического использования.
Однако оказалось, что ни суспензия раздробленного кристаллического фуллерена, ни суспензия «аморфного» фуллерена не могут обеспечить достаточную технологичность их применения в процессах инактивации вирусов. Действительно, эти кристалло-аморфные порошки фуллеренов были испытаны в биологических экспериментах по инактивации вируса гриппа в модельных экспериментах в физиологическом растворе и аллантоисной жидкости, представляющей собой вязкую биологическую систему, содержащую большое количество белковых компонентов. Несмотря, на высокую способность данных композиций к инактивации вирусов гриппа в результате экспериментов были выявлены определенные проблемы, связанные с малым размером частиц фотосенсибилизаторов. В вязкой биологической среде, каковой являлась аллантоисная жидкость куриного эмбриона, наблюдалось постепенное укрупнение частиц фотосенсибилизатора, и, как следствие, процесс инактивации постепенно замедлялся и прекращался. Добавление свежей порции суспензии в реакционную смесь приводило к возобновлению процесса инактивации.
