Введение к работе
Актуальность темы диссертации
Встраивание молекул порфиринов в ДНК было обнаружено в 1979 году, и с тех пор комплексы порфиринов с природными и синтетическими (модельными) ДНК являются объектом многочисленных исследований. Интерес к этим объектам обусловлен в первую очередь возможностями биомедицинского применения эффектов встраивания порфиринов в ДНК, таких как фотодинамическое действие, т. е. фотосенсибилизированное порфиринами направленное повреждение структуры ДНК. Такие эффекты могут найти применение в инактивации вирусов в организме человека, а также в фотодинамической терапии онкологических заболеваний. Кроме того, взаимодействия порфиринов с ДНК часто рассматриваются с точки зрения моделирования действия некоторых лекарственных противоопухолевых препаратов. С другой стороны, анализ публикаций на эту тему показал, что практически вся имевшаяся к началу выполнения данной работы (1993 г.) спектроскопическая литература, посвященная взаимодействию порфиринов с ДНК, касается изучения основного (невозбужденного) электронного состояния порфиринов. Первичные фотопроцессы с участием встроенных в ДНК порфиринов были изучены очень слабо, хотя потребность в этом велика, поскольку в литературе высказывалось много противоречивых сведений о возможных механизмах фотодинамического действия порфиринов на ДНК. Преобладающее в литературе мнение связывает высокую фотодинамическую активность ряда безметальных катионных порфиринов с генерируемым ими синглетным кислородом. Основывалось такое мнение в первую очередь на том, что эти порфирины, находясь в свободном состоянии в водном растворе, эффективно генерируют синглетный кислород.
В диссертационной работе предположено, что в порфиринах, связанных с ДНК, размен энергии электронного возбуждения может происходить не всегда по тем же каналам, по каким он осуществляется в свободных молекулах в растворе, и что конкретные пути этого размена могут сильно зависеть от места встраивания порфирина в ДНК. Выполненные в диссертации прямые эксперименты показали правильность этой точки зрения и позволили получить свидетельства в пользу возможности прямого фогоиндуцированного переноса электрона между гуанином и фотовозбужденным порфирином. Такой фотоперенос электрона может быть первым элементарным актом в цепи реакций, приводящих к повреждению ДНК без участия синглетного кислорода. Подтверждением этой идеи могут быть результаты ряда фотобиологических работ, в которых тушение триплетных состояний катионных порфиринов,
2 ответственных за образование синглетного кислорода, не приводило к уменьшению фотодинамического действия этих порфиринов на ДНК.
В отличие от вышеупомянутых безметальных катионных порфиринов (а также их комплексов с цинком), обладающих долгоживущим и эффективно заселяемым триплетним состоянием, и, как следствие, хорошо сенсибилизирующих образование синглетного кислорода, комплексы катионных порфиринов с ионами переходных металлов до недавнего времени не привлекали внимания исследователей с точки зрения изучения фотофизических и фотохимических процессов, протекающих в них в связанном с ДНК состоянии. Действительно, такие металлопорфирины имеют пикосекундные времена жизни возбужденных состояний, что не только не дает возможности генерировать синглетный кислород, но и не давало, из общих соображений, больших надежд на то, что за столь короткие времена могут произойти какие-либо специфические фотореакции между этими металлопорфиринами и элементами ДНК. Тем не менее, в настоящей работе показано, что водорастворимые Си- и Ni-порфирины при фотовозбуждении обладают достаточно высокой специфичностью и селективностью взаимодействия с основаниями ДНК и другими молекулами из ближайшего окружения. Такая способность металлопорфириноБ, содержащих переходные металлы, к специфическим фотореакциям с молекулами ближайшего окружения основана в первую очередь на свойстве возбужденных электронных состояний иона переходного металла, связанных с его d-орбиталями (так называемых (d,d), (d,;i*) и (ji,d) состояний), обратимо присоединять азот- и кислородосодержащие молекулы в качестве аксиального лиганда. В диссертационной работе предложена и подтверждена экспериментально идея использования металлопорфиринов, содержащих ионы переходных металлов, в качестве своеобразных зондов, чувствительных к ближайшему микроокружению, в котором находится встроенная в полинуклеотид молекула металлопорфирина.
Связь с крупными научными программами, темами
Основные результаты, положенные в основу настоящей диссертационной работы, были получены при выполнении проектов Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований "Фотоиндуцирован-ные процессы в новых модельных биологических системах: исследование методом сверхбыстрой лазерной абсорбционной спектроскопии" (1995-1998 гг., № госрегистрации 19963828), "Изучение методами кинетической абсорбционной спектроскопии специфических взаимодействий между фотовозбужденными водорастворимыми порфиринами и ДНК" (1998-2000 гг., № госрегистрации 19982214) и Республиканской программы фундаментальных исследований «Лазерная кинетическая спектроскопия гембелков, модельных
биологических систем и координационных соединений: внутримолекулярные процессы и динамика связывания лигандов» (1996-2000 гг.).
Цель и задачи исследования
Цель настоящей работы заключалась в изучении спектрально-кинетических свойств возбужденных электронных состояний водорастворимых катионных порфиринов и металлопорфиринов в составе комплексов с природными и синтетическими ДНК.
Для выполнения поставленной цели в диссертационной работе решались следующие задачи:
создание экспериментальной установки для измерения кинетических и спектральных характеристик наведенного поглощения во временном диапазоне от нескольких пикосекунд до нескольких наносекунд;
определение фотофизических характеристик порфирита Н2(ТМру-Р4) и его Cu(II)- и №(И)-металлокомплексов в водном растворе и в составе их комплексов с ДНК;
исследование процесса тушения молекулярным кислородом нижнего возбужденного триплетного состояния флуоресцирующих безметального порфирина Н2(ТМру-Р4) и его 2п(П)-комплекса, встроенных в нуклеиновые кислоты.
Объект и предмет исследования
Объектами исследования служили комплексы катионных водорастворимых порфиринов и металлопорфиринов с ДНК и модельными поли- и олигонуклеотидами.
Методологій и методы проведенного исследования
Основными методами исследования являлись методы стационарной и кинетической абсорбционной спектроскопии, люминесценции и спектроскопии РКР. С их помощью были измерены спектры поглощения, флуоресценции и РКР, определены квантовые выходы люминесценции и образования триплетного состояния, изучены кинетики заселения и дезактивации возбужденных электронных состояний.
Научная новизна и значимость полученных результатов
Проведено всестороннее исследование возбужденных электронных состояний Си- и Ni-порфиринов, встроенных в природные и синтетические ДНК. Установлено, что образование комплексов в возбужденном состоянии (эксиплексов) между Си(ТМру-Р4), встроенным в ДНК, и элементами ДНК осуществляется через присоединение к Си(ТМру-Р4) СО-группы тимина в
4 качестве аксиального лиганда с одновременным заселением возбужденного (а,а)-состояния Cu-порфирина. Обнаружено также образование подобного эксиплекса для Си(ТМру-Р4) с молекулами воды. Установлено, что время жизни эксиплекса зависит от места встраивания в биополимер и природы кислородосодержащего аксиального лиганда. Показано, что для Ni(TMpy-P4) при фотовозбуждении также возможно обратимое присоединение аксиального лиганда (молекулы воды), которое определяется местом локализации этой молекулы в структуре ДНК. Предложено использовать высокоспецифические фотореакции аксиального лигандирования металлопорфиринов с ионами переходных металлов в качестве зондов для изучения микроокружения металлопорфиринов в их комплексах с нуклеиновыми кислотами.
Показано, что между фотовозбужденным порфирином Н2(ТМру-Р4), иптеркалированным между парами GC оснований, и гуанином происходит быстрый фотоиндуцированный перенос электрона, который может быть первым элементарным актом в цепи реакций, приводящих к повреждению ДНК без участия синглетного кислорода.
Установлена взаимосвязь между типом встраивания Н2(ТМру-Р4) в ДНК и константой скорости тушения триплетного состояния порфирина молекулярным кислородом.
Показано, что при встраивании Zn(TMpy-P4) в poly(dG-dC)2 при малой ионной силе раствора происходит интеркаляция металлопорфирина между парами нуклеиновых оснований, приводящая к потере металлопорфирином аксиального лиганда.
Практическая значимость полученных результатов
В ходе выполнения диссертационной работы был создан автоматизированный лазерный абсорбционный спектрометр, предназначенный для решения широкого круга как научных, так и прикладных задач в области молекулярной спектроскопии, фотохимии и фотобиологии.
Обоснован метод применения порфиринов и металлопорфиринов в качестве зондов, чувствительных к природе и расположению молекул ближайшего окружения либо к экранированности от контакта с молекулярным кислородом, то есть чувствительных к месту локализации порфиринов в ДНК. Данный метод может найти широкое применение для анализа структуры исследуемых комплексов порфирин-ДНК в биофизике, фотобиологии и спектроскопии биологических молекул.
Показана принципиальная возможность фотодинамической активности катионных порфиринов по механизму переноса электрона, без участия синглетного кислорода.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
1) Созданный универсальный двухлучевой кинетический абсорбционный
спектрометр, имеющий длительность импульсов возбуждения и зондирования
12 пс, позволяет исследовать кинетику фотоиндуцированных изменений
поглощения света образцами в спектральном диапазоне 380-1400 нм при
возбуждении на длинах волн 540 нм и 360 нм с погрешностью 1х10"3 единиц
оптической плотности.
-
Пути и механизмы безызлучательной дезактивации нижних возбужденных электронных состояний нефлуоресцирующих металло-порфиринов Си(ТМру-Р4) и Ni(TMpy-P4), встроенных в ДНК, определяются структурой и составом ближайшего к порфирину окружения. В случае интеркаляции этих металлопорфиринов между парами GC оснований ДНК деградация энергии возбуждения носит внутримолекулярный характер и происходит без участия молекул окружения.
-
При внешнем встраивании в бороздки ДНК дезактивация возбужденных состояний Си(ТМру-Р4) и №(ТМру-Р4) происходит с образованием комплекса между металлопорфирином и кислородосодержащими молекулами тимина либо воды из ближайшего окружения, которые выступают в качестве аксиального лиганда иона металла.
-
Время жизни нижнего возбужденного триплетного состояния флуоресцирующих катионных порфиринов Нг(ТМру-Р4) и Zn(TMpy-P4) в их комплексах с ДНК в присутствии растворенного кислорода воздуха изменяется в ~7-10 раз в зависимости от места встраивания порфирина в ДНК, что может быть использовано для изучения распределения порфиринов по типам встраивания.
-
Тушение флуоресценции безметального катионного порфирина Н2(ТМру-Р4), интеркалированного между парами GC оснований ДНК, обусловлено обратимым переносом электрона с гуанина на фотовозбужденный порфирин.
Личный вклад соискателя
Все основные результаты, изложенные в диссертационной работе, получены автором самостоятельно. Постановка задач исследований и интерпретация полученных результатов осуществлялась автором совместно с научным руководителем канд. физ.-мат. наук, ст. науч. сотр. B.C. Чирвоным. Абсорбционные стационарные и пикосекундные кинетические измерения, а также люминесцентные эксперименты были выполнены и обработаны автором лично. И.В. Сазанович принимал участие в исследованиях комплексообразо-
вания Cu-порфирина с олигонуклеотидами на пикосекундном абсорбционном спектрометре. Измерения характеристик триплетных состояний были выполнены совместно с канд. физ.-мат. наук Н.Н. Круком, канд. физ.-мат. наук СМ. Бачило и А.А. Коротким. СМ. Бачило участвовал также в работе по автоматизации пикосекундного абсорбционного спектрометра и помогал в обработке ряда экспериментальных результатов. Доктор физ.-мат. наук, профессор Б.М. Джагаров был инициатором исследований триплетных состояний порфиринов в их комплексах с ДНК и изучения тушения триплетных состояний молекулярным кислородом, принимал участие в обсуждении полученных результатов, консультировал и оказывал помощь на всех этапах работы. Измерения, выполненные методами колебательной спектроскопии, проводились канд. физ.-мат. наук СГ. Кругликом, канд. физ.-мат. наук С.Н. Тереховым и В.В. Ермоленковым. В организации РКР экспериментов и обсуждении их результатов участвовали академик НАН Беларуси П.А. Апанасевич и член-корр. НАН Беларуси В.А. Орлович. В работах по РКР порфиринов автор принимал участие на этапах подготовки экспериментов и обсуждения полученных данных. Профессор П.-И. Турпин любезно предоставил все необходимые для исследований природные ДНК и синтетические поли- и олигонуклеотиды, организовал работу автора в Университете им. Пьери и Марии Кюри (г. Париж, Франция) с целью проведения там отдельных экспериментов и активно участвовал в обсуждении результатов работы на всем протяжении исследований. Водорастворимые катионные порфирины были синтезированы и предоставлены в распоряжение автора канд. хим. наук В.Л. Малиновским.
Апробация результатов работы
Результаты диссертационной работы докладывались на 8-м Международном симпозиуме "Сверхбыстрые процессы в спектроскопии" (Вильнюс, Литва, 1993), 5-й, 6-й, 7-й и 8-й Европейских конференциях по спектроскопии биологических молекул (Лутраки, Греция, 1993; Лилль, Франция, 1995; Мадрид, Испания, 1997; Энсхедэ, Нидерланды, 1999), Республиканской конференции молодых ученых по квантовой электронике (Минск, 1994), 5-й, 6-й и 7-й Международных конференциях "Применения лазеров в науках о жизни" (Минск, 1994; Йена, Германия, 1996; Братислава, Словакия, 1998), 14-й и 15-й Международных конференциях по комбинационному рассеянию света (Гонконг, 1994; Питсбург, США, 1996), 2-м и 3-м съездах Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, 1996, 1998), Международном симпозиуме "Кислород и свободные радикалы" (Гродно, 1996), 16-м Симпозиуме ШРАС по фотохимии (Хельсинки, Финляндия, 1996), 8-й Международной конференции по спектроскопии и
7 химии порфиринов и их аналогов (Минск, 1998). В 1997 году цикл работ «Динамика и механизмы взаимодействий между фоговозбужденными порфиринами и ДНК» был отмечен дипломом первой степени на годовых чтениях ИМАФ НАН Беларуси.
Опубликованность результатов
По материалам диссертации опубликовано 10 статей в научных журналах, 1 обзорная статья в коллективной монографии, 12 работ в сборниках трудов конференций и 11 тезисов докладов. Общий объем опубликованных материалов составляет 153 стр.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, 4-х глав, заключения и списка использованных источников. Полный объем диссертации составляет 140 страниц, включая 7 таблиц и 33 рисунка. Список цитируемой литературы включает 255 наименований.
Похожие диссертации на Кинетика и механизмы дезактивации возбужденных электронных состояний порфиринов, встроенных в ДНК
