Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Безызлучательная передача энергии электронноговозбуждения в полимерных растворах 10
1.1. Перенос энергии электронного возбуждения, как перспективный метод изучения конформационных изменений структуры белка 10
1.2. Экситонный перенос энергии в полимерных цепях 17
1.3. Влияние полимеров на процессы ассоциации красителей 24.
1.4. Применение квантово-химических методов к исследованию экситонных процессов и динамики молекулярных фрагментов в полимерных цепях 29
Глава 2. Объекты, схемы установок и приборная база исследований 35
2.1. Объекты исследования 35
2.2. Схемы и описание установок, используемых для изучения растворов биополимеров и пленок, окрашенных люминофорами 38
2.3. Подготовка экспериментальных образцов 45
Глава 3. Кинетика экситонных процессов в полимерных цепях 47 '
3.1. Генерация и аннигиляция триплетных экситонов в полимерных цепях при ступенчатом лазерном возбуждении сенсибилизаторов 47
3.2. Дистанционная аннигиляция экситонов, изолированных на сопряженных отрезках цепи, в случае медленной диффузии и аннигиляции по механизму Ферстера-Декстера 61
3.3. Квантовохимические расчеты рельефа поверхности потенциальной энергии полимерных цепей в конфигурационном пространстве торсионных углов 74
Глава 4. Перенос энергии электронного возбуждения в бимолекулярном зонде, сорбированном на белке 89
4.1. Кинетика бимолекулярных фотореакций в разбавленных полимерных растворах 89
4.2 Изучение межмолекулярного взаимодействия в двухкомпонентных растворах по спектрам поглощения и люминесценции (краситель и лизоцим, краситель и краситель) 107
4.3 Изучение взаимодействия бимолекулярного зонда с лизоцимом и инсулином по спектрам поглощения и люминесценции 118
4.4. Изменение оптических спектров окрашенных водных растворов лизоцима после лазерной фотомодификации белка 127
Глава 5. Голографический мониторинг лазерной деструкции макроцепей в растворах 136 (
5.1.Формирование и релаксация голографической решетки в растворе полимера 142
5.2. Результаты компьютерного моделирования и выводы 147
5.3. Экспериментальная запись голограмм на красителях, сорбированных на лизоциме 150
Основные результаты 158
Литература 160
- Экситонный перенос энергии в полимерных цепях
- Схемы и описание установок, используемых для изучения растворов биополимеров и пленок, окрашенных люминофорами
- Дистанционная аннигиляция экситонов, изолированных на сопряженных отрезках цепи, в случае медленной диффузии и аннигиляции по механизму Ферстера-Декстера
- Изучение межмолекулярного взаимодействия в двухкомпонентных растворах по спектрам поглощения и люминесценции (краситель и лизоцим, краситель и краситель)
Введение к работе
Проблема детектирования изменения структуры и конформационной подвижности биологических молекул - белков и дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) является одной из важных фундаментальных проблем современной биофизики. Знание и понимание этого процесса позволят определить новые пути решения задачи лечения человеческого организма, а также новые методы и технологии создания современных материалов для различных сторон жизни , общества. Разработка новых материалов по своим параметрам и многофункциональности приближающихся к биологическим структурам позволят значительно улучшить комфортабельность проживания человечества и уменьшить техногенное давление продуктов человеческой деятельности на окружающую среду.
Узкий интервал изменения параметров нахождения биологических молекул в нативном состоянии уменьшает диапазон применения физических методов на биополимеры и затрудняет процесс мониторинга за откликом системы на эти воздействия. В обычном состоянии белки и ДНК находятся в окру- і жении различных молекул и структур организма, которые оказывают существенное влияние на физические процессы, протекающие в биологических полимерах. Изучение in vitro позволяет исследователям не учитывать этого влияния и рассматривать процессы, происходящие непосредственно в биополимере. При этом резко уменьшается количество параметров, которые необходимо контролировать, что значительно облегчает задачу интерпретации результатов экспериментов.
Одним из перспективных неразрушающих методов изучения этой проблемы является перенос энергии электронного возбуждения между фрагмента- * ми изучаемой полимерной структуры. Использование этого явления для детектирования структурных изменений строения макромолекулы позволяет производить не только качественные оценки этих состояний, но и находить численные значения их характеристик. Для процесса переноса энергии электронного
5 возбуждения необходимы два компонента: донор и акцептор энергии. Идея бимолекулярного зонда, когда хотя бы один из компонентов связан с биополимером, наиболее подходит для этой задачи.
Особый интерес представляет явление переноса энергии электронного возбуждения по цепи полимера в связи с задачами деструкции биологической молекулы и создания методов управления процессами наследственных мутаций. Идеология бимолекулярного зонда, когда хотя бы один из компонентов является экситоном, позволяет применять теорию переноса энергии электронного возбуждения к экситонным процессам, протекающим в макромолекуле. Изучение этого процесса в будущем позволит создавать передающие информацию коммутаторы для нанометровых механизмов и наномасштабных компо- , нентов элементной базы электроники.
Важной биолого-экологической и медицинской проблемой является точ
ная оценка деструктурирующего влияния внешнего электромагнитного излуче
ния на ДНК и белки живых клеток. Так, лазерное дробление белков, уступая по
ряду свойств ферментативным целевым реакциям, представляет интерес как
развитие параллельного подхода в достижении общей цели направленной мо
дификации макромолекул. Метод регистрации образовавшихся после фотолиза
продуктов может основываться на измерениях оптической плотности раствора
макромолекул, изменяющейся в области подвергнутой облучению из-за диффу- і
знойного оттока фрагментов цепей в темновую зону (эффект светоиндуциро-
ванной диффузии). Этот простой и удобный в целом метод допускает усовер
шенствование на основе более детального описания процесса диффузии отрез
ков цепей и подвижности звеньев в растворителе. Существует необходимость в
разработке новых методов регистрации продуктов лазерного дробления биопо
лимеров на основе записи голографических решеток на комплексном носителе
биополимер - фотохром. Голографический метод мониторинга обладает рядом
преимуществ по сравнению с методами светоиндуцированной диффузии или
неупругого светорассеяния. Голографические методы исследования характе- 1
ристик растворов макромолекул проще адаптировать к изменениям свойств изучаемых систем путем варьирования периода решетки, длины волны лазерного источника излучения и модификации математической модели релаксации голограммы.
Цель диссертационной работы состояла в определении механизмов бе- і зызлучательной трансформации энергии электронного возбуждения в растворах биополимеров и обнаружении зависимости между их конформационными состояниями и кинетикой фотопроцессов. Она предполагает исследование механизмов передачи энергии электронного возбуждения дистанционно и по цепи полимера, а также в рамках идеи бимолекулярного зонда рассмотрение влияния различных состояний макромолекулы на скорость этой передачи и определения влияние движения участков биополимерной цепи на процессы переноса энергии. Для этого необходимо было провести спектрально-люминесцентное исследование фотофизических процессов с участием молекул сложных органиче- > ских веществ и установить степень влияния белков на процесс переноса энергии электронного возбуждения в зависимости от вида белковой молекулы и типа растворителя.
В частности в задачи исследования входило: -
- Экспериментально обнаружить возникновение и диффузию триплетных
экситонов по полимерной цепи.
Создать теоретическую модель кросс-аннигиляции триплетных экситонов с Т-центрами сенсибилизаторов на полимерной цепи.
- Построить теоретическую модель бимолекулярных фотореакции в 1
разбавленных полимерных растворах
Экспериментально исследовать особенности переноса энергии электронного возбуждения между различными донорно-акцепторными парами для различных растворов белковых молекул
- Исследовать влияния деструкции окрашенных белков на спектрально-
люминесцентные свойства раствора, процесс переноса энергии элек
тронного возбуждения и биологическую активность белка. Определе
ние параметров деструкции полимера - Построить теоретическую
модель голографического мониторинга
лазерной деструкции макроцепей в растворах
- Создать теоретическую модель дистанционной аннигиляции «изолиро
ванных» экситонов на отрезках полимерной цепи с дефектами барьер- і
ного типа на границах
- Провести квантовохимические построения адиабатических термов мак-
ромолекул для различных значений торсионных углов, определяющих конформацию полимерной цепи. Научная новизна работы
Установлена зависимость между конформационным (клубковым или глобулярным) состоянием макромолекулы и кинетикой диффузионно-контролируемого тушения люминесцентного сигнала подвижных молекулярных зондов, взаимодействующих с ловушками-стоками, закреплен- 1 ными на полимерной цепи.
Исследован кинетический режим дистанционной аннигиляции экситонов на полимерной цепи разделенных дефектами барьерного типа.
Построены поверхности адиабатического потенциала для ряда пар
аминокислотных остатков биополимеров.
4. Показано влияние концентрации биополимеров на спектр люминесценции
бимолекулярного люминесцентного зонда.
5. Исследовано влияние на лазерную деструкцию лизоцима красителей ксан-
тенового ряда, образующих с белком комплексное соединение. 1
6. Выяснено влияние деструкции лизоцима на ферментативную активность
белка, воздействующего на клетки Micrococcus luteus.
8 Научная и практическая значимость результатов.
Результаты исследования фотофизических процессов в растворах биополимеров расширили представления о характере взаимодействия света и вещества в сложных молекулярных системах. Полученные результаты могут использоваться для развития методик люминесцентных измерений параметров фотофизических процессов, проходящих в биологических структурах. Доказана необходимость учета конформационного состояния полимер ной цепи при флуоресцентных исследованиях с использованием бимолекулярного зонда, когда акцептор энергии адсорбируется цепью маромолекулы, что позволяет интерпретировать сложные закономерности, наблюдаемые в экспериментах с биосистемами. Использование передачи энергии по цепи полимера позволит реализовать идею создания элементной базы молекулярной наноэлек-троники и биоэлектроники.
Пбнимание механизмов влияния биополимеров на передачу энергии электронного возбуждения позволит использовать это явление для диагностики и лечения некоторых заболеваний человека .
На защиту выносятся следующие положения
1. Наблюдаемое резкое тушение возбужденных триплетных центров в по
лимерных матрицах дополнительным лазерным излучением
(А,=610 нм) обусловлено генерацией триплетных экситонов в полимерных цепях для бинарных систем «сенсибилизатор-полимер», энергетическая структура которых удовлетворяет условию двойного резонанса.
Сигнал свечения бимолекулярного люминесцентного зонда чувствителен к пространственной структуре макромолекулярной цепи в растворе, на которой находятся молекулы одного из компонентов зонда.
Параметры записи голографических решеток чувствительны к структурным характеристикам биополимерных цепей, включая и такие из них, как контурная длина цепи или ее фрагментов, а также характеристикам вязкоупругости полимерных пленок.
9 Апробация работы. Основные результаты работы были обсуждены на следующих научных семинарах и конференциях:
Третья всероссийская научная конференция «Физические проблем экологии (экологическая физика)» (Москва, МГУ, 2001)
Региональная научно-практическая конференция ученых и специалистов Оренбургской области (Оренбург, ГОУ ОГУ, 2004)
III Съезд биофизиков России (Воронеж, 2004)
Третья международная научная конференция. «Фундаментальные проблемы физики» (Казань, КГУ, 2005)
Всероссийская научно-практическая конференция «Вызовы XXI века и образование» (Оренбург, ГОУ ОГУ, 2006)
Russian-Japanese Seminar «Molecular and Biophysical Magnetoscience». Proceedings (Orenburg, OSU, 2006)
Всероссийская научно-практическая конференция «Развитие университетского комплекса как фактор повышения инновационного и образовательного потенциала региона» (Оренбург, ОГУ, 2007)
LALS 2007 International Conference on Laser Application in Life Sciences (Moscow, MSU, 2007)
The second Russian-Japanese seminar "Molecular and Magneto Science" (Orenburg, OSU, 2007)
Всероссийская научно-практическая конференция «Интеграция науки и образования как условие повышения качества подготовки специалистов» (Оребург, ГОУ ОГУ, 2008)
V Международная научная конференция «Прочность и разрушение материалов и конструкций» (Оренбург, ГОУ ОГУ, 2008)
Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, список которых приводится в разделе литература.
Экситонный перенос энергии в полимерных цепях
В отношении электронных свойств идеальная цепь однородного полимера представляет собой линейный кристалл. Это означает, что в такой системе могут существовать коллективные электронные возбуждения в виде ЭКСИТОНОВ j и даже более сложных по структуре квазичастиц, (например, экситонных соли-тонов), возникающих в трансляционно-инвариантных объектах. Так, работами В.Л. Ермолаева - Г.И. Дашкова и М.В. Алфимова - Ю.Б. Шекки была доказана возможность миграции электронной энергии по триплетным уровням ароматических ядер в синтетических несопряженных полимерах [5]. В ряде работ наблюдалась сенсибилизированная фосфоресценция примеси бензила в поливи-нилфталимиде. В других работах исследовался перенос энергии электронного возбуждения в поли-ГЧ-винилкарбазоле. В серии работ R.B. Fox и R.F. Cozzens (1969, 1971-1972) было показано, что тушение фосфоресценции макромолекул \ осуществляется при значительно меньших концентрациях акцептора, чем при ее тушении у соответствующих мономолекулярных соединений [5]. Доказательством миграции триплетной энергии по цепи полимера служило наблюдение аннигиляционной замедленной флуоресценции, сопровождающей слияние двух триплетных экситонов с образованием локального синглетного возбуждения. Было показано (W. Klopffer, 1969), что интенсивность такого свечения в растворе полимера растет с увеличением длины (молекулярного веса) макромолекул. Макромолекулы типа поли-Ы-винилкарбазола (ПВК) представляют собой углеродные цепи с ароматическими боковыми группами, ж -электронные системы которых определяют, в основном, оптические свойства полимеров. Миграция электронных возбуждений (синглетных и триплетных) происходит по этим группам [65]. Известно, что расстояние между хромофорами для ПВК составляет величину 2,5 А. В серии работ В.Н. Ящука с соавторами [66-68] исследовалась эффективность переноса энергии при изменении расстояния между хромофорными группами, путем введения в цепь «нейтраль- і ных» участков. Совокупность данных по сигналам флуоресценции, фосфоресценции и замедленной флуоресценции аннигиляционного типа свидетельствовала в пользу переноса энергии возбуждения по макроцепи ПВК. В [69] изучались особенности триплетного экситонного прыжкового механизма переноса энергии в несопряженных полимерах с подвешенными к основной цепи бензо-фенонподобными группами. Исследовался сополимер метилметакрилата с ме-такрилатом, монопропандиол эфира бензофенонкарбоновой кислоты (БКК-ММА) с различным содержанием групп бензофенона. Были получены спектры поглощения и люминесценции растворов БКК-ММА, определены зависимости і интенсивности фосфоресценции от интенсивности возбуждающего света, и зависимости степени поляризации от содержания звеньев БКК в сополимере. Оказалось, что миграция Т-экситонов и их эффективная аннигиляция в макромолекулах БКК-ММА осуществляется, начиная с 33%-ого содержания бензо-феноноподобных звеньев. Критическое расстояние прыжка для триплетных экситонов в изучаемых полимерах оценено авторами [68] в 20 А.
Одним из новых интересных эффектов, наблюдающихся в полимерах в отличие от мономерных систем, является образование эксимеров между различными частями одной и той же молекулы. Поскольку каждая макромолекула имеет множество хромофорных групп, способных образовывать эксимеры, эк-симерная флуоресценция относительно независима от концентрации полимера: в противоположность этому в мономерных системах эффективность образования эксимеров сильно зависит от концентрации. Образование эксимеров может происходить лишь в результате миграции синглетных экситонов вдоль полимерной цепи. Учитывая конформационное многообразие состояний цепи по сравнению с трехмерными кристаллическими структурами можно ожидать, что движение экситонов в полимерах носит некогерентный (прыжковый) характер вплоть до очень низких температур [69].
В [70] Чакраборти и Бурхартом наблюдалась замедленная флуоресценция (ЗФ) и замедленная эксимерная флуоресценция жидких растворов поли(2 винилнафталина) в наносекундном режиме. Измерялась временная зависимость сигналов свечения раствора при температуре окружающей среды. Было установлено, что в пределах временного разрешения приборов сигнал ЗФ монотон-н о убывает со временем, а максимум интенсивности эксимерной ЗФ приходится на время около 300 не. Особенности временной зависимости сигнала эксимерной ЗФ указывали на то, что один из триплетных экситонов должен быть захвачен ловушкой перед совершением аннигиляции. Авторами [70] выдвинуто предположение о том, что контроль скорости захвата триплетных возбуждений ловушками может осуществляться внутренним вращением скелета цепи.
Ермолаев В.Л. и Лашков Г.И. сделали оценку величины коэффициента і диффузии триплетной энергии в поливинилкарбазоле. Из измерений квантового выхода фотоизомеризации, сенсибилизированной слоем ПВК определялось среднее расстояние, проходимое триплетными экситонами до поверхности полимерной пленки. Рассматривалось два типа граничных условий на поверхности раздела полимер-раствор: отражение и захват. В первой модели для коэф 20 фициента диффузии D получена оценка D-10"5 см2/с, в то время как во второй -D-10" см /с. Теоретическое рассмотрение проблемы миграции триплетных экситонов в полистироле и поливинилнафталине (M.T.Vala, R.Silbey, S.A.Rice, J.Jortner, 1964) показало, что давыдовское расщепление вследствие обменных взаимодействий между ароматическими ядрами в полистироле ( А « 0.46 см"1) и поливинилнафталине (А «2.6 см"1) значительно меньше, чем давыдовское расщепление в кристаллах бензола и нафталина (А«30 см"1). Авторы связывают это с относительно большой величиной расстояния между ароматическими ядрами в макроцепях.
Прямые доказательства переноса энергии с высоких триплетных уровней органических молекул на молекулы растворителя впервые представлены М.В.Алфимовым, И.Г.Батехой и В.А.Смирновым. Были проведены систематические измерения эффективности переноса от природы молекул зонда и растворителя.
В последние годы интерес к электронным, и экситонным - в том числе, процессам в макромолекулах и молекулярных агрегатах значительно возрос [69-71]. В наноструктурах и системах с пониженной пространственной размерностью вступают в игру новые факторы, и формируются иные закономерности, нетипичные для процессов в объемной фазе. Так в ID-структурах становится важной роль флуктуационных эффектов. Нарушения периодической структуры цепи приводят к утрате экситонами их когерентных свойств, или даже к полной локализации возбуждений на дефектах [72,73].
Схемы и описание установок, используемых для изучения растворов биополимеров и пленок, окрашенных люминофорами
Спектры пропускания и флуоресценции измерялись на универсальной спектроскопической установке (рисунок 12). В качестве источника света использовалась водородная лампа с широким спектром излучения. Дифракционная решётка применялась в случае селективного возбуждения, настройка решётки 3 проводилась, с заменой кюветы 5 на зеркало, по монохроматору 7. Возбуждающий свет фокусировался линзой с фокусным расстоянием f=5 см в центр кюветы с исследуемым раствором. В нашем эксперименте диаметр луча в области перетяжки был равен 0.1 мм. Люминесценция снималась как под острым углом, так и под углом 90 градусов. Для снятия спектров пропускания дифракционная решетка убиралась, устанавливалась система из двух отражательных зеркал 13, 14 для направления потока зондирующего излучения на исследуемый образец. Луч света пропускался через исследуемую кювету и направлялся в монохроматор. Работа установки контролировалась при помощи унифицированного пакета программ SpLab. Регистрация и обработка полученных данных осуществлялась с помощью компьютера.
Исследование люминесценции и пропускания экспериментальных растворов, проводилось также на автоматизированной спектроскопической установке «Флюорат-02-Панорама», блок схема которой приведена на рисунке 12. Данная установка полностью автоматизирована и алгоритм её работы следу 40 ющий: после включения в сеть установки на компьютере, запускается программа управления установкой. После ввода идентификационных данных оператора, открывается главное меню программы. В окне меню выбирается тип измерений, спектральные, кинетические, хроматографические или динамические. После выбора типа измерений открывается меню прибора, здесь необходимо произвести следующие настройки. Схему сканирования (по регистрации или по возбуждению), количество вспышек лампы для усреднения, длину волны возбуждения (для случая сканирования по регистрации), диапазон монохроматора регистрации (для случая сканирования по регистрации),
Для получения спектра пропускания исследуемого раствора, необходимо выбрать подменю сканирование по возбуждению, при этом монохроматор 2 последовательно, с шагом от 1 до 10 нм облучает кювету в заданном интервале длин волн, прошедший свет регистрирует фотодиод 8. В итоге получается график зависимости 1(A). Вместе с тем в установке автоматически регистрируются данные фотодиода 4 (канала нормирующего сигнала), эти данные необходимы 1 для коррекции неоднородности в спектре излучения лампы и учёта изменения интенсивности её свечения, вследствие перепадов напряжения в сети. Кроме того, аналогичным способом строится график IQ(A) для чистого растворителя (в нашем случае вода).
Спектр люминесценции, строится несколько иным способом. В главном меню программы выбирается подменю сканирование по регистрации, моно- \ хроматор возбуждения 2 устанавливается на выбранную, постоянную длину волны, а монохроматор 6 при этом последовательно выделяет из сигнала люминесценции от кюветы заданный интервал длин волн, посылая его в ФЭУ 7. Как и в случае сканирования по возбуждению, установка автоматически регистрирует опорный сигнал IQ, И после обработки получается график зависимости — (я). h Универсальная голографическая установка Лазерная деструкции биополимеров и голографического мониторинга процесса фотолиза производилась на соответствующей установке (рисунок 13). Принцип действия голографической установки: после соответствующий деструкции биополимерных цепей, производится запись голограммы на подготов-ленном растворе с помощью твердотельного лазера на неодиме YAG: Nd (вторая гармоника, Я =532 нм) LQ-529. Для этого излучение лазера при помощи полупрозрачного зеркала делится два луча, и сводится на образце глухими зеркалами. Для уменьшения размера пятна и увеличения мощности записывающего лазера использовалась собирающая линза, фокусирующая пучки накачки в пятно диаметром 0.2- 0.5 мм. Для регистрации дифракционной эффективности тонкой элементарной решетки применялся луч гелий-неонового лазера ЛГН-72 3, с длинной волны 632.8 нм. Далее: осуществлялось фотографирование дифракционной картины или дифрагированный луч пропускался через монохроматор МДР-41 настроенный на длину волны 632.8 нм, и его интенсивность регистрировалась при помощи ФЭУ-79 5. Сигнал с ФЭУ оцифровывался при помощи АЦП крейта «КАМАК» с минимальным временем дискретизации 50 не и в дальнейшем обрабатывался компьютером.
Дистанционная аннигиляция экситонов, изолированных на сопряженных отрезках цепи, в случае медленной диффузии и аннигиляции по механизму Ферстера-Декстера
В случае дефектов барьерного типа в интервалах, содержащих нечетное число экситонов, на асимптотической временной стадии остаются единичные, избежавшие аннигиляции возбуждения. Эти отдельные экситоны способны блуждать в ограниченной области интервала, отражаясь от барьеров на его концах. Таким образом, экситоны на сопряженных отрезках цепи могут, не вступая в тесный контакт, проаннигилировать между собой дистанционно, причем вероятность (в единицу времени) акта слияния возбуждений тем выше, чем меньше расстояние х между квазичастицами. В результате стохастического движения экситонов величина x=x(t) является случайным процессом, поэтому кинетика надбарьерной биэкситонной аннигиляции будет модулироваться диффузионным перемещением реагентов. Рассмотрим случай медленного движение экситонов по сравнению со скоростью U их слияния. В этом случае процесс является адиабатическим, и в любой момент времени t скорость U успевает сформироваться в том виде, который был получен в рамках нерелятивистской квантовой механики для пары неподвижных взаимодействующих молекул в работах Ферстера и Декстера [83, 85].
Трехчастичная функция распределения f3(x,x ,x",t)B интегральном слагаемом второго уравнения в свою очередь определяется через [160, 161] f4(x,x ,..., t),f5(x,x ,..., t) и т.д. Это означает, что для строгого описания кинетики квазиизолированных на отрезках цепи экситонов необходимо рассматривать одновременно как можно больше отрезков. Взаимодействие квазичастиц осуществляется через барьер между смежными отрезками, но таким образом, связывает и достаточно удаленные друг от друга участки цепи.
Одномерное блуждание экситонов на отрезке полимерной цепи, ограниченной примесными центрами барьерного типа. Примесные молекулы размера а показаны кружками. Над ними изображена конфигурация отталкивательного барьерного потенциала. Аннигиляция экситонов происходит дистанционно, на расстояниях превыщаю-щих радиус а. Реакция наиболее эффективна при одновременном приближении двух экситонов с разных сторон к одному и тому же барьеру.
Последнее интегральное слагаемое в (3.26) учитывает трехчастичные корреляции. Подинтегральные факторы g(x,x",t)g(x ,x",t) в нем упрощаются в силу того, что g(x,x",t)— 1, если область Хг граничит с Хг, и g(x ,x",t)— l, если область Хг сопряжена с областью X,. Это следует из того, что взаимная дистанционная аннигиляция экситонов через промежуточный отрезок X,, или X, маловероятна. Нетрудно заметить, что при малой дисперсии длин отрезков /,/ ,/" от среднего значения (/) интегральные члены в (3.26) будут взаимно компенсироваться. Малым будет их влияние и при достаточно высокой подвижности возбуждений (большое D), а также невысоком уровне средней плотности экситонов n,{t).
Законы распада средних электронных плотностей n,(t)n nv{t) различны, что является отражением флуктуационного эффекта. Его суть в том, что экси-тон на отрезке Х1 большей длины / обладает и большей выживаемостью, поскольку меньше времени проводит в «аннигиляционно активной зоне» вблизи барьера. По этой причине проблемным является нахождение решения уравнения (3.25) (необходимо решить систему нелинейных уравнений относительно плотностей n,(t)n nv(t)\ даже при условии успешного определения на основе (3.27) корреляционной функции g(x,x ,t).
При равенстве длин смежных отрезков / = / собственные функции (3.37) могут оказаться вырожденными. Так парные комбинации vx = {km} и v2 = {тк} отвечают одному и тому же собственному значению А2кт=Л2тк. Это вынуждает использовать специальный вариант теории возмущений, учитывающий наличие вырождения. Совпадения чисел vx={kxmx) и v2={k2m2) не связанные с простой перестановкой {km} имеют место, когда выполняется равенство кх + тх =к2 +m2=R , то есть лишь для достаточно высоких значений номеров кит. Принимая во внимание, что в дальнейшем нас будут интересовать лишь малые по модулю собственные значения Л2т (знак тильды « » означает учет возмущения), мы будем игнорировать такое — «случайное» вырождение. Тогда в рамках принятого допущения вырождение можно считать двукратным. Этот случай детально исследован теоретиками, и результаты приведены, например, в [163-163].
Выражения (3.39)-(3.42) могут быть использованы и в случае квазивырождения, и даже в отсутствие вырождения. Просто в последнем варианте они переходят в обычные формулы теории возмущений для невырожденных состояний.
При вычислении корреляционной функции с использованием теории возмущения в построенных графиках наблюдается убывание во времени плотности корреляционной функции до нуля. Из рисунка 30 отчетливо видно усиление эффекта немонотонной временной зависимости Qn (t) эффективной скорости аннигиляции во втором порядке теории возмущения, что приводит к усилению распада средней концентрации экситонов на отрезке (рисунки 32 и 34). Для формирования величины, которая непосредственно может быть сопоставлена наблюдаемым в экспериментах кинетическим зависимостям, выражения (3.31)-(3.32) необходимо усреднить по длинам отрезков /,/ .
Изучение межмолекулярного взаимодействия в двухкомпонентных растворах по спектрам поглощения и люминесценции (краситель и лизоцим, краситель и краситель)
Для решения поставленной задачи необходимо создание молекулярной системы молекул в растворе с образованием достаточно сильной связи белка лизоцим с красителем. Для подбора красителя, образующего такую связь, снимался электронный спектр поглощения в водном растворе. Спектры поглощения водного раствора лизоцима представлены на рисунке 65 (а и б). Данные спектры приведены для сравнения со спектрами окрашенных водных растворов лизоцима. На рисунках 66 - 70 приведены электронные спектры поглощения окрашенных водных растворов лизоцима. Спектры поглощения метиленового синего, родамина 6G, малахитово зеленого не изменяли положения своих максимумов при смешивании с водным раствором лизоцима. Таким образом, мы считаем, что данные красители не образуют сильной связи с лизоцимом в воде, (рисунки 66 - 68).
Спектры поглощения водного раствора эозина Н и эритрозина изменяли положения своих максимумов при смешивании с водным раствором лизоцимом на 6 — 9нм., что говорит об образовании комплексов этих красителей с лизоцимом и о существовании достаточно сильной связи между ними (рисунки 69,70). Электронные спектры поглощения окрашенных растворов регистрировались спустя несколько минут после добавления лизоцима.
На основании вышеуказанного можно заключить, что эозин Н и эритрозин подходят в качестве акцептора энергии в бимолекулярном зонде, где в качестве донора энергии использовался родамин 6G. Максимумы поглощения эритрозина и родамина 6G совпадают и находятся на длине волны 530 нм. Максимум поглощения красителя эозина Н приходиться на 515 нм. При этом собственная люминесценция эозина Н значительно сильнее, чем у эритрозина (рисунок 71), в силу большего квантового выхода люминесценции. Концентрационные спектры эозина Н при широкополосном возбуждении показывают, что с ростом концентрации красителя вершина графика смещается в длинноволновую область спектра с одновременным уменьшением интенсивности люминесценции (рисунок 72). Концентрации красителя при этом изменялась почти на порядок от 5.7 10"5 М до 4 10"4 М, а максимум спектра смещался на 15 нм.
При смешивании эозина Н и лизоцима (рисунок 73) наблюдается уменьшение интенсивности люминесценции на порядок, а максимум интенсивности смещается на 22 нм в длинноволновую область, что подтверждает вывод об образовании комплекса между красителем и белком.
Люминесцентные эксперименты, проводимые с растворами эозин Н и родамин 6G, взятыми в одинаковой концентрации (по 1x10" М) показали, что при смешивании, спектры излучения композитной системы претерпевают существенные изменения. Этот факт был установлен из анализа спектра люминесценции смеси (рисунок 74). На графике хорошо видно, что после смешивания, спектр люминесценции сильно изменяется. Максимум смещается на 50 нм в длинноволновую область, а интенсивность уменьшается в 25 раз по отношению к интенсивности излучения родамина 6G. Это свидетельствует об образовании і нового комплексного соединения с малым квантовым выходом люминесцеции.
При изучении образования комплекса лизоцим - краситель «эритрозин» (рисунок 76), наблюдается уменьшение интенсивности люминесценции люми- . нофора втрое, а точка максимума графика смещается в длинноволновую область на 18 нм. Это подтверждает сделанный выше вывод об образовании достаточно сильной связи с белком. Через пять часов интенсивность люминесценции раствора уменьшалась на четверть, и максимум интенсивности сдвигался в длинноволновую область на 2 нм. Это говорит об увеличении доли люминофора, взаимодействующего с лизоцимом, и косвенно подтверждает тот факт, что аминокислотные остатки, с которым он взаимодействует, могут находиться в глубине белкового клубка или глобулы.
При рассмотрении графиков люминесценции смеси родамин 6G - эритро-зин (рисунок 75) можно сделать вывод об образовании комплексного соединения между этими красителями. В спектре максимум интенсивности графика смещался на 30 нм в длинноволновую область, и его интенсивность уменьшалась на порядок.
Для изучения свойств комплекса были сняты спектры люминесценции смеси родамин 6G - эритрозин в зависимости от длины волны возбуждающего света (рисунки 77-80). Как видно из графиков, определенной длины волны возбуждения для смеси с различными концентрациями, когда люминесценция смеси была бы максимальна, не существует. Снятие люминесцентных спектров смеси в зависимости от концентрации красителя выявили тенденцию уменьшения интенсивности коротковолновой полосы люминесценции и возрастание длинноволновой полосы, которая ответственна за люминесценцию комплекса родамин 6G - эритрозин и ассоциатов родамина 6G с ростом концентрации родамина 6G (рисунок 81).
При снятии спектров люминесценции водного раствора красителя родамин 6G - лизоцим с увеличением концентрации белка наблюдалась снижение і интенсивности люминесценции люминофора с выходом на постоянное значение (рисунки 83, 84). Подобные изменения могут означать, что происходит уменьшение концентрации красителя в жидкой фазе раствора, вследствие связывания части катионов люминофора с ионизированными карбоксильными группами -СОО" аминокислот [130]. В белке лизоцим имеются отрицательно заряженные полярные R- группы: восемь аминокислотных остатков аспарагиновой кислоты -CH2-COO" , один остаток глутаминовой кислоты -СН2-СН2-СОО" и карбоксильный остаток лейцина. Для изучения временных параметров характера связывания аминокислотных остатков и родамина 6G были проведены эксперимен- ты с теми же растворами, но уже через 5 часов после приготовления. При этом интенсивность люминесценции красителя незначительно снижалась (рисунок 85), а спектры поглощения этих же растворов сразу после приготовления и через пять часов остаются постоянными (рисунок 86). Неизменность спектров поглощения, говорит о том, что все процессы смешивания и образования различных комплексов и ассоциатов, завершаются в первые минуты после смешивания, а взаимодействие белка и люминофора носит более продолжительный характер [159]. Кроме того, из рисунка 86 видно, что при данной концентрации, родамин 6G образует димеры с энергией ассоциации порядка 0.6 эВ [159].
С целью изучения влияния растворителя на свойства комплекса эритрозин родамин 6G были сняты спектры люминесценции смеси в физиологическом растворе. В этом растворителе при данной концентрации красителей не наблю дается образование комплекса между ними (рисунок 87). Через 10 минут спустя график спектра не изменялся. Это подтверждает то, что возможные взаимодей ствия в смеси уже произошли. , Следующей парой красителей, взятых в качестве бимолекулярного зонда, стали родамин 6G - метиленовый синий (молярная масса 320 г/моль). Спектры поглощения люминофоров изображены соответственно на рисунках 666 и 686. Эксперименты, проведённые с данной парой красителей, показали, что они не подвержены образованию комплекса между собой, что подтверждается спектрами поглощения смеси красителей (рисунок 89). Однако эффективный перенос энергии между родамином 6G и метиленовым синим, отсутствовал. Изменение интенсивности спектра люминесценции родамина 6G (рисунок 88) в присутствии метиленовый синего, можно объяснить эффектом поглощения излу- і чения люминесценции родамина 6G красителем — метиленовым синим. Возбуждение проводилось селективно на длине волны 450 нм. Ермолаев В.Л. наблюдал перенос энергии в растворе, представляющем собой смесь воды с гли 113 церином с красителями родамин 6G - малахитово зелёный [5].
