Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Спектроскопия ЛИФ органического вещества в морской воде 11
1.1 Лазерная флуориметрия в исследованиях процессов воспроизводства органического вещества фитопланктоном 13
1.2. Восстановление биооптических параметров морской воды из спектров лазерной индуцированной флуоресценции 18
1.3 Исследование флуоресценции растворенного органического вещества и определение его природы 29
Глава II. Экспериментальные комплексы для исследования спектров лазерной индуцированной флуоресценции морской воды 36
2.1. Лабораторный спектральный комплекс для измерения ЛИФ спектров морской воды и клеток фитопланктона 37
2.2. Малогабаритный судовой прокачиваемый флуориметр 40
2.3. Алгоритмы обработки экспериментальных данных для определения биооптических параметров ЛИФ спектров 52
Глава III. Исследование динамики ЛИФ спектров в процессе деградации растворённого органического вещества и гибели клеток фитопланктона 67
3.1. Спектры ЛИФ при возбуждении второй и третьей гармоникой излучения Nd: YAG лазера 69
3.2. Динамика ЛИФ спектров в процессе деградации клеток фитопланктона 77
3.3. Соотношение между биооптическими компонентами ЛИФ спектра на различных стадиях развития клеток фитопланктона (Q-C диаграммы рассеяния при одночастотном возбуждении ЛИФ спектров) 84
Заключение 94
Литература 95
- Восстановление биооптических параметров морской воды из спектров лазерной индуцированной флуоресценции
- Исследование флуоресценции растворенного органического вещества и определение его природы
- Малогабаритный судовой прокачиваемый флуориметр
- Динамика ЛИФ спектров в процессе деградации клеток фитопланктона
Введение к работе
К настоящему времени методы лазерной спектроскопии широко
* используются в исследованиях океана и атмосферы, внедрение лазерных
методов позволяет ставить и решать задачи мониторинга на новом
качественном уровне [1,2]. Отличительной особенностью этих методов
является то, что они позволяют оперативно измерять параметры среды или
биологических объектов на молекулярном уровне, обеспечивая при этом
высокое пространственное и временное разрешение. Возможность установки
лазерных спектрометров на авианосителях, спутниках или судах позволяет
проводить измерения на больших морских акваториях и исследовать
процессы, протекающие в синоптических и климатических масштабах [3-5].
* Особенно интересными являются результаты, полученные при
исследовании фитопланктонных сообществ с использованием методов
лазерной спектроскопии [6-9,12]. Эти результаты показывают перспективу
разработки новых оперативных лазерных технологий исследования
фитопланктонных сообществ. Возможность оперативного и дистанционного
измерения спектров лазерной индуцированной флуоресценции (ЛИФ) клеток
фитопланктона и органического вещества, присутствующего в морской воде
в различных формах, позволяет осуществлять мониторинг состояния
фотосинтетического аппарата клеток фитопланктона и исследовать
воздействие процессов различной природы, которые протекают в океане и
атмосфере, на фитопланктонные сообщества.
Актуальность проведения исследования динамики спектров ЛИФ в процессе жизнедеятельности клеток фитопланктона вызвана необходимостью разработки новых оперативных методов исследования состояния фитопланктонных сообществ и изучения процессов циркуляции органического вещества в океане. Именно эти задачи встают на первое место при изучении воздействия климатических изменений на состояние фитопланктона. В последнее время, в связи с резкими климатическими
изменениями, которые фиксируются на Планете, встаёт вопрос о разработке методов воздействия на систему океан-атмосфера в глобальном масштабе, которые способны были бы стабилизировать эти изменения [10]. Один из таких методов предлагает воздействие на баланс парниковых газов в атмосфере (в основном двуокиси углерода - С02) за счёт значительного увеличения концентрации хлорофилла - А (фитопланктона) в фотическом слое океана на значительных морских акваториях [6,14]. Однако, исследование возможности использования таких методов воздействия в глобальных масштабах требует разработки новых оперативных методов комплексного мониторинга, как параметров атмосферы и океана, так и параметров, характеризующих фитопланктонные сообщества и циклы воспроизводства и превращения углерода в Мировом Океане. Метод спектроскопии ЛИФ, к настоящему времени, демонстрирует хорошие возможности для решения некоторых из выше перечисленных задач мониторинга углерода, находящегося в Океане в различных формах. Оперативные измерения концентрации хлорофилла «А», с использованием метода ЛИФ, на больших пространственных масштабах позволяют осуществлять коррекцию спутниковых алгоритмов восстановления основных биооптических параметров морской воды [4,11]. Это позволяет разрабатывать региональные алгоритмы восстановления концентрации хлорофилла «А» из данных спутниковых сканеров цвета морской поверхности, включая морские воды второго типа. В отличии от традиционных методов калибровки данных спутниковых сканеров цвета морской поверхности с использованием контактных измерений, метод, основанный на измерении спектров ЛИФ позволяет получить значительную большую статистику измерений и повысить таким образом достоверность сравнительного анализа со спутниковыми данными [11].
Спектры ЛИФ содержат информацию о растворённом органическом веществе в морской воде, причём, в отличии от спектров поглощения,
спектры ЛИФ дают возможность выделить вклад «молодого» РОВ в общий сигнал флуоресценции всего РОВ, что позволяет проводить отработку методики измерения темпов воспроизводства растворённого органического вещества фитопланктонными сообществами [4,9], исследовать результаты воздействия крупномасштабных процессов на состояние фотосинтетического аппарата клеток фитопланктона [13,15]. В работах [4,9], принципиально, решены вопросы, связанные с разработкой метода мониторинга процессов воспроизводства растворённого органического вещества клетками фитопланктона с использованием спектроскопии ЛИФ. Однако, необходимо дальнейшее исследование динамики спектров ЛИФ в процессе гибели клеток фитопланктона и дальнейшей деградации органического вещества, произведенного в процессе реакции фотосинтеза. Эти исследования обеспечат понимание физических процессов, лежащих в основе вариации параметров спектров ЛИФ в процессе деградации органического вещества, а так же позволят ввести количественные параметры, характеризующие динамику спектров ЛИФ и процессы деградации органического вещества в морской воде. В связи с вышесказанным задачи, тема исследований настоящей работы является актуальной.
Целью данной работы являлось исследование динамики спектров ЛИФ морской воды, содержащей РОВ и клетки фитопланктона, в процессе гибели клеток и деградации РОВ, при двухчастотном возбуждении лазерной индуцированной флуоресценции морской воды. В работе решались следующие задачи:
1. Экспериментально исследовать динамику спектров ЛИФ в процессе жизнедеятельности и гибели клеток фитопланктона. Для решения этой задачи необходимо разработать методику измерений и лабораторный экспериментальный комплекс. Изучить динамику интенсивности линии флуоресценции хлорофилла «А» при возбуждении лазерным излучением с различными длинами волн, а так же динамику параметра, описывающего
интегральную по спектру интенсивность флуоресценции растворённого в морской воде органического вещества.
* 2. Сравнить эффективность возбуждения флуоресценции хлорофилла «А» и
растворённого в морской воде органического вещества при использовании
второй и третьей гармоники излучения NdrYAG лазера (532 нм и 355 нм,
соответственно).
3. Применить полученные результаты для исследования процессов воспроизводства РОВ клетками фитопланктона в натурных условиях, для чего провести разработку программного комплекса для автоматизированной обработки спектров ЛИФ:
Разработать процедуру фильтрации резких скачков интенсивности
* сигнала флуоресценции в одном спектральном интервале. Резкие выбросы по
интенсивности в ЛИФ спектрах наблюдаются вследствие флуктуации
интенсивности рассеянного излучения, которое обусловлено наличием
взвеси в прокачиваемом объёме морской воде. Подобная процедура
необходима для фильтрации «сбойных» спектров и уменьшения суммарной
ошибки измерения биооптических параметров спектров ЛИФ;
Фильтрация «сбойных» спектров, которые получаются, в основном, из-за высокочастотных наводок по сети электропитания флуориметра при I
работе в судовых условиях;
Процедура смещения спектров ЛИФ, такие спектры появляются в результате сбоя при привязке ЛИФ спектров к шкале длин волн, число этих спектров составляет примерно 2% от общего числа. Данная процедура была разработана для того, чтобы привести все сбойные спектры к истинной шкале длин волн;
Двумерная медианная фильтрация, которая является окончательной фильтрацией одиночных и по длине волны излучения, и по времени измерений.
Процедура сглаживание ЛИФ спектров, которая состоит в усреднении спектров как по длинам волн испускания флуоресценции, так и по времени измерения спектра;
Процедура аппроксимация ЛИФ спектра, которая позволяет провести учёт спектральной функции пропускания спектрометра ЛИФ и осуществить разложение спектра на соответствующие компоненты (линии флуоресценции основного и дополнительных пигментов, линию комбинационного рассеяния воды, широкополосную флуоресценцию РОВ).
4. Провести калибровку и измерение спектральных характеристик малогабаритного судового спектрометра ЛИФ. Данный спектрометр был разработан для осуществления натурных измерений спектров ЛИФ и применения результатов лабораторных экспериментов к натурным условиям. Корректное использование лабораторных экспериментов по исследованию динамики спектров ЛИФ в процессе деградации органического вещества, предполагает проведение возбуждения спектров ЛИФ двумя длинами волн лазерного излучения и проведения соответствующих калибровок и измерения спектральной функции пропускания малогабаритного спектрометра ЛИФ.
Новизна, полученных в работе результатов состоит в следующем: 1. Впервые, проведено экспериментальное исследование динамики спектров ЛИФ в процессе гибели клеток фитопланктона и последующей деградации РОВ, воспроизведённого этими клетками. Показано, что гибель клеток сопровождается падением до нуля значения интенсивности линии флуоресценции хлорофилла «А» и возрастанием в течении двух дней параметра Q линии флуоресценции РОВ. Причём, такое возрастание наблюдается только при возбуждении второй гармоникой излучения Nd:YAG лазера (длина волны 532 нм). При возбуждении третьей гармоникой излучения Nd:YAG лазера подобного поведения параметра Q не наблюдается.
Результаты исследования динамики спектров ЛИФ позволяют ввести количественные параметры, характеризующие процесс деградации РОВ в морской воде. А именно, в течении периода, когда возникает максимум в сигнале флуоресценции РОВ, можно считать РОВ - «молодым», т.е. отнести РОВ к органике, воспроизведённой живыми клетками фитопланктона и не подвергшихся значительной степени деградации.
Впервые, проведено сравнение эффективности возбуждения линий флуоресценции хлорофилла «А» второй (длина волны 532 нм) и третьей (длина волны 355 нм) гармоникой излучения Nd:YAG лазера. Показано, что в линейном диапазоне флуоресцентного отклика хлорофилла «А» на лазерное возбуждение (в диапазоне интенсивностей от 80 кВт/см до 120 кВт/см ) интенсивность флуоресценции, возбуждаемой второй гармоникой излучения, превышает интенсивность флуоресценции при возбуждении третьей гармоникой, от 2-х до 4-х раз. Это означает, что использование «зелёного» излучения по сравнению с ультрафиолетовым излучением, наиболее выгодно не только с точки зрения выделения «молодого» РОВ, но и с точки зрения получения максимальных интенсивностей линии флуоресценции хлорофилла «А» при измерении его концентрации.
На защиту выносятся следующие положения:
Сигнал флуоресценции хлорофилла «А» при возбуждении лазерным излучением с длиной волны 532 нм превышает интенсивность флуоресценции при возбуждении излучением с длиной волны 355 нм от двух до четырёх раз, в диапазоне плотностей мощности возбуждающего лазерного излучения от 80 до 160 кВт/см .
Временная зависимость нормированной интенсивности РОВ, в процессе его деградации, зависит от длины волны, возбуждающего лазерного излучения. По мере деградации химической структуры молекул РОВ эффективность возбуждения флуоресценции РОВ уменьшается при
использовании лазерного излучения на длине волны 532нм и остаётся неизменной, при возбуждении лазерным излучением на длине волны 355нм.
3. Линейные зависимости в Q-C диаграммах рассеяния объясняются значительным увеличением сигнала флуоресценции «молодого» РОВ в процессе воспроизводства органического вещества клетками фитопланктона при возбуждении спектров ЛИФ лазерным излучением с длиной волны 532 нм.
Практическая значимость работы определяется возможностью использования полученных экспериментальных результатов в решении прикладных задач:
1. Использовании методики обработки спектров ЛИФ , разработанного программного обеспечения для измерения концентрации хлорофилла «А» на малогабаритном судовом спектрометре ЛИФ. Программное обеспечение, созданное в процессе выполнения диссертации, позволяет осуществлять автоматизированную обработку больших массивов спектров ЛИФ, практически в реальном масштабе времени, что является необходимым при обработке данных в натурных условиях, а так же при проведении статистического анализа Q-C диаграмм рассеяния. В последнем случае, для определения параметров, характеризующих темпы воспроизводства органического вещества клетками фитопланктона, необходимо проводить обработку несколько тысяч спектров ЛИФ.
2. Обнаруженные особенности динамики спектров ЛИФ, возбуждаемых второй гармоникой излучения Nd:YAG лазера, позволяют ввести количественные параметры, характеризующие процесс деградации РОВ в морской воде. В частности, наличие максимума во временной зависимости интегральной по спектру флуоресценции растворённого органического вещества, позволяет определить те временные диапазоны, в которых РОВ, воспроизведённое клетками фитопланктона в процессе реакции фотосинтеза,
можно считать ещё «молодым», т.е. не подвергшемуся значительной деградации в процессе распада.
3. Результаты исследования эффективности возбуждения флуоресценции с использованием второй и третьей гармоник излучения Nd:YAG лазера позволяют выбрать наиболее эффективные длины волн, с точки зрения измерения концентрации хлорофилла «А» и определения темпов воспроизводства органического вещества клетками фитопланктона с учётом оптического типа морских вод. Что является важным при разработке лазерных спектрометров, предназначенных для натурных исследований биооптических параметров морской воды. Апробация работы.
V региональная научная конференцияДВГУПС, г. Хабаровск, 2005.
Ill International conference «Current problems in optics of natural waters», St. Petersburg, 2005.
XIII International symposium «Atmospheric and ocean optics. Atmospheric physics», Tomsk, 2006.
XVIII International conference «Ocean optics», Montreal, 2006.
Региональная конференция ДВГУ для студентов, аспирантов и молодых учёных по физике, г. Владивосток, 2006.
XI конференция студентов, аспирантов, и молодых учёных по физике полупроводниковых, диэлектрических и магнитных материалов (ПДММ), г. Владивосток, 2007.
International conference and Young Scientists school on Computational Information technologies for Environmental Sciences (CITES), Tomsk, 2007.
IV International conference «Current problems in optics of natural waters», Nizhniy Novgorod, 2007.
VII региональная научная конференция «Физика: фундаментальные и прикладные исследования, образования», Владивосток, 2007.
Восстановление биооптических параметров морской воды из спектров лазерной индуцированной флуоресценции
Под биооптическими компонентами спектра лазерно-индуцированной флуоресценции (ЛИФ), здесь, понимаются сигналы флуоресценции, связанные с различными пигментами водорослей, бактериями, растворенным органическим веществом (РОВ) и т.д., т.е. всем тем, что имеет биологическое происхождение. В более широком смысле биооптические параметры морской воды - это все характеристики морской воды, имеющие биологическое происхождение, в той или иной степени, влияющие на цвет или светимость океана [30].
Методом ЛИФ, при использовании различных длин волн возбуждения флуоресценции, возможно определение, таких биооптических компонент как интенсивность флуоресценции фикоэретрина, фикоцианина, хлорофиллов, каратеноидов, растворенного органического вещества и многих других компонент [7, 16, 31, 32]. Для проведения количественных измерений, интенсивность флуоресценции спектров ЛИФ нормируется на интенсивность комбинационного рассеяния (КР) морской воды. [12, 33, 34]. При выборе длины возбуждения флуоресценции необходимо обращать внимание на то, чтобы линия КР воды не перекрывала измеряемые линии флуоресценции какого-либо пигмента клетки фитопланктона, или, по крайней мере, чтобы вклад совпадающего с КР воды биооптического(-их) компонента(-ов) в общий сигнал был мал (находился в пределах шумов регистрируемого сигнала).
Несмотря на то, что методом ЛИФ возможно определение большого числа биооптических компонент, в основном, этот метод используется для определения интенсивности флуоресценции хлорофилла «А» и реже интенсивности флуоресценции РОВ (ИФРОВ). При этом, зачастую, последние две величины определяются просто, как интенсивность флуоресценции морской воды на конкретных выбранных длинах волн. Особенно, данный подход распространен в погружаемых гидрологических зондах. Однако, при этом, не учитывается наложение интенсивности флуоресценции соседних биооптических компонент, которое при определенных обстоятельствах может существенно влиять на измеряемые величины. Проблема наложения спектральных компонентов решается только в случае измерения всего спектра ЛИФ, как это сделано в проточном сканирующем варианте флуориметра [35].
В данной работе исследуются спектры ЛИФ, измеренные с помощью проточного флуориметра [26], а также малогабаритным флуориметром [36], которые будут описаны в главе II. В диапазоне длин волн, где происходит регистрация спектра, наблюдаются биооптические компоненты, представленные в таблице 1.2.1. На рисунке 1.2.1 показан спектр флуоресценции морской воды, регистрируемый флуориметром, для случая высоких концентраций фитопланктона. Интенсивность спектра восстанавливается с учетом спектральной характеристики флуориметра.
Для повышения сходимости процедуры аппроксимации нами рассматривались только те биооптические компоненты, которые выделены в таблице 1.2.1 жирным цветом. Остальные компоненты нами не учитывались и включались в ошибку определения других компонент. По данным работ [34, 41] многие из исключенных компонент обычно дают слабый сигнал флуоресценции и ошибка, возникающая при их исключении, не превышает 10%.
Для расчета концентрации хлорофилла «А» из спектров ЛИФ использовалась формула, приведенная в работе [43]: С = к-аХлА1акр к-Ф (1.2.3) концентрация хлорофилла «А», к - калибровочный коэффициент, определяемый из сравнения со стандартными измерениями концентрации хлорофилла «А» (измерение коэффициентов поглощения в пробах морской воды, подготовленных соответствующим образом [44], Ф - отношение амплитуды ненасыщенной флуоресценции хлорофилла «А» к амплитуде КР воды.
В наших работах, в качестве эталонного метода определения С, с целью вычисления к, использовался экстрактный спектрофотометрический метод, основанный на измерении спектров поглощения отфильтрованных проб морской воды. Одновременно с ЛИФ измерениями определялись концентрации хлорофилла «А». Такие калибровки были выполнены в Охотском и Японском морях в 2000 - 2002 годах, а так же на акватории Залива Петра Великого в 2006 г. Для данных 2000 года значение коэффициента к составило 2.3±0.3 [45]. В 2001 году коэффициент к был равен 2.5±0.4, что согласуется, в пределах ошибки, с данными 2000 года. Соответствующие калибровочные кривые представлены на рисунке 1.2.2. В работах [7,12,34,46] также была исследована связь между концентрацией хлорофилла «А», измеренной эталонными методами и по интенсивности флуоресценции хлорофилла «А». Результаты этих работ вместе с калибровками используемого флуориметра представлены в таблице 1.2.2.
Исследование флуоресценции растворенного органического вещества и определение его природы
Активное изучение флуоресценции РОВ началось в 70-х годах прошлого столетия. В основном, возбуждение проводилось ламповыми излучателями в ультрафиолетовом и ближнем видимом диапазонах [58,59,60]. Именно при возбуждении ультрафиолетовым излучением свечение РОВ наиболее сильно. В работе [61] проводились попытки по возбуждению флуоресценции РОВ зеленым излучением (Хв03 = 546 нм) при этом в области длин волн бООнм появлялось едва заметное свечение, которое выглядело как малая добавка к длинноволновому крылу линии возбуждения. Был сделан вывод о возможности возбуждения свечения РОВ в зеленой области спектра.
В 80-х годах стали появляться работы, где для возбуждения использовались лазеры [37,54,62]. Применение Nd:YAG лазера со второй гармоникой (Хв03 = 532нм) позволило наблюдать флуоресценцию РОВ [37] при возбуждении зеленым излучением.
Большинство полученных результатов по флуоресценции РОВ можно описать следующей формулировкой: флуоресценция РОВ возбуждается ультрафиолетовым и видимым излучением, а ее спектр представляет собой ассиметричную бесструктурную полосу с полушириной 100-140 нм и максимумом, смещенным на 80-100 нм в сторону больших длин волн относительно линии возбуждения [31]. В середине 90-х годов были обнаружены максимумы флуоресценции РОВ, смещенные на 30-60 нм относительно длины волны возбуждающего излучения.
В 90-х годах начали появляться работы, где флуоресценция РОВ исследовалась, как функция двух переменных - длин волн собственного свечения и возбуждающего излучения [24,25,63]. О необходимости такого подхода говорилось и раньше [31,64], однако, развитие техники долго не позволяло провести подобные измерения. В настоящий момент в многоволновом варианте возбуждения флуоресценции, используются ламповые излучатели, которые позволяют исследовать спектры свечения РОВ при длинах волн возбуждения в диапазоне 200-600нм и регистрировать флуоресценцию в диапазоне 200-800нм.
Многоволновой метод возбуждения, одним из первых был применен в работе [24], где 3-х мерные спектры флуоресценции возбуждались 450 ваттной ксеноновой лампой. На спектрах выделяют следующие типы флуоресценции: гуминоподобная, тирозиноподобная и триптофаноподобная. Гуминоподобная флуоресценция состоит из двух пиков, один возбуждается ультрафиолетовым излучением (пик А), а другой видимым (пик С). Также было отмечено, что в пробах морской воды появляется пик М, который немного сдвинут от пика С и также ассоциируется с гуминоподобной флуоресценцией, но различие в положении пиков С и М говорит о том, что морские гуминовые вещества и гуминовые вещества, поступающие с суши -различны. Согласно работе [65] пик В ответственен за биологическую активность. В аналогичных работах других авторов приводятся практически те же положения пиков [25,52,66]. Также, во всех найденных нами работах [25,31,65], где говорится о природе флуоресценции РОВ, обсуждается флуоресценция РОВ при возбуждении УФ и синим излучением, и практически нет анализа по тому, какое РОВ флуоресцирует при возбуждении зеленым излучением. Это вызвано во многом тем, что обычно в экспериментах по измерению спектров флуоресценции с многоволновым возбуждением используют ламповые излучатели, которые имеют недостаточную интенсивность света в зеленой области спектра для возбуждения интенсивной флуоресценции РОВ [25,31,65]. В тех работах, где использовалось зеленое излучение для возбуждения флуоресценции, например, [37] не был проведен анализ того, какая часть РОВ при этом флуоресцирует.
Перед тем, как рассмотреть вопрос о природе флуоресценции РОВ при возбуждении излучением 532 нм, сначала обсудим понятие «молодого» РОВ (в англоязычной литературе - «fresh» DOM), которое приводится, например, в работах [31,52]. «Молодое» РОВ - это прижизненные выделения планктона или частицы на начальной стадии их биохимического разложения [31], т.е. это продукты фотосинтеза клеток фитопланктона, и продукты начального разложения отмерших клеток. Содержание «молодого» РОВ тем выше, чем выше концентрация фитопланктона. В высокобиопродуктивных водах доля «молодого» РОВ, в общем составе РОВ, выше по сравнению с водами малой и средней продуктивности.
Мы полагаем, что при увеличении длины волны возбуждающего излучения, увеличивается доля флуоресценции более сложных молекул. Очевидно, что наиболее сложными молекулы РОВ являются на стадии своего появления и уже, потом, в процессе трансформации и деградации их химическая структура упрощается. Т.е. можно предположить, что по мере трансформации и деградации РОВ максимум в его спектре флуоресценции смещается в более коротковолновую область. Подтверждение этому, можно найти и в других работах. Так, в работе [67] показано, что спектр свечения одноклеточных водорослей по мере естественного отмирания тускнеет и меняет свой цвет, таким образом, как если бы его спектр смещался в коротковолновую область. У производных хлорофилла, образующихся при переваривании водорослей зоопланктерами, максимум свечения приходится на 616 нм [31,99], его положение смещено примерно на 60 нм в коротковолновую область от максимума флуоресценции хлорофилла «А» (675нм). В работе [68] говориться о том, что для конденсированных ароматических углеводородов, по мере возрастания числа бензольных колец и сопряженных связей в цепи молекулы, наблюдается тенденция к длинноволновому смещению полос поглощения и люминесценции.
Таким образом, вероятно, что при возбуждении зеленым излучением больший вклад во флуоресценцию дает «молодое» РОВ. А при возбуждении ультрафиолетовым излучением флуоресцирует практически все РОВ и относительный вклад флуоресценции «молодого» РОВ в суммарную интенсивность значительно уменьшается.
Малогабаритный судовой прокачиваемый флуориметр
В работах [9,35,36] описана конструкция и результаты использования судового сканирующего лазерного флуориметра, который использовался для измерения концентрации хлорофилла «А» и разработки метода определения темпов воспроизводства «молодого» растворенного органического вещества, воспроизведённого клетками фитопланктона. Несмотря на высокую чувствительность сканирующего флуориметра (в качестве фоторегистратора спектрометра использовался фотоумножитель), основным недостатком данного флуориметра являлось то, что время измерения одного полного ЛИФ спектра составляло несколько минут. При измерении по ходу судна это приводило к тому, что пространственное разрешение при измерении концентрации хлорофилла «А» и определении параметра Q доходило до нескольких сотен метров. При решении задач, в которых осуществлялось сравнение со спутниковыми измерениями, или проведении анализа функциональных зависимостей между биооптическими параметрами Q и С в водах, где наблюдались резкие горизонтальные изменения концентрации хлорофилла «А» (например, фронтальные зоны), требуется меньшее пространственное разрешение. Усреднение по длинным трассам может t приводить к тому, что функциональные соотношения между параметрами Q и С будут искажаться, и вклад молодого РОВ в общий сигнал флуоресценции органики не будет детектироваться.
Для уменьшения времени накопления сигнала при регистрации ЛИФ спектров, был разработан малогабаритный судовой вариант спектрометра в котором использовался полихроматор и оптический усилитель яркости с регистрацией на двумерную ПЗС матрицу.
Основными достоинствами сканирующего лазерного проточного, флуориметра является сочетание высокой чувствительности (которая обеспечивается использованием в качестве регистратора слабых световых сигналов фотоэлектронного умножителя), высокого спектрального разрешения и широкого спектрального диапазона сканирования. В совокупности это все позволило проводить раздельную регистрацию линий флуоресценции основного и дополнительных пигментов клеток фитопланктона, выделить ту часть сигнала флуоресценции, которая обусловлена вкладом «молодого» РОВ в общий сигнал флуоресценции растворенной органики. Такое разделение возможно сделать только при наличии высокой чувствительности, поскольку для возбуждения сигнала флуоресценции приходится использовать длинноволновую часть спектра (в частности вторую гармонику излучения Nd:YAG лазера) и проводить регистрацию сигнала в длинноволновой области спектра, где сигналы гораздо слабее, чем при возбуждении УФ.
В настоящее время наблюдается развитие спектральной техники на основе оптических усилителей яркости и ПЗС матриц. Это позволяет осуществлять регистрацию спектральных компонент относительно слабых световых сигналов. Такие регистраторы, в сочетании с полихроматорами, обеспечивают одновременное измерение интенсивности оптических спектров в широком диапазоне частот. Использование таких многоканальных анализаторов спектра позволяет значительно сократить время измерения ЛИФ спектров, значительно уменьшить габариты и вес флуориметров. Однако, реальная чувствительность оптических усилителей яркости остается меньше чем у фотоумножителей. И наиболее эффективное их использование обеспечивается в тех приложениях, где необходимо измерение спектров флуоресценции с минимальным пространственным разрешением (например, при восстановлении пространственного распределения концентрации хлорофилла «А»). Для этих целей и была проведена разработка малогабаритного многоканального лазерного флуориметра с использованием полихроматора, электронно-оптического преобразователя (ЭОП) и матрицы приборов с зарядовой связью (ПЗС матриц).
Флуоресценция морской воды, возбужденная в оптической кювете, через фильтр ОС-12 проходит во входную щель полихроматора. Полихроматор раскладывает это излучение в спектр и строит изображение этого спектра на оптоволоконном входе усилителя яркости. Усиленное изображение спектра с выходного экрана усилителя яркости переносится объективом на ПЗС -матрицу приёмной камеры, где он запоминается в фотоячейках в виде заряда фотоэлектронов. Затем АЦП камеры преобразует заряд ячеек в цифровой формат и, полученные данные, через интерфейсную плату передаются в ЭВМ.
Компоненты флуориметра, за исключением лазера с блоком питания, блока питания ЭОП и ЭВМ с платой управления ПЗС - камерой, размещены в корпусе размерами 600X200X200 мм (см. фото на рисунках 2.2.2. и 2.2.3). Полихроматор МДП-1 предназначен для выделения участков спектра в широком диапазоне длин волн (200 - 2000 нм) и рассчитан на работу с малогабаритными приемниками излучения - ПЗС - линейками и ПЗС -матрицами. Относительное отверстие составляет 1 : 5. В полихроматоре установлена универсальная отражательная дифракционная решетка 300 штр./мм, обеспечивающая возможность регистрации исследуемой спектральной области в разных порядках спектра. Длинноволновая граница рабочего спектрального диапазона дифракционной решетки изменяется от 6020 нм в первом порядке до 602 нм в десятом порядке спектра и определяется максимальным значением рабочего угла дифракции. Рабочие спектральные диапазоны полихроматора ограничены так же пропусканием оптического кварцевого стекла, из которого изготовлен объектив.
Полихроматор позволяет проводить регистрацию исследуемой области спектра при различных значениях обратной линейной дисперсии. Например, в области 600 нм исследуемый спектр может быть зарегистрирован при обратной линейной дисперсии 42 нм/мм в первом порядке и 2 нм/мм в девятом порядке. При этом величина одновременно регистрируемой области длин волн на поле изображения 12.5 мм составит 525 нм в первом порядке спектра и 25 нм в девятом порядке.
Динамика ЛИФ спектров в процессе деградации клеток фитопланктона
Флуоресценция РОВ, в диапазоне 440-460 нм, при возбуждении излучением длиной волны 355 нм во многих работах относится к флуоресценции «гуминоподобных» веществ [24,25,93,94]. Но практически нет анализа того, какое РОВ флуоресцирует при возбуждении зеленым излучением. Это вызвано во многом тем, что, обычно, в экспериментах по измерению спектров флуоресценции с многоволновым возбуждением используют ламповые излучатели, которые имеют недостаточную интенсивность света в зеленой области спектра для возбуждения интенсивной флуоресценции РОВ [24,25,31]. Скорее всего, при увеличении длины волны возбуждающего излучения увеличивается доля флуоресценции более сложных молекул. Очевидно, что наиболее сложными молекулы РОВ являются на стадии своего появления и уже, потом, в процессе трансформации и деградации их химическая структура упрощается. Т.е. можно предположить, что по мере трансформации и деградации РОВ максимум в его спектре флуоресценции смещается в более коротковолновую область. Подтверждение этому, можно найти и в других работах. Так, в работе [67] показано, что спектр свечения одноклеточных водорослей по мере естественного отмирания тускнеет и меняет свой цвет, таким образом, как если бы его спектр смещался в коротковолновую область. У производных хлорофилла, образующихся при переваривании водорослей зоопланктерами максимум свечения приходится на 616 нм [31], его положение смещено примерно на 60 нм в коротковолновую область от максимума флуоресценции хлорофилла «А» (675нм). В работе [68] говориться о том, что для конденсированных ароматических углеводородов по мере возрастания числа бензольных колец и сопряженных связей в цепи молекулы, наблюдается тенденция к длинноволновому смещению полос поглощения и люминесценции. Таким образом, вероятно, что при возбуждении зеленым излучением больший вклад во флуоресценцию дает «молодое» РОВ, т.е. растворённая органика, воспроизведённая живыми клетками фитопланктона, которая не подверглась значительной степени деградации. Сюда же можно включить и остатки самих клеток фитопланктона, которые незначительно деградировали. А при возбуждении ультрафиолетовым излучением флуоресцирует практически всё РОВ и относительный вклад флуоресценции «молодого» РОВ в суммарную интенсивность значительно уменьшается. Понятие «молодого» РОВ или РОВ на ранней стадии деградации является довольно условным и качественным. В тех статьях, где приводится такое определение РОВ, не даются какие либо количественные параметры для этой степени деградации. Поэтому, одной из задач, которая решалась в лабораторных экспериментах, описанных ниже, являлось определение каких либо характерных зависимостей в динамике биооптических параметров спектров ЛИФ, для того, чтобы количественно охарактеризовать различные стадии деградации растворённой органики.
Для подтверждения предположения о большем вкладе «молодого» РОВ в сигнал флуоресценции при возбуждении зеленым излучением проведен лабораторный эксперимент, в котором было исследовано формирование спектров лазерной индуцированной флуоресценции морской воды в процессе гибели фотосинтезирующих клеток и деградации растворённого органического вещества.
В обоих случаях наблюдается флуоресценция хлорофилла «А». После кипячения (рис. 3.2.2 в, г) линия флуоресценции хлорофилла «А» отсутствует и возрастает интенсивность флуоресценции РОВ. Такое поведение спектров ЛИФ вызвано тем, что в процессе кипячения проб морской воды (в течении 3-х минут) происходит гибель клеток фитопланктона и разрушение молекулярных комплексов хлорофилла «А», в результате чего пик флуоресценции хлорофилла «А» на длине волны 675 нм исчезает, что и регистрируется на спектрах ЛИФ при возбуждении обеими длинами волн. Кроме этого, количество растворённой в пробах морской воды органики увеличивается за счёт распада самих клеток, что так же проявляется в возрастании параметра Q. В обоих случаях параметр Q увеличился примерно в два раза за счёт поступления «молодого» РОВ, которое возникло в результате распада клеток. Интересно отметить, что в случае «молодого» РОВ, увеличение параметра Q примерно одинаково, как для возбуждения длиной волны 355 нм, так и для возбуждения 532 нм.
По шкале ординат даны изменения исследуемых величин в процентах от максимально наблюдаемого значения. Первая точка на графиках 3.2.2 (а) и 3.2.2 (б) соответствует исходной пробе измеренной через 2 часа после забора пробы (соответствующие спектры показаны на рис. 3.2.1 а, б). Последующие точки соответствуют измерениям, выполненным в пробе после ее кипячения, измерения проводились в течение двух недель. Кроме одноразового кипячения в течение двух минут, проба воды не подвергалась далее никакой обработке.
