Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Восстановление биооптических параметров морской воды из спектров лазерной индуцированной флуоресценции (ЛИФ) 14
1.1. Метод лазерно-индуцированной флуоресценции 15
1.2. Процедура обработки спектров лазерно-индуцированной флуоресценции 19
1.3. Определение ошибок измерения биооптических компонент спектров ЛИФ 33
ГЛАВА II. Спектры флуоресценции растворенного органического вещества в морской воде 40
2.1. Определение флуоресцирующей части растворенного органического вещества (РОВ) 41
2.2. Сравнение характеристик спектров флуоресценции растворенного органического вещества с концентрационными измерениями РОВ 47
2.3. Природа флуоресценции растворенного органического вещества 52
ГЛАВА III. Измерение концентрации хлорофилла «а» в морской воде методом ЛИФ 63
3.1. Соотношение между интенсивностью флуоресценции хлорофилла «А» и концентрацией хлорофилла «А» 63
3.2. Исследование влияния суточных ритмов флуоресценции хлорофилла «А» на измерение его концентрации 69
ГЛАВА IV. Анализ соотношений биооптических компонент спектров ЛИФ морской воды 78
4.1. Использование диаграмм рассеяния биооптических компонент спектров ЛИФ для исследования циклов воспроизводства РОВ клетками фитопланктона 78
4.2. Кластеризация фитопланктонных сообществ по соотношению биооптических параметров ЛИФ спектров 88
4.3. Анализ фитопланктонных сообществ по параметрам, характеризующим процессы воспроизводства РОВ клетками фитопланктона 95
Заключение 102
Литература 103
- Процедура обработки спектров лазерно-индуцированной флуоресценции
- Сравнение характеристик спектров флуоресценции растворенного органического вещества с концентрационными измерениями РОВ
- Исследование влияния суточных ритмов флуоресценции хлорофилла «А» на измерение его концентрации
- Кластеризация фитопланктонных сообществ по соотношению биооптических параметров ЛИФ спектров
Введение к работе
Проблема мониторинга фитоплаиктонных сообществ приобретает, в настоящее время, особое значение в связи с актуальностью задач оценки биопродуктивности океана, а также явно выраженными климатическими изменениями на планете и все возрастающим антропогенным воздействием на морские экосистемы. Однако, мониторинг фитопланктоиных сообществ подразумевает измерение параметров, характеризующих отдельные клетки и работу фотосинтетической системы на молекулярном уровне, ио применительно к большим пространственно-временным масштабам [27, 39]. Для возможно более полного исследования состояния фитопланктоиных сообществ и воздействия процессов различной природы (включая антропогенные) на функционирование клеток фитопланктона необходимо определение целого набора параметров, таких как концентрации хлорофилла «А» и дополнительных пигментов, входящих в клетки, скорости электронного транспорта в реакции фотосинтеза, органического вещества, воспроизводимого в результате реакции фотосинтеза, концентрации наиболее важных элементов, входящих в состав клеток и т.д. Все это необходимо измерять оперативно и на больших морских акваториях, методы лазерной спектроскопии позволяют проводить подобные измерения [12, 19, 53]f.
В данной работе рассмотрены вопросы, связанные с применением метода лазерной индуцированной флуоресценции (ЛИФ) к исследованию воспроизводства органического вещества клетками фитопланктона. Это представляет большой интерес не только в связи с определением состояния морских экосистем, но и в связи с оценками той роли, которую играют клетки фитопланктона в глобальном цикле воспроизводства органического вещества на планете. Содержание растворенного органического углерода (РОУ) в океане соизмеримо по величине с содержанием ССЬ в атмосфере, а также составляет примерно 20% от общего органического вещества на Земле (исключая керогены и уголь) [77]. Основным источником поступления РОУ в океан является фитопланктон, по оценкам, приведенным в работе [38], он продуцирует 20 миллиардов тонн РОУ в год, в то время как поступление органического вещества с суши и первичная продукция фитобентоса дают лишь 5 процентов вновь поступающего органического вещества. При этом биомасса самого фитопланктона, выраженная в единицах органического углерода, относительно очень мала - всего лишь 80 миллионов тон. Таким образом, его ежегодная продукция превышает его биомассу в 250 раз. Это говорит о большой роли фотосинтеза в процессе воспроизводства органики на планете, и обуславливает интерес к исследованию циклов воспроизводства органического вещества именно клетками фитопланктона [43].
Подавляющее количество органического углерода в океане находится в растворенной форме (по разным оценкам 90-98%) [3, 38] и входит в состав растворенного органического вещества (РОВ). РОВ представляют собой очень сложные соединения, только 10-20% этих соединений можно представить в виде отдельных компонентов, остальные 80-90% — это сложные органические смеси, которые нельзя разложить по компонентам и представить в аналитической записи [80, 91].
Вследствие сложной структуры, измерение РОВ представляет очень не простую задачу. Химические методы являются крайне трудоемкими, и также не всегда позволяют измерить концентрацию каждого отдельного компонента, входящего в состав РОВ. Несмотря на то, что оптические методы регистрируют лишь хромофоры и флуорофоры (т.е. соединения поглощающие: свет или флуоресцирующие под его действием), тем не менее, для проведения мониторинга процессов воспроизводства органического вещества, в морской воде оптические методы являются наиболее подходящими, т.к. они позволяют проводить оперативные измерения на больших акваториях. В плане оперативности и больших масштабов, наиболее привлекательным выглядит спутниковое зондирование восходящего излучения, однако, более богатую информацию по органическим веществам, находящимся в океане, дают активные (лазерные) флуоресцентные методы.
Круг задач, решаемый с помощью методов индуцируемой флуоресценции морской воды обширен. В первую очередь это задачи, связанные с измерением основного и дополнительных пигментов фитопланктона и определением скорости электронного транспорта. Использование схем, позволяющих проводить непрерывные измерения спектров флуоресценции морской воды, дает возможность решать задачи мониторинга состояния и стадии развития фитопланктонных сообществ, исследования циклов воспроизводства РОВ клетками фитопланктона [12, 40, 101-104]. Многоволновое возбуждение спектров флуоресценции позволяет исследовать процессы деградации и трансформации РОВ, более детально изучать компоненты и источники поступления органического вещества в морскую воду [65, 95]. При этом метод ЛИФ позволяет проводить перечисленные исследования оперативно и на различных масштабах (в основном на мезо- и макромасштабах [20]).
Еще одной из задач, решаемой методом ЛИФ спектроскопии является проведение подспутниковых калибровочных измерений концентрации хлорофилла «А». Стандартные алгоритмы восстановления концентрации хлорофилла «А» из спектров восходящего излучения моря (полученные спутниковыми сканерами морской поверхности) постоянно совершенствуются, что требует проведения подспутниковых измерений и создания новых методик калибровок. Алгоритмы, используемые в настоящее время, построены на основе 3000 измерений [93], выполненных в различных частях Мирового океана, но применительно к районам со специфическими биооптическими характеристиками могут давать ошибку определения концентрации хлорофилла «А» более 100%. Метод ЛИФ, обеспечивая большую статистику измерений, позволяет не только получать региональные алгоритмы восстановления концентрации хлорофилла «А», но и проводить биооптическую классификацию вод, где для разных типов морской воды, разрабатываются разные биооптические алгоритмы [6,11,13,33,59,99,100].
Таким образом, актуальность постановки данной работы определяется необходимостью разработки новых методов мониторинга фитопланктонных сообществ и, в частности, создания оперативных методов исследования циклов воспроизводства органического вещества клетками фитопланктона, что необходимо для решения ряда фундаментальных проблем исследования окружающей среды. Кроме этого, актуальным является приложение результатов данной работы для решения пршсладных задач, например, таких как разработка региональных алгоритмов восстановления полей концентраций хлорофилла «А» по данным спутникового зондирования цвета морской поверхности.
Целью настоящей работы является исследование функциональных зависимостей биооптических компонент ЛИФ спектров, которые возникают на различных стадиях развития клеток фитопланктона, и наблюдаются в морских водах различных оптических типов. Целью работы является так же создание оперативных методов исследования процессов воспроизводства органического вещества клетками фитопланктона в океане на основе проведенных исследований соотношений биооптических компонент ЛИФ спектров.
В данной работе поставлены следующие задачи:
Провести измерение спектров ЛИФ морской воды в различные периоды развития клеток фитопланктона и в различных по биопродуктивности районах Мирового океана.
Оценить влияние эффекта световой адаптации фотосинтетического аппарата клеток фитопланктона на измерение интенсивности флуоресценции хлорофилла «А».
Провести анализ функциональных зависимостей биооптических параметров ЛИФ спектров, измеренных в различные периоды развития клеток, в различных районах Мирового океана.
Исследовать корреляционные соотношения биооптических параметров для определения той части РОВ, которая дает максимальный вклад в интенсивность спектров флуоресценции при возбуждении лазерным излучением с длиной, волны 532 нм.
Разработать основы метода мониторинга фитопланктонных сообществ по измерению параметров ЛИФ спектров, характеризующих процессы воспроизводства РОВ клетками фитопланктона.
Научная новизна полученных результатов состоит в следующем:
Впервые метод лазерной индуцированной флуоресценции применен для исследования процессов воспроизводства органического вещества фитопланктонными сообществами.
Показано, что наибольший вклад в сигнал флуоресценции РОВ, при возбуждении лазерным излучением длиной волны 532 нм, дает «молодое» РОВ.
На основе исследования функциональных соотношений биооптических компонент спектров ЛИФ разработаны основы классификации фитопланктонных сообществ по параметрам, характеризующим процесс воспроизводства РОВ клетками фитопланктона.
На защиту выносятся следующие положения:
Высокие значения коэффициентов корреляции биооптических компонент спектров ЛИФ, характеризующих флуоресцентную часть РОВ и концентрацию хлорофилла «A» (Q и С), наблюдаются в период активного развития клеток фитопланктона.
Параметры линейных регрессий биооптических компонент спектров ЛИФ (Q-C диаграмм рассеяния) описывают процесс воспроизводства органическо-го вещества клетками фитопланктона.
Эффект световой адаптации фотосинтетического аппарата клеток фитопланктона вносит ошибку в измерение интенсивности флуоресценции хлорофилла. «А», возбуждаемой лазерным излучением с длиной волны 532 нм, не превышающую 15% от её среднесуточного значения, в случае проведения предварительной темновой адаптации клеток фитопланктона. 4. Биооптический параметр Q, при возбуждении спектров ЛИФ лазерным из-лучением с длиной волны 532 нм, однозначно определяется флгооресцирую-щим РОВі воспроизведенным клетками фитопланктона при концентрациях хлорофилла «А» более 5 мкг/л.
Практическая значимость результатов, полученных в работе состоит:
Разработанная процедура автоматической обработки ЛИФ спектров повышает достоверность определения биооптических параметров морской воды и увеличивает оперативность обработки данных.
Проведена оценка диапазона значений концентраций хлорофилла «А» при которых проточный метод ЛИФ позволяет проводить количественные измерения.
Разработанная методика может быть использована для проведения коррекции спутниковых алгоритмов по восстановлению полей концентраций хлорофилла «А» и РОВ.
Предложенный метод позволяет оперативно и дистанционно проводить исследования процессов воспроизводства РОВ, что значительно снижает трудоемкость таких исследований по сравнению с традиционными методами, а так же делает возможным проводить исследования на больших акваториях.
Основные результаты, вошедшие в диссертационную работу, докладывались и обсуждались на следующих конференциях: Int. conference «Lasers, Applications and Technologies», Moscow, 2002; 3rd Workshop on Okhotsk Sea and Adjacent Areas by PICES, Vladivostok, 2003; 2nd International conference «Optics of Natural Waters», St. Petersburg, 2003; Региональная научно-техническая конференция "Наука делает мир лучше", МГУ им. адм. Г.И. Невельского, 2003; The 6th IOC/WESTPAC International Scientific Symposium «Challenges for Ma-rine Science in the Western Pacific», Hangzhou, China, 2004; Joint International Symposium "Atmospheric and Ocean Optics.", Tomsk, 2004; International conference «Photonics Asia», Beijing, China, 2004; Вторая открытая всероссийская конференция «Современные проблемы дистанционного зондирования земли из космоса», Москва, 2004г; 3rd International conference «Optics of Natural Waters», St. Petersburg, 2005; PICES XIV Annual Meeting, Vladivostok, 2005; 5th international Asia-Pacific Conference «Fundamental problems of opto- and microelectronics», Vladivostok, Russia.
Структура диссертации.
В первой главе описано восстановление биооптических параметров морской воды из спектров лазерной индуцированной флуоресценции (ЛИФ). Под биооптическими параметрами в данной работе понимаются все характеристики морской воды, имеющие биологическое происхождение, в той или иной степени, влияющие на цвет или светимость океана. Проводится описание метода лазерной индуцированной флуоресценции, используемого для измерения биооптических характеристик морской воды. Изложен принцип работы и конструкция судового лазерного флуориметра [30, 57], который использовался в натурных измерениях для выполнения задач, сформулированных в данной работе. Рассмотрен измеряемый спектр флуоресценции морской воды, приведены биооптические компоненты, наблюдающиеся в рассматриваемом спектральном диапазоне. Описана процедура разложения спектров ЛИФ морской воды на отдельные биооптические компоненты [41]. Оценены инструментальная и методическая ошибки измерения интенсивности линии флуоресценции хлорофилла «А».
Во второй главе описываются различные методы исследования флуоресценции РОВ. Рассматриваются спектры флуоресценции РОВ при возбуждении излучением с различными длинами волн, в том числе трехмерные спектры флуоресценции, где по. осям отложены длина волны возбуждающего излучения, длина волны испускаемого излучения и интенсивность флуоресценции РОВ (ИФРОВ). По литературным данным проведено описание пиков флуоресценции РОВ, наблюдаемых на трехмерных ЛИФ спектрах. Исследуется возможность проведения калибровок при измерении концентрации РОВ флуоресцентными методами, и проводится анализ природы спектров флуоресценции РОВ.
В третьей главе рассмотрен вопрос о связи между максимумом интенсивности флуоресценции хлорофилла «А» и эталонными измерениями концентрации хлорофилла «А» выполненными в 2001 году в Охотском море. Получившаяся калибровка сравнивается с ранее полученными результатами и калибровками других авторов. Наличие постоянной концентрационной зависимости флуоресценции хлорофилла «А» определяет физический смысл и область практического применения результатов измерения интенсивности флуоресценции хлорофилла «А» в натуральной морской воде. Исследован суточный ход интенсивности флуоресценции хлорофилла «А», измеренной на используемом в работе флуориметре. Проведена оценка влияния эффекта световой адаптации фотосинтетического аппарата клеток фитопланктона на измерение интенсивности флуоресценции хлорофилла «А».
В четвертой главе приведена методика, позволяющая исследовать процессы воспроизводства РОВ клетками фитопланктона. Рассмотрены соотношения между интенсивностью флуоресценции РОВ и концентрацией хлорофилла «А» для трех биопродуктивных районов Мирового океана [12, 40]. Проведена кластеризация фитопланктонных сообществ по соотношению биооптических параметров ЛИФ спектров. Выделены те участки маршрута, где параметры, характеризующие процесс воспроизводства РОВ клетками фитопланктона, были постоянными в пределах ошибки. Исследование корреляционных соотношений биооптических параметров позволило разработать новые подходы к классификации фитопланктонных сообществ по темпам воспроизводства РОВ и оценки их состояния. Данный подход при описании функционирования фитопланктонных сообществ в сочетании с методиками определения химического состава морской воды и клеток фитопланктона [10, 74, 75], соотношения пигментного состава клеток и определения скоростей электронного транспорта в реакции фотосинтеза [53], спутникового исследования структурных особенностей распределения биооптических параметров [7, 34] может позволить проводить более полное описание и более детальную классификацию фитопланктонных сообществ. С помощью разработанной методики использования функциональных зависимостей биооптичсеких компонент возможно исследовать влияние процессов различной природы (включая антропогенные) на состояния фитопланктонных сообществ [1, 86].
В заключении диссертации представлены основные результаты работы.
Список используемых в работе сокращений:
ИФРОВ - интенсивность флуоресценции растворенного органического вещества ИФРОВуф - ИФРОВ при возбуждении ультрафиолетовым излучением ИФРОВ532 _ ИФРОВ при возбуждении излучением с длиной волны 532нм. ИФХ - интенсивность флуоресценции хлорофилла «А»
КР — комбинационное рассеяние
ЛИФ - лазерно индуцированная флуоресценция
РОВ - растворенное органическое вещество
Используемые в работе переменные:
С - концентрация хлорофилла «А» Q - относительная концентрация ИФРОВ532 R - коэффициент корреляции между С и Q Q0 - фоновое значение Q v - относительное удельное воспроизводство РОВ / - интенсивность флуоресценции а - амплитуда флуоресценции
Ф - отношение амплитуды флуоресценции хлорофилла «А» к амплитуде флуоресценции КР воды X - длина волны S - соленость Т - температура С - концентрация хлорофилла «А», усредненная по выделенному кластеру Q - относительная концентрация ИФРОВ532, усредненная по выделенному кластеру
Процедура обработки спектров лазерно-индуцированной флуоресценции
Под биооптическими компонентами спектра лазерно-индуцированной флуоресценции (ЛИФ) здесь понимаются сигналы флуоресценции, связанные с различными пигментами водорослей, бактериями, растворенным органическим веществом (РОВ) и т.д., т.е. всем тем, что имеет биологическое происхождение. В более широком смысле биооптические компоненты морской воды - это оптические характеристики морской воды, обусловленные всеми биотическими компонентами и. химическими соединениями, которые имеют органическое происхождение. Биооптические компоненты морской воды могут быть определены как активными (флуоресцентными), так и пассивными оптическими методами. Другими словами биооптические компоненты - это все характеристики морской воды, имеющие биологическое происхождение, в той или иной степени, влияющие на цвет или светимость океана.
В данной главе проводится описание метода лазерной индуцированной флуоресценции, используемого для измерения биооптических характеристик морской воды. Изложен принцип работы и конструкция судового лазерного флуориметра, который использовался в натурных измерениях для выполнения задач, сформулированных в данной работе. Описана процедура разложения спектров ЛИФ морской воды на: отдельные биооптические компоненты. Оценены инструментальная и методическая ошибки измерения интенсивности линии флуоресценции хлорофилла «А».
Методом ЛИФ, при использовании различных длин волн возбуждения флуоресценции, возможно определение таких биооптических компонент как интенсивность флуоресценции фикоэретрина, фикоцианина, хлорофиллов, каратеноидов, растворенного органического вещества и многих других компонент [26, 27, 53, 109]. Для проведения количественных измерений, интенсивность флуоресценции спектров ЛИФ нормируется на интенсивность комбинационного рассеяния (КР) морской воды. [19, 28, 45]. При выборе длины возбуждения флуоресценции необходимо обращать внимание на то, чтобы линия КР воды не перекрывала измеряемые линии флуоресценции какого-либо пигмента клетки фитопланктона, или, по крайней мере, чтобы вклад совпадающего с КР воды био оптического (-их) компонента(-ов) в общий сигнал был мал (находился в пределах шума интенсивности спектра).
Несмотря на то, что методом ЛИФ возможно определение большого числа биооптических компонент, в основном, этот метод используется для определения интенсивности флуоресценции хлорофилла «А» и реже интенсивности флуоресценции РОВ (ИФРОВ). При этом, зачастую, последние две величины определяются просто как интенсивность флуоресценции морской воды на конкретных выбранных длинах волн. Особенно данный подход распространен в погружаемых гидрологических зондах. Однако, при этом не учитывается влияние интенсивности флуоресценции соседних биооптических компонент, которое при определенных обстоятельствах может существенно влиять на измеряемые величины.
В данной работе исследуются спектры ЛИФ, измеренные с помощью проточного флуориметра (рис. 1.1.1.) [9, 30, 57], который способен непрерывно работать по ходу движения судна. С помощью насоса (2) вода закачивается с глубины 4м. Далее, вода прокачивается через кювету (9), где установлены датчики измерения электропроводности (8) и температуры (10) морской воды. Через время порядка одной минуты забортная вода (по пластиковому, затемненному трубопроводу) доходит от места забора до оптической кюветы (3), где происходит возбуждение флуоресценции второй гармоникой Nd:YAG лазера (4) (532нм, ЗОмДж). Время, проведенное фитопланктоном в одинаковых световых и гидрофизических условиях, позволяет, к моменту измерения, фотосистемам фитопланктона прийти в одинаковое состояние. Т.е. таким образом осуществляется эффект световой адаптации клеток к темновым условиям измерения. Далее рассеянный свет под углом 90 попадает на сканирующий монохроматор (5) (диапазон сканирования от 540 до 746.57нм с шагом 2.27нм), затем свет определенной длины волны проходит через фотоэлектрический усилитель ФЭУ-79 (6) и попадает в блок управления (7). Данные с блока управления попадают на компьютер (11), где происходит соответствующая обработка.
Время сканирования монохроматора всего спектрального диапазона составляет около 2-х минут, таким образом, при скорости судна 8 узлов, пространственное разрешение ЛИФ измерений на данной установке составляет 500м, за сутки непрерывных измерений возможно получить более 600 ЛИФ спектров.
На рис. 1.1.2. показан пример спектра флуоресценции морской воды, регистрируемый флуориметром. На данном спектре наблюдаются комбинационное рассеяние морской воды (широкая линия с центром на длине волны 648 нм), флуоресценция хлорофилла «А» (центр линии - 675нм) и широкополосная флуоресценция РОВ (подложка спектра). В общем случае, в диапазоне длин волн, где происходит регистрация спектра, наблюдаются биооптические компоненты, представленные в таблице 1.1.1.
Сравнение характеристик спектров флуоресценции растворенного органического вещества с концентрационными измерениями РОВ
Активное изучение флуоресценции РОВ началось в 70-х годах прошлого столетия. В основном, возбуждение проводилось ламповыми излучателями в ультрафиолетовом и ближнем видимом диапазонах [напр. 21, 29, 106]. Именно при возбуждении ультрафиолетовым излучением свечение РОВ наиболее сильно. В работе [22] проводились попытки по возбуждению флуоресценции РОВ зеленым излучением (Хаоз = 546нм) при этом в области длин волн бООнм появлялось едва заметное свечение, которое выглядело как малая добавка к длинноволновому крылу линии возбуждения. Был сделан вывод о возможности возбуждения свечения РОВ в зеленой области спектра.
В 80-х годах стали появляться работы, где для возбуждения использовались лазеры [15, 46, 79]. Применение Nd:YAG лазера со второй гармоникой (Лв03 = 532нм) позволило наблюдать флуоресценцию РОВ [79] при возбуждении зеленым излучением.
Несмотря на различия техники и методики измерений, результаты определения спектров свечения РОВ неплохо-согласуются между собой и в конце 80-х годов [26] обобщил результаты разных авторов следующей формулировкой. Флуоресценция РОВ возбуждается ультрафиолетовым и видимым излучением, а ее спектр представляет собой ассиметричиую бесструктурную полосу с полушириной 100-140 нм и максимумом, смещенным на 80-100 нм в сторону больших длин волн относительно линии возбуждения. Однако, стоит отметить, что уже в середине 90-х годов были обнаружены максимумы флуоресценции РОВ, смещенные на 30-60 нм относительно длины волны возбуждающего излучения.
В 90-х годах начали появляться работы, где флуоресценция РОВ исследовалась как функция двух переменных - длин воли собственного свечения и возбуждающего излучения [51, 65, 95]. О необходимости такого подхода говорилось и раньше [26, 56], однако развитие техники долго не позволяло провести подобные измерения. В настоящий момент в многоволновом варианте метода ЛИФ для возбуждения используются ламповые излучатели, которые позволяют исследовать спектры свечения РОВ при длинах волн возбуждения в диапазоне 200-600нм и регистрировать флуоресценцию в диапазоне 200-800нм. Однако, у разработанных на данный момент установок существуют и недостатки, во-первых, использование ламповых излучателей не позволяет эффективно возбуждать флуоресценцию РОВ зеленым излучением, а во-вторых, встречающиеся нам в литературе установки не разработаны в проточном варианте, что не позволяет проводить измерения по ходу судна. Поэтому наши результаты, полученные на проточном флуориметре с возбуждением излучением длиной волны 532нм, представляют особый интерес. Во-первых, мы исследуем пространственное распределение ИФРОВ с высоким разрешением (до 500м), что позволяет получить большую статистику измерений, отслеживать резкие градиенты и изучать малые масштабы распределения ИФРОВ. Во-вторых, при возбуждении зеленым излучением, по всей видимости, флуоресцирует РОВ, который недавно произведен фитопланктонным сообществом, что позволяет исследовать процессы воспроизводства РОВ клетками фитопланктона.
Одной из первых многоволновой метод ЛИФ стала применять американская группа под руководством Кобл. 3-х мерные ЛИФ спектры возбуждались 450 ваттной ксеноновой лампой (рис. 2.1.1) [65]. Кобл на спектрах выделяет следующие типы флуоресценции: гуминоподобная, тирозиноподобная и триптофаноподобная, Гуминоподобная флуоресценция состоит из двух пиков, один возбуждается ультрафиолетовым излучением (пик А), а другой видимым (пик С). Также было отмечено, что в пробах морской воды появляется пик М, который немного сдвинут от пика С и также ассоциируется с гуминоподобной флуоресценцией, но различие в положении пиков С и М говорит о том, что морские гуминовые вещества и гуминовые вещества, поступающие с суши - различны. Пик Р на данном рисунке соответствует флуоресценции хлорофилла «А». Согласно работе [66] пики Р и В ответственны за биологическую активность. Пик N был замечен во время цвета триходесмиума, и Кобл предполагает, что он связан с продукцией нового хромофорного РОВ в морской среде.
Кобл, в основном, использовала многоволновой метод ЛИФ спектроскопии для определения источников РОВ и не проводила экспериментов по деградации и трансформации органического вещества. Такие эксперименты провела французская группа под руководством Парланти [95]. Спектры, измеряемые в его работах, показаны нарис. 2.к 1.6.
Также Парланти ввел другие обозначения пиков, гуминоподобный пик обозначается а и а, в зависимости от длины возбуждения. Морской гуминоподобный пик обозначается (3, тирозиноподобный и триптофаноподобные пики обознаются у и 5, соответственно. Положение и обозначения пиков флуоресценции на трехмерных ЛИФ спектрах представлено в таблице 2.1.1. В другой литературе обычно используются обозначения Кобл, поэтому они и будут в дальнейшем использоваться.
Исследование влияния суточных ритмов флуоресценции хлорофилла «А» на измерение его концентрации
Для понимания природы флуоресцирующего РОВ важно рассмотреть те ситуации, в которых наблюдается отсутствие связи между флуоресценцией РОВ и С0Рг (таблица 2.3.1.). Независимость свечения РОВ от Сорг означает, что та часть РОВ, которая ответственна за флуоресценцию, составляет малую долю РОВ, присутствующих в морской воде. В видимой и УФ области за флуоресценцию органических молекул отвечают в основном группы атомов с двойными сопряженными связями [32], которые и выступают как хромофоры и флуорофоры. У веществ с преобладанием одинарных межатомных связей в молекулах полосы поглощения лежат в вакуумной УФ-области спектра. Указанный парадокс можно объяснить тем, что большая часть углерода РОВ входит в молекулы с одинарными связями. Существенно также, что хромофорные группы отличаются повышенной стойкостью и могут сохраняться при качественном преобразовании органического вещества, переходя от одних его фракций к другим. Этим можно объяснить факт корреляции ИФРОВ с белками в верхнем слое и с липи дами - в глубинном в соответствии с общей направленностью процесса трансформации РОВ в сторону увеличения доли его более стойких фракций [26].
Рассмотрим теперь различия вертикального хода Сорг и ИФРОВ в мало- и средне- продуктивных водах. Но сначала введем понятие «молодого» РОВ: «молодое» РОВ - это прижизненные выделения планктона или частицы на начальной стадии их биохимического разложения. Содержание «молодого» РОВ тем выше, чем выше концентрация фитопланктона, и таким образом в высокобиопродуктивных водах доля «молодого» РОВ в общем составе РОВ выше по сравнению с водами малой и средней продуктивности. И именно в этих водах: вертикальный ход Сорг и ИФРОВ совпадает (в обоих случаях происходит убывание с глубиной). В мало- и средне- продуктивных водах ИФРОВ, в отличие от Сорг с глубиной возрастает. Карабашев объясняет возрастание ИФРОВ тем, что по мере трансформации РОВ с глубиной доля флуоресцирующих фрагментов (как более стойких к разложению) в РОВ возрастает, что, возможно, приводит к разгоранию флуоресценции при убывании Сорг с глубиной. Подобные выводы сделаны в работе [95], где флуоресценция РОВ исследовалась в Апреле и Июле. Меньшие значения флуоресценции, наблюдались во всех апрельских морских водах, что объясняется большим производством внеклеточных органических материалов выделяемых фитопланктоном или водорослями, повышающими количество растворенного органического углерода. В основном этими материалами являются полисахариды, органические кислоты, аминокислоты и карбогидраты. Эти выделения могут быть использованы или быстро деградированы [73], так что в Июле величина растворенного органического углерода ниже, а ИФРОВ выше, т.е. большая часть растворенного органического углерода присутствует во флуоресцирующем РОВ.
Стоит иметь в виду, что данные рассуждения применены к РОВ, флуоресцирующему при возбуждении ультрафиолетовым возбуждением (ИФРОВуф). Еще одним объяснением возрастания ИФРОВуф с глубиной может быть распад флуоресцирующих РОВ в подповерхностном слое под действием коротковолновой солнечной радиации. Но по данным работ [21, 26, 50] данный эффект на вертикальное распределение ИФРОВ скорее всего не влияет.
Измерение трехмерных спектров ЛИФ позволило более детально исследовать флуоресценцию РОВ. Пик М {Хвоз1Х11СП — 315/400) определяется различными авторами как морской гуминоподобный пик, т.к. его флуоресценция возрастает для морских вод, и максимум высвечивания сдвигается в синюю сторону относительно гуминоподобного пика С (340/450). Синий сдвиг увеличивается вместе с соленостью и дистанцией от берега. [68, 94]. Пики В (270/325) и Т (280/350) могут быть отнесены к протеиногенному материалу, показывающему недавнюю биологическую активность [69, 90]. Пик Т наблюдается в виде плеча пика В.
Для более детального изучения природы пиков флуоресценции РОВ в работе [95] был проведен эксперимент по деградации зеленой макро-водоросли в чистой воде и в морской воде (рис. 2.3.1.). На первой стадии деградации водоросли наблюдался протеиноподобный пик В, затем пик М Последний исчезал при этом в более синей области проявлялось плечо пика С. Важно отметить, что появление пика С следует за исчезновением пика М. Интенсивность пика В непрерывно понижались, что может говорить о том, что его компоненты могут использоваться для производства флуорофоров, дающих другие пики. Тем не менее, возрастание интенсивности пика М намного сильнее, чем падение интенсивности пика В. Парланти дает два возможных объяснения такого поведения. Первое заключается в том, что флуорофоры пика В могут продолжать производиться одновременно со своей трансформацией. И вторая гипотеза состоит в том, что только флуорофоры пика В являются протеино-подобными, а флуоресценция пика М имеет другую природу, например флуоресценция бактерий. Но в любом случае даже если пики В и М имеют различную природу, то на стадии трансформации поведение флуоресценции этих пиков связано.
Кластеризация фитопланктонных сообществ по соотношению биооптических параметров ЛИФ спектров
Непрерывные измерения методом лазерной индуцированной флуоресценцией дают возможность исследовать суточные ритмы интенсивности флуоресценции хлорофилла «А». Биотическими факторами суточного ритма флуоресценции хлорофилла «А» являются, во-первых, световая адаптация фотосинтетического аппарата клеток фитопланктона, когда фитопланктон, изменяя содержание и состав фотосинтетических пигментов, морфологию и устройство хлоропластов может приспосабливаться к колебаниям солнечной радиации [96]. Во вторых, суточный ход содержания хлорофилла в клетках водорослей и, в третьих, «выедание» водорослей зоопланктоном [23]. Абиотические факторы -длиннопериодные внутренние волны, меандрирование течений [26], суточное опускание термоклина с понижением температуры и др., т.е. чисто гидрофизические факторы.
Необходимо отметить, что световая адаптация фитопланктона может влиять на калибровки интенсивности хлорофилла «А» и на определение удельного воспроизводства РОВ клетками фитопланктона. Это вызвано тем, что световая адаптация сопровождается изменениями способности фитопланктона поглощать лучистую энергию и затрагивает механизм внутри-клеточного переноса поглощенной энергии, следовательно, стоит ожидать, что и флуоресценция пигментов в море при стационарном возбуждении от искусственного источника будет ритмично меняться вслед за солнечной радиацией [26].
По данным работы [82] в тех случая, когда облученность поверхности моря составляет не менее 25% от солнечной постоянной, происходит подавление флуоресценции солнечным светом. Kiefer показал, что уменьшение интенсивности флуоресценции под действием яркого солнечного излучения сопровождается сперва изменением формы хлоропластов от неправильной к почти сферической, а затем их слипанием в более крупные комки. Оба процесса ведут к увеличению эффективной толщины хлоропластов или к «самозатемнению» пигментов, из-за чего при неизменном содержании их в клетке уменьшается способность пигментной системы поглощать свет и, следовательно, флуоресцировать. Изменение формы хлоропластов завершается спустя 1-2 мин, а их укрупнение занимает 30 - 60 мин после начала облучения культуры диатомовых. Оба процесса обратимы и одинаково влияют на суточный ход флуоресценции и фотосинтеза. Эти выводы были подтверждены в работе [87], где установлено, что изменения удельной флуоресценции хлорофилла «А» под действием света присущи многим видам фитопланктона.
В работе [24] исследованы характеристики суточного ритма флуоресценции хлорофилла «А», было установлено, что форма суточного хода интенсивности хлорофилла «А» близка к гармонической. В указанной работе измерения были проведены с периодичностью 1.5-2 часа. Такой подход хорошо применим в акваториях тропической зоны океана, где течения постоянны и во время наблюдений судно остается в пределах акватории с неизменной стратификацией вод. В районах с нестационарными течениями на биотические факторы суточного ритма флуоресценции хлорофилла «А» накладываются колебания иной природы, связанные, в основном с перемешиванием по-разному стратифицированных вод [26]. В этих случаях необходимо применять методы непрерывного мониторинга флуоресценции фитопланктона, которые позволяют проводить круглосуточные измерения (по этой причине спутниковые методы для исследования суточных ритмов биооптических параметров не подходят) -таким методом, несомненно, является метод ЛИФ.
Чтобы определить на сколько влияет эффект световой адаптации на используемые ЛИФ данные, были исследованы ритмы временного хода интенсивности флуоресценции хлорофилла «А», РОВ и температуры. Параллельно исследовался ход интенсивности падающего солнечного света, рассчитанного теоретически по известным координатам и времени измерения. Анализ хода температуры и падающего солнечного света был сделан с той целью, чтобы определить временной масштаб, соответствующий суточному ходу, в связи с тем, что суточный период не обязательно соответствовал 24 часам. Это вызвано тем, что судно постоянно находилось в движении, и световые сутки могли удлиняться или укорачиваться в зависимости от направления движения и смены типов вод.
В наших данных есть 19 непрерывных рядов ЛИФ спектров, выполненных за время более 48 часов. На рис.3.2,1 .а-г приведен пример непрерывных измерений исследуемых параметров для района Атлантического океана вдоль островов Ирландия и Великобритания. С помощью сглаживания сплайнами (в пакете Matlab) фильтровались колебания с низкими (период колебаний более 35 часов) и высокими частотами (период колебаний менее 10 часов). Соответствующие сглаживающие коэффициенты подбирались из анализа сгенерированного ряда, который состоял из синусов с заданными периодами колебаний. Фильтрованные ряды данных показаны на рис.3.2.1.д-з. Резкий скачок на ходе интенсивности солнечной радиации связан с переходом из одного часового пояса в другой.
