Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Общая характеристика мелатонина 11
1.2. Влияние мелатонина на канцерогенез 13
1.3. Механизмы онкопротекторного действия мелатонина 30
ГЛАВА 2 Материал и методы исследования 41
2.1. Животные 41
2.2. Схема экспериментов 41
2.3. Патоморфологические методы исследования 43
2.4. Биохимические методы исследования 45
2.5. Статистические методы исследования 46
ГЛАВА 3. Влияние мелатонина на канцерогенез легких, индуцируемый уретаном у мышей 48
3.1. Влияние мелатонина на частоту, множественность и размеры опухолей легких 48
3.2. Влияние мелатонина на патоморфологию опухолей легких 54
3.3. Влияние мелатонина на показатели перекисного окисления липидов в сыворотке крови и ткани легких 61
ГЛАВА 4. Влияние мелатонина на канцерогенез мягких тканей, индуцируемый бенз(а)пиреном у мышей 66
4.1. Влияние мелатонина на частоту, множественность и размеры опухолей мягких тканей 66
4.2. Влияние мелатонина на латентный период развития опухолей, продолжительность жизни и выживаемость опухоленосителей 70
4.3. Влияние мелатонина на патоморфологию опухолей мягких тканей 75
4.4. Влияние мелатонина на показатели перекисного окисления липидов в сыворотке крови и опухолевой ткани 79
ГЛАВА 5. Влияние мелатонина на канцерогенез кожи, индуцируемый бенз(а)пиреном у мышей 82
5.1. Влияние мелатонина на частоту, множественность и размеры опухолей кожи 82
5.2. Влияние мелатонина на латентный период развития опухолей, продолжительность жизни и выживаемость опухоленосителей 87
5.3. Влияние мелатонина на патоморфологию опухолей кожи 88
5.4. Влияние мелатонина на показатели перекисного окисления
липидов в сыворотке крови и опухолевой ткани 95
ГЛАВА 6. Обсуждение результатов 99
Выводы 112
Практические рекомендации 113
Список литературы 114
- Общая характеристика мелатонина
- Патоморфологические методы исследования
- Влияние мелатонина на частоту, множественность и размеры опухолей легких
- Влияние мелатонина на латентный период развития опухолей, продолжительность жизни и выживаемость опухоленосителей
Введение к работе
Актуальность исследования. В настоящее время заболеваемость злокачественными новообразованиями во всём мире неуклонно растет (D.M. Parkin et al., 2001). Именно поэтому поиск препаратов, препятствующих развитию рака, является одной из основных задач противораковой борьбы.
В последние годы большое внимание уделяется изучению биологических эффектов мелатонина - гормона, синтезируемого в эпифизе (шишковидной железе) животных, преимущественно в ночные часы (В. Claustrat et al., 2005). Мелатонин обладает широким спектром физиологических влияний на эндокринную и репродуктивную функцию (В.Н. Анисимов, 2003; Ф.И. Комаров и соавт., 2004; В. Claustrat et al., 2005), поведение (Э.Б. Арушанян, 2005) и экспрессию генов (СВ. Анисимов и соавт., 2002; S.V. Anisimov, N. Popovic, 2004).
Многочисленные экспериментальные исследования позволили установить, что наиболее важными физиологическими эффектами мелатонина являются: контроль циркадных и сезонных ритмов, стимуляция многих метаболических процессов, ингибирующее действие на пигментный метаболизм, антигонадотропное действие, седативное и галлюциногенное действие на центральную нервную систему, подавление клеточной пролиферации и противоопухолевое действие в условиях экспериментального опухолевого роста. Кроме того, мелатонин является одним из сильнейших эндогенных антиок-сидантов (Э.Б. Арушанян, 2004; Л.М. Берштейн, 2004; Ф.И. Комаров и соавт., 2004; М.А. Пальцев, И.М. Кветной, 2006; Т.В. Кветная, И.В. Князькин, 2003; С. Bartsch et al, 2001; R.J. Reiter et al., 2002).
Несмотря на то, что противоопухолевая активность мелатонина известна довольно давно, в течение длительного периода времени действие мелатонина изучалось главным образом in vitro на культурах опухолевых клеток различного гистогенеза (S. Cos, E.J. Sanchez-Barcelo, 2000). В опытах, выполненных in vitro, показано, что эффект мелатонина зависит от его дозы (С. Bartsch etal., 2001).
В опытах in vivo было установлено, что введение экзогенного мела-тонина тормозит развитие спонтанных опухолей и канцерогенез молочной железы, индуцируемый введением 7,12-диметилбенз(а)антрацена (ДМБА) или N-нитрозометилмочевины (НММ) у самок крыс (V.N. Anisimov, 2003а; С. Aubert et al., 1980; D.E. Blask, 1993; S.A. Musatov et al., 1999). Мелатонин также тормозит развитие опухолей шейки матки и влагалища, индуцируемых интравагинальными аппликациями ДМБА (V.N. Anisimov et al., 2000) и папиллом кожи, индуцированных накожными аппликациями бенз(а)пирена (БП) и кротонового масла у мышей (А.С. Kumar, U.N. Das, 2000). Мелатонин оказывает подавляющее влияние на канцерогенез толстого кишечника, индуцируемый 1,2-диметилгидразином (ДМГ) (V.N. Anisimov et al., 1997; V.N. Anisimov, 2001a) и гепатоканцерогенез, индуцируемый введением диэтил-нитрозамина (ДЭНА) (К.В. Dakshayani et al., 2005) или ДЭНА с фенобарбиталом у крыс (К.М. Rahman et al., 2003). В большинстве указанных работ in vivo мелатонин применялся в одной дозе.
Анализ данных литературы свидетельствует о том, что результаты большинства исследований являются не вполне убедительными с точки зрения правил и требований, предъявляемых к экспериментам по изучению влияния различных химических соединений на процессы канцерогенеза. В некоторых экспериментах мелатонин вводился сравнительно малому числу животных (10-20 животных в группе); в других - введение препарата начинали, когда все животные были старыми; эксперимент заканчивали, когда животные достигали 50 % летальности или в другое произвольное время; аутопсия и корректное патоморфологическое исследование не всегда проводилось (V.N. Anisimov, 2006). В то же время, в литературе имеются сведения о стимулирующем влиянии мелатонина на некоторые опухоли в эксперименте (V.N. Anisimov et al., 2001; R.D. Lipman et al., 1998; W. Pierpaoli et al., 1991; В.И. Романенко, 1983, 1985).
Следовательно, для более полного понимания действия мелатонина на канцерогенез, для выявления закономерностей его онкостатического дей-
7 ствия необходимы исследования на большем количестве моделей с использованием канцерогенов различного механизма действия и разной органной специфичности.
Таким образом, изучение механизмов антиканцерогенного действия мелатонина на моделях индуцированного канцерогенеза, а также исследование дозовой зависимости его эффектов является актуальным направлением экспериментальной онкологии.
Цель исследования - изучить влияние мелатонина при введении в разных дозах на развитие новообразований и перекисное окисление липидов на моделях химического канцерогенеза легких, кожи и мягких тканей у мышей.
В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:
Изучить влияние разных доз мелатонина на частоту, множественность и размеры опухолей легких, индуцируемых уретаном у мышей;
Изучить влияние разных доз мелатонина на частоту, множественность и размеры опухолей мягких тканей на модели опухолей подкожной клетчатки, индуцируемых бенз(а)пиреном (БП) у мышей, а также латентный период опухолей, продолжительность жизни животных и выживаемость опу-холеносителей;
Изучить влияние разных доз мелатонина на частоту, множественность и размеры опухолей кожи, индуцируемых БП у мышей, а также латентный период опухолей, продолжительность жизни животных и выживаемость опухоленосителей;
Изучить влияние мелатонина на динамику гистологических изменений и пролиферативную активность в изучаемых опухолях;
Изучить динамику некоторых показателей перекисного окисления липидов в сыворотке крови и опухолевой ткани у мышей в условиях индуцированного канцерогенеза и при коррекции мелатонином в разных дозах;
Проанализировать дозовую зависимость влияния мелатонина на
8 изучаемые морфологические и биохимические показатели;
Научная новизна работы. В работе впервые исследовано влияние мелатонина на канцерогенез мягких тканей in vivo, продемонстрировано его подавляющее действие на развитие опухолей подкожной клетчатки и их метастатическую активность. Также в работе впервые показано, что мелатонин достоверно ингибирует канцерогенез легких. Продемонстрировано антиканцерогенное и антиметастатическое действие мелатонина в отношении опухолей кожи. На всех изучаемых моделях опухолей установлено антипролифе-ративное действие мелатонина.
В работе впервые изучена и проанализирована дозовая зависимость антиканцерогенного действия мелатонина в отношении изучаемых индуцированных опухолей in vivo. Показано, что введение мелатонина как в малых (2 мг/л), так и в больших (20 мг/л) дозах оказывает онкопротекторный эффект, наиболее выраженный при введении меньшей дозы.
В работе проанализировано влияние мелатонина на процессы пере-кисного окисления липидов (ПОЛ) в условиях индуцированного канцерогенеза и впервые показано, что антиоксидантный эффект меньшей дозы мелатонина (2 мг/л) более выражен, чем эффект большей (20 мг/л) дозы.
Практическая ценность работы состоит в том, что полученные результаты могут служить экспериментальным обоснованием для дальнейшего изучения онкопротекторного потенциала мелатонина, разработки научно-обоснованных рекомендаций по применению мелатонина с целью профилактики злокачественных новообразований.
Результаты исследования внедрены в научно-исследовательскую работу и учебный процесс кафедры патологии и кафедры онкологии ГОУВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева», отдела канцерогенеза и онкогеронтологии НИИ онкологии проф. Н.Н. Петрова.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Введение в ночные часы мелатонина, не оказывая влияния на общую частоту опухолей легких, индуцируемых уретаном у мышей, значитель-
9 но уменьшает их множественность, размеры, пролиферативную активность,
повышает степень дифференцировки опухолевой ткани.
Мелатонин значительно уменьшает общую частоту развития сарком подкожной клетчатки, индуцируемых БП у мышей, а также их пролиферативную активность и способность к метастазированию; увеличивает латентный период развития опухолей, продолжительность жизни животных и выживаемость опухоленосителей.
Мелатонин значительно уменьшает общую частоту развития опухолей кожи, индуцируемых БП у мышей, снижая количество злокачественных опухолей, их пролиферативную активность и метастатический потенциал; увеличивает латентный период развития опухолей, продолжительность жизни животных и выживаемость опухоленосителей.
Введение изучаемых канцерогенов (уретан, БП) животным сопровождается активацией процессов перекисного окисления липидов, как в сыворотке крови, так и в ткани опухолей; введение мелатонина уменьшает, а в ряде случаев полностью нивелирует эти изменения.
Эффект мелатонина на канцерогенез и процессы перекисного окисления липидов зависит от дозы препарата с более выраженным эффектом малой дозы (2 мг/л) по сравнению с большой дозой (20 мг/л).
Апробация работы. Результаты работы были доложены и обсуждены на VII Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2006); 5-ой, 6-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2006, 2007); XIII, XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006, 2007); Российской научной конференции с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакториалыюй патологи» (Курск, 2006); Научно-практической конференции молодых ученых и специалистов "Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины - 2006" (Санкт-Петербург, 2006); XI научной конференции молодых ученых, аспирантов и
10 студентов Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарева
(Саранск, 2006); XXXIV Огаревских чтениях (научной конференции Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарева) (Саранск, 2006); Европейской конференции по старению (Инсбрук, 2006); Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения» (Санкт-Петербург, 2007); IV научно-практической конференции «Общество, государство и медицина для пожилых» (Москва, 2007); 16-й Международной конференции «СПИД, рак и общественное здоровье» (Санкт-Петербург, 2007); VI Европейском конгрессе Международной ассоциации геронтологии и гериатрии (Санкт-Петербург, 2007).
По теме диссертации опубликовано 16 работ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 137 страницах, документирована 10 таблицами и иллюстрирована 78 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материала и методов исследования (глава 2), изложения собственных результатов (главы 3, 4 и 5), обсуждения полученных результатов (глава 6), выводов и библиографического указателя, включающего 225 источников, в том числе 30 отечественных и 195 иностранных.
Работа выполнялась в соответствии с научной тематикой кафедры патологии ГОУВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева» «Изучение антиканцерогенного действия антиоксидантов. Использование антиоксидантов с целью лечения онкологических заболеваний и профилактики побочных эффектов химиотерапии злокачественных опухолей». Номер государственной регистрации 01200004102.
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов Президента Российской Федерации НШ-2293.2003.4 и 5054.2006.4.
Общая характеристика мелатонина
Мелатонин синтезируется в клетках пинеальной железы - пинеалоци-тах. Биосинтез мелатонина представляет собой многоэтапный процесс. В пи-неалоцитах из триптофана в результате ряда ферментативных реакций образуется 5-гидрокситриптамин (серотонин). На следующем этапе серотонин N-ацетилируется при помощи N-ацетилтрансферазы с образованием N-ацетилсеротонина (Ы-ацетил-5-гидрокситраптамина). N-ацетилсеротонин подвергается О-метилированию с образованием мелатонина. Этот этап катализирует цитозольный фермент гидроксииндол-0-метилтрансфераза (Ф.И. Комаров и соавт., 2004; Vijayalaxmi et al., 2002).
Синтезированный мелатонин не запасается в секреторных гранулах, а быстро высвобождается в кровоток и в другие жидкости организма: слюну, овариальную фолликулярную жидкость, сперму, амниотическую жидкость, ликвор. Концентрации мелатонина в желчи и в ликворе на несколько порядков превышают его содержание в крови. Большая часть мелатонина (от 50 % до 75 %) в кровотоке обратимо связывается с белками плазмы, особенно с а\-кислым гликопротеидом и с альбумином (Vijayalaxmi et al., 2002). Катаболизм мелатонина протекает преимущественно в печени. Около 90 % мелатонина метаболизируется после однократного пассажа через печень. Часть мелатонина, извлеченная из системного кровотока печенью, экс-кретируется в желчь (Vijayalaxmi et al., 2002).
Микросомальные энзимы в гепатоцитах метаболизируют мелатонин в 6-гидроксимелатонин. Данное соединение впоследствии конъюгируется с сульфатами (на 70 %) с образованием 6-сульфатоксимелатонина (6-СОМТ) или с глюкоронидами (на 6 %) и экскретируется с мочой. Незначительное количество неметаболизироваиного мелатонина (менее 5 % его количества в крови) также экскретируется с мочой (Ф.И. Комаров и соавт., 2004; Vijayalaxmi et al., 2002).
Фармакодиналшка мелатонина. В литературе описаны различные пути введения мелатонина: внутривенный, внутриназальный, трансдермаль-ный и оральный трансмукозный. При любом способе введения наблюдается повышение его содержания в кровотоке. Мелатонин быстро всасывается, за исключением трансдермального пути введения, когда требуется от 2 до 4 часов до повышения его уровня в плазме выше исходного. Пероральное введение мелатонина повышает его уровень в плазме уже через 30-150 минут, с периодом полураспада от 0,5 до 0,8 часов (Vijayalaxmi et al., 2002). Показано, что пероральный прием 0,3 мг мелатонина у людей повышает его концентрации в плазме крови в течение дня до нормальных ночных значений (I.V. Zhdanovaet al., 1996).
Период полураспада эндогенного мелатонина в сыворотке крови человека составляет от 30 до 60 минут, а экзогенного мелатонина - 12 до 48 минут (Vijayalaxmi et al., 2002).
Способность синтезировать мелатонин имеет индивидуальные вариации. Выделяют индивидуумов с высокой и низкой секрецией. Среди лиц с низкой секрецией пиковые уровни ночью колеблются от 18 до 40 пг/мл, тогда как у лиц с высокой секрецией они могут быть от 54 до 75 пг/мл. Несмотря на указанные вариации, у отдельных индивидуумов, ритм секреции мелато нина, сроки фаз и амплитуды, являются довольно постоянными (Ф.И. Комаров и соавт., 2004; Vijayalaxmi et al., 2002). В дневное время у человека уровень мелатонина в сыворотке крови не превышает 20 пг/мл, достигая максимальных значений (50-200 пг/мл) ночью (Vijayalaxmi et al., 2002).
Установлено, что секреция мелатонина уменьшается с возрастом. Средние суточные уровни мелатонина у пожилых людей составляют половину от аналогичных параметров у молодых лиц (В.Н. Анисимов, 2003).
При введении мелатонина экспериментальным животным в широком диапазоне доз (от 10 до 800 мг/кг) не сообщалось о его неблагоприятных эффектах (Vijayalaxmi et al., 2002). Исследования на добровольцах, получавших мелатонин в дозах от 1 мг до 1 г ежедневно в течение месяца, также не выявили каких-либо неблагоприятных побочных эффектов (Vijayalaxmi et al., 1996, 1998). Е. Mills и соавт. (2005) при проведении мета-анализа рандомизированных исследований по применению мелатонина в лечении солидных опухолей у человека не сообщили о каких-либо существенных побочных эффектах при использовании мелатонина в широком диапазоне доз.
Патоморфологические методы исследования
На протяжении опыта за животными вели постоянное наблюдение. Всех животных 2-ой и 3-й серий опытов пальпировали 2 раза в неделю для выявления опухолей. На специальных схемах отмечали сроки обнаружения, локализацию, размеры и степень изъязвления опухолей. Кроме того, для животных каждой группы 2-ой и 3-й серий рассчитывали среднюю продолжительность жизни, среднюю продолжительности жизни оставшихся 10 % выживших животных, латентный период развития опухолей, выживаемость животных после появления опухолей.
Патоморфологические методы исследования. Все животные, которые погибали или были убиты по истечении срока эксперимента, вскрывались и подвергались тщательному патоморфологиче скому исследованию. На аутопсии тщательно исследовались кожные покровы и внутренние органы.
У животных, получавших уретан (1 серия), на вскрытии извлекали легкие. Легкие фиксировали в жидкости Карнуа (абсолютный спирт : хлороформ : ледяная уксусная кислота в соотношении 6 : 3 : 1) в течение 5 минут, затем в 10 % растворе формалина в течение 5 суток. В легочной ткани производился подсчет количества и измерение диаметра опухолевых узлов на поверхности легких с помощью бинокулярной лупы MBS-9 2x8.
На основании измерения опухолевых узлов в легких было выделено 3 группы новообразований по размеру: малые ( 0,5 мм), средние (0,6 - 1 мм) и крупные ( 1 мм). Макропрепараты легких фотографировали цифровой фотокамерой Olympus Camedia С-770 в макро-режиме.
У животных, получавших бенз(а)пирен (2-ая и 3-я серии), производился подсчет общего числа опухолей кожи, и измерялись их размеры.
Все опухоли, а также ткани и органы подозрительные на наличие опухоли, были иссечены и зафиксированы в 10 % нейтральном формалине. После обычной гистологической обработки, ткани были залиты в парафин. Тонкие 5-7 мкм гистологические срезы были окрашены гематоксилин-эозином и тщательно исследованы микроскопически.
Неоплазии классифицировались согласно рекомендациям Международного агентства по исследованию рака (МАИР) (V.S. Turusov, U. Mohr, 1994). Для классификации опухолей легких дополнительно были использованы морфологические типы, приводимые в работе Л.А. Грицюте (1975).
В микропрепаратах опухолевой ткани животных всех опытных групп производилось определение митотического индекса по общепринятой методике (Л.П. Дьяконов, В.И. Ситьков, 2000).
Микропрепараты тканей опухолей фотографировали цифровой камерой Nikon Coolpix 4500 с помощью микроскопа Микмед-2 при увеличении х 80 и х 400. Полученные микрофотографии обрабатывали с помощью пакета программ Adobe Photoshop 7.0. Биохимические методы исследования.
У всех интактных мышей и у 5 - 8 мышей из каждой группы животных, подвергшихся воздействию канцерогенов, брали кровь и легкие для биохимических исследований. У животных собирали кровь, свободно вытекающую после декапитации (в среднем около 1 мл от каждой мыши).
Гомогенаты тканей получали следующим образом: кусочки тканей отрезали ножницами, отмывали от крови охлажденным 0,9 % раствором натрия хлорида, обсушивали фильтровальной бумагой. Навески тканей помещали в фарфоровую ступку. С помощью шлифовального пестика производили тщательное гомогенизирование в 0,9 % растворе хлорида натрия в соотношении 1 :9.
В сыворотке крови и гомогенатах опухолевой ткани оценивали интенсивность процессов перекисного окисления липидов. Для этого определяли уровень малонового диальдегида (МДА) (С.Г. Конюхова и соавт., 1989) и активность каталазы (М.А. Королюк и соавт., 1988). МДА представляет собой вторичный (промежуточный) продукт реакций перекисного окисления липидов (ПОЛ). Каталаза является одним из основных ферментов антиоксидантної! системы организма, катализирует восстановление перекиси водорода до воды, тем самым, уменьшая образование свободных радикалов (К.П. Конторщикова, 2000).
Методика определения МДА в исследуемой среде по С.Г. Конюховой (1989). Метод определения основан на реакции малонового диальдегида (МДА) с 2-тиобарбитуровой кислотой в кислой среде. К 0,8 мл воды добавляют 0,2 мл исследуемой среды и 1 мл 6 % тиобарбитуровой кислоты (ТБК) и помещают на 30 минут в водяную баню (температура 100С). Затем охлаждают до приобретения раствором желто-розового цвета и добавляют 1 мл 5н NaOH и 2 мл изопропанола, закрывают пробкой и встряхивают. Центрифугируют при 6-8 тыс. оборотов в минуту в течение 20 минут. Измеряют на фотометре в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 540 - 590 нм против воды.
Влияние мелатонина на частоту, множественность и размеры опухолей легких
Установлено, что мелатонин при введении в обеих дозах эффективно угнетал канцерогенез легких, индуцируемый уретаном у мышей. Основные результаты эксперимента представлены в таблице 5.
Через 6 месяцев после однократного интраперитонеального введения уретана в дозе 1 г/кг у 100 % животных в контрольной группе возникли множественные мультицентричные опухоли легких. Среднее число опухолей на 1 мышь составило 23 ± 2,63.
Среднее число опухолевых узлов малого размера ( 0,5 мм) составило 8,7 ± 0,90 на мышь. Отмечено преобладание опухолевых узлов среднего размера (0,6 - 1 мм), число которых на животное составило 10,9 ± 2,25. В большом количестве представлены крупные узлы ( 1 мм) - среднее число - 3,4 ± 0,65 на животное.
При введении мелатонина в дозе 20 мг/л мышам, получившим однократные инъекции уретана, опухоли легких возникли, подобно контролю, в 100 % случаев. Однако, общее среднее число опухолей на 1 мышь достоверно уменьшилось и составило 14,4 ± 1,20, что на 37,6 % меньше чем в контроле (р 0,01).
Среднее число опухолей малого размера составило 9,0 ± 0,94 на животное, что не отличалось от контроля (р 0,05). Множественность опухолей средней величины в группе достоверно уменьшилась (на 65,5 %) по сравнению с контролем и составила 3,8 ± 0,43 (р 0,01). Среднее число крупных опухолевых узлов достоверно уменьшилось на 52,1 % по сравнению с контролем и составило 1,6 ± 0,29 (р 0,05).
У мышей, подвергшихся воздействию уретана и получавших мелатонин в дозе 2 мг/л, опухоли легких также возникали в 100 % случаев, однако, их множественность была значительно меньше. Среднее число опухолей на 1 мышь абсолютно достоверно уменьшалось (на 52,2 %) по сравнению с контролем и составило 11,0 ± 0,75 (р 0,001).
Среднее число малых опухолей составило 7,1 ± 0,59, что на 18,6 % меньше по сравнению с контролем. Однако данное изменение оказалось ста тистически недостоверно (р 0,05). Число опухолей средней величины достоверно уменьшалось (на 68,2 %) по сравнению с контролем и составило 3,5 ± 0,45 (р 0,01). Среднее число крупных опухолевых узлов абсолютно достоверно уменьшалось (на 86,5 %) по сравнению с контролем и составило 0,5 ± 0,15(р 0,001).
При сравнении количества опухолей легких у мышей в группах, получавших разные дозы мелатонина, установлено, что статистическую достоверность имели изменения общего числа опухолей (р 0,05) и опухолей крупного размера (р 0,001).
Таким образом, введение мелатонина, не влияя на частоту развития опухолей легких у мышей, существенно уменьшало множественность и размеры опухолевых узлов. Под действием препарата существенно уменьшалось среднее, минимальное и максимальное число опухолей на животное. Причем, введение мелатонина не оказывало существенного влияния на количество узлов малого размера, тогда как число узлов среднего и крупного размера статистически достоверно уменьшалось. Больший эффект на указанные показатели оказывала меньшая доза мелатонина. Влияние разных доз мелатонина на количество опухолей легких у мышей, получавших уретан и мела-тонин представлено на рисунке 2.
Морфология аденом чрезвычайно характерна и сходна с описанной Л.А. Грицюте (1975) в фундаментальной работе «Экспериментальные опухоли легких». Макроскопически в нефиксированной легочной ткани в группе контроля опухоли представляли собой полупрозрачные серые выпуклые округлые, реже овальной формы узелки. При прикосновении пуговчатым зондом данные образования упругие, неподвижные. На свежем препарате их достаточно трудно рассмотреть.
После фиксации в жидкости Карнуа (абсолютный спирт : хлороформ : ледяная уксусная кислота 1:3:6) опухолевые узлы имели вид округлых белесоватых образований, четко отграниченных от легочной паренхимы (рис. 3). В большинстве случаев узлы располагались на поверхности легких суб плеврально, слегка приподнимая плевру, реже - в глубине легочной ткани.
Однако, в 13 % случаев (4 образца) отмечалось разрастание опухолевой ткани с нечеткими неровными границами по типу инфильтрации ткани легкого (рис. 4). На продольном срезе легкого опухоли располагались как на периферии, так и в прикорневой зоне, инфильтрируя корень легкого. В некоторых случаях опухолевая ткань располагалась в виде серовато-белых муфт перибронхиально.
В контрольной группе имелось 4 случая, когда общее количество опухолевых узлов в легких с трудом поддавалось точному подсчету (ориентировочно 180 - 200 узлов, в статистическую совокупность данные образцы не включались). При этом легкие имели вид «печени при крупноузловом циррозе» (рис. 5).
Влияние мелатонина на латентный период развития опухолей, продолжительность жизни и выживаемость опухоленосителей
Результаты изучения влияния мелатопина на развитие опухолей подкожной клетчатки, индуцированных однократным введением БП у мышей, представлены в таблице 7.
По истечении 7 месяцев у мышей, получивших подкожные инъекции БП, в 72,7 % случаев (24 из 33 животных) возникали опухоли подкожной клетчатки. Начиная со 126-х суток после введения канцерогена, у животных данной группы на спине в области введения БП возникали опухолевидные образования округлой формы, плотной консистенции с неровной поверхностью. По мере увеличения размеров опухолевые узлы теряли подвижность, становились фиксированными к подлежащим тканям. Кожные покровы над опухолью во всех случаях были изъязвлены, волосяной покров отсутствовал (рис. 32).
Среди опухолей, возникающих после короткого латентного периода (126 - 140 суток) преобладали опухоли большого размера. В подобных случаях часто наблюдались явления распада опухолевой ткани (рис. 33).
При исследовании post mortem кожные покровы не отделимы от поверхности опухоли. На разрезе опухолевая ткань беловато-серого цвета, имеет вид «рыбьего мяса», режется с хрустом. В большинстве образцов имели место фокусы некроза и кровоизлияния в ткань опухоли.
При вскрытии в большинстве случаев выявлено распространение опухоли per continuitatem на подлежащие ткани и органы: мышцы спины, па-ранефральную клетчатку, правую почку.
В нескольких случаях опухоль, прорастая в позвоночник, вызвала развитие нижней спастический диплегии. В 2 случаях была установлена перфорация нагноившейся опухоли в плевральную полость.
В контрольной группе у 6,1 % животных (2 мыши из 24) выявлено метастазирование опухоли в печень. В обоих случаях был обнаружен солитарный метастаз в правую долю печени: метастатическеии опухолевый узел размером 5-6 мм, округлой формы, плотной консистенции, четко отграничен от паренхимы печени (рис. 35). При введении мелатонина в дозе 20 мг/л число животных с опухоля ми составило 35 % (14 животных из 40), что на 37,7 % меньше по сравнению с контролем (р 0,01). При введении мелатонина в дозе 2 мг/л частота развития опухолей уменьшилась на 41,1 % по сравнению с контролем и составила 31,6 % (12 животных из 38) (р 0,001). Различия в частоте развития опухолей между группами животных, получавших разные дозы мелатонина, оказались статистически не значимыми (рис. 36).
Макроскопически в группе животных, получавших мелатонин в дозе 20 мг/л, лишь в одном случае отмечалось изъязвление над поверхностью опухоли. В остальных случаях, а также в группе, получавшей мелатонин в дозе 2 мг/л, нарушения целостности кожных покровов не было, во всех случаях на поверхности опухоли присутствовал волосяной покров (рис. 34).
В опытных группах в половине случаев опухоли имели капсулу, и не распространялись на подлежащие ткани. Кожа в большинстве случаев легко отделима от поверхности опухоли.
У мышей обеих опытных групп, получавших мелатонин, признаков метастатического поражения внутренних органов не было обнаружено.
Размеры опухолевых узлов под влиянием мелатонина существенно не изменялись. Так, в группе контроля средний размер опухолей составил 29,1 ± 1,28 мм. Аналогичные показатели в группах, получавших мелатонин в дозах 20 и 2 мг/л, соответственно, составили 28,8 ± 1,27 мм и 29,3 ± 0,81 (р 0,05).
Таким образом, мелатонин значительно уменьшал частоту опухолей мягких тканей у мышей: в 2,1 раза при введении в дозе 20 мг/л и в 2,3 раза -при введении мелатонина в дозе 2 мг/л по сравнению с контролем. Мелатонин оказывал антиметастатическое действие, препятствуя метастазированию сарком в печень.
Под действием мелатонина значительно изменялась макроскопическая картина опухолей в виде уменьшения или полного отсутствия изъязвления кожных покровов и сохранности волосяного покрова над поверхностью опухоли.
