Введение к работе
Актуальность темы. Изучение роли вирусов в возникновении опухолей человека составляет важный аспект современных исследований в области онкологии. Среди различных онкогенных вирусов существенный интерес представляет вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ), который относится к семейству герпесвирусов, является убпквитарным и персистирует в организме человека в течение всей жизни. С этим вирусом связывают возникновение африканской лимфомы Беркитта (ЛБ), недифференцированного рака носоглотки (нРНГ), В-клеточных лимфом у больных с нммунодефицитамн различного происхождения и др. Спектр патологических процессов у человека, п возникновении которых, предположительно, участвует ВЭБ, постоянно расширяется. В настоящее время широко обсуждается вопрос о роли ВЭБ в процессе канцерогенеза эпителиальных клеток желудка. Прямые доказательства ассоциации ВЭБ и рака желудка (РЖ) получены в результате обнаружения в опухолевых клетках ряда вирусных маркеров таких, например, как РНК гена EBER1, белков EBNA1 и LMP2. Кроме того, установлено, что опухолевые клетки, несущие геном вируса, моноклональны. Вирусные маркеры находили в опухолевых клетках желудка любой морфологической структуры, но наиболее часто при низкодифференцнрованных формах с интенсивной лимфоидной пролиферацией.
Практически 95-100% населения планеты инфицировано ВЭБ, однако, механизм возникновения ассоциированных с этим вирусом заболеваний, включая и РЖ, остается открытым. Возникает вопрос, один и тот же или разные генетические варианты вируса персистируют у здоровых и больных лиц, в опухолевых и морфологически "нормальных" клетках. В этой связи, ген ВЭБ -BNRF1, кодирующий латентный мембранный белок 1 (LMPI), представляет особый интерес. Во-первых, это один из немногих генов ВЭБ, который обладает трансформирующим потенциалом; во-вторых, определенные
4 структурные перестройки этого гена способствуют увеличению трансформирующего потенциала вируса. Возможно, дальнейший глубокий молекулярно-биологический анализ "опухолевых" и "неопухолевых" вариантов ВЭБ позволит, по крайней мере, приблизиться к решению поставленного вопроса.
Рак желудка в России занимает одно из ведущих мест среди наиболее часто встречающихся новообразований человека. В связи с этим, поиск ВЭБ-ассоциированных случаев РЖ (ВЭБ+РЖ) у населения страны, определение их частоты среди всех опухолей этой локализации, а также выяснение роли вируса в их этиопатогенезе, представляется актуальной научной и практической задачей.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей диссертационной работы явилось обнаружение ВЭБ-ассоциированных форм рака желудка в некоторых регионах России с различным уровнем заболеваемости РЖ, определение их удельного веса среди новообразований желудка, серологическая характеристика, а также детальное вирусологическое, молекулярно-биологическое и морфологическое изучение.
В ходе выполнения исследований предполагалось решить следующие задачи:
создать архив клинического материала от больных РЖ (парафиновые блоки с фрагментами опухолей, операционный материал, сыворотки крови);
исследовать опухолевый материал от больных РЖ из нескольких регионов России и стран бывшего СССР на присутствие вирусной информации в реакции гибридизации in situ (ISH) с использованием в качестве вирусного маркера РНК гена EBERI ВЭБ;
проанализировать морфологическую структуру случаев РЖ, ассоциированных с ВЭБ;
5 провести скрининг сывороток больных РЖ и здоровых носителей на
наличие и титры антител к белкам литического цикла ВЭБ;
определить первичную нуклеотидную структуру одного из генов
латентной инфекции ВЭБ - LMP1, амплифпцироваппого из образцов
опухолевой и морфологически неизмененной тканей желудка, больных ВЭБ-
ассоциированной формой РЖ;
субклонировать полученные варианты LMP1 ВЭБ в эукарнотический
экспрессирующий вектор и изучить их функциональное поведение.
Научнаи новизна и практическое значение работы. Научная новизна работы заключается в том, что впервые был проведен поиск ВЭБ-ассоциинрованных случаев РЖ в России, охарактеризована их морфологическая структура, изучен гуморальный ответ больных РЖ к белкам литического цикла инфекции ВЭБ. Кроме того, впервые были определены нуклеотидные последовательности вариантов полноразмерного гена LMP1 ВЭБ, амплифпцироваппого из опухолевой и морфологически неизмененной тканей ВЭБ+РЖ; проведен анализ по изучению их экспрессии и биологической активности, в частности, способности активировать транскрипционный фактор NFkB.
Практическое значение полученных результатов исследований состоит в выявлении форм опухолей желудка, ассоциированных с ВЭБ на территории страны. Обнаружение таких случаев РЖ может послужить важной предпосылкой для углубленного изучения их этиопатогеиеза, разработки новых подходов ранней диагностики и, возможно, терапии. Результаты данных исследований будут также способствовать более глубокому пониманию механизмов ВЭБ-ассоцнированного канцерогенеза на модели одной из эпителиальных опухолей человека.
Апробация работы. Диссертация апробирована 25 мая на совместной научной конференции лабораторий вирусного канцерогенеза, регуляции клеточных и вирусных онкогенов, молекулярной биологии вирусов и иммунологии онкогенных вирусов НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.
Основные положения диссертации докладывались на 23 Международной конференции «European Tumor Virus Group» (Франция, Париж, 1999) и 8-ой международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы» (Россия, Санкт-Петербург, 2000).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных статей и 9 тезисов докладов, 1 статья принята в печать.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, четырех разделов (обзор литературы, описание использованных материалов и методов, результаты исследований, обсуждение полученных результатов), выводов и списка использованных источников. Работа изложена на 111 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц, 13 рисунков. Библиография включает 5 источников отечественной и 144 иностранной литературы.
