Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 10
ГЛАВА II. Материалы и методы. 55
1. Аутологичная трансплантация 63
2. Аллогенная трансплантация 66
2.1. Режимы профилактики реакции «трансплантат-против-хозяина» 73
2.2. Оценка химеризма 75
3. Сбор костного мозга и периферических стволовых клеток 76
ГЛАВА III. Аутологичная трансплантация 79
1. Восстановление гемопоэза 87
2. Анализ зависимости скорости восстановления гемопоэза от характера трансплантируемого материала 8 8
3. Анализ группы больных,
получивших трансплантацию с использованием ПСК. 89
4. Анализ динамики восстановления гемопоэза при использовании костного мозга в качестве трансплантата. 97
5. Анализ используемых режимов кондиционирования . 99
6 Анализ динамики восстановления кроветворения, токсичности и выживаемости в зависимости от нозологии. 110
ГЛАВА IV. Аллогенная трансплантация 121
1. Оценка токсичности режимов кондиционирования 126
2. Инфекционные осложнения 130
3. Восстановление гемопоэза и оценка
гемопоэтического химеризма. 133
4. Профилактика острой РТПХ и факторы, влияющие на развитие острой РТПХ . 145
5. Эффект «трансплантат-против-опухоли» 157
6. Выживаемость и трансплантационная летальность 161
7. Заключение
ГЛАВА V. Обсуждение 165
Выводы 174
Практические рекомендации 176
Список литературы 177
- Режимы профилактики реакции «трансплантат-против-хозяина»
- Анализ зависимости скорости восстановления гемопоэза от характера трансплантируемого материала
- Анализ используемых режимов кондиционирования
- Профилактика острой РТПХ и факторы, влияющие на развитие острой РТПХ
Режимы профилактики реакции «трансплантат-против-хозяина»
В случае аллогенной трансплантации ПСК сохраняются все потенциальные преимущества метода по сравнению с трансплантацией костного мозга: это скорость восстановления гемопоэза, снижение себестоимости, уменьшение потребности в антибиотиках (46, 47). Предварительные результаты кооперированных и рандомизированных исследований так же говорят об отсутствии увеличения частоты возникновения острой РТПХ в группе ПСК, несмотря на то, что количество Т-клеток в трансплантате увеличено в 1,5-2 раза по сравнению с костным мозгом (46-48). Однако риск развития хронической РТПХ достоверно увеличивается при сохранении методики профилактики РТПХ, разработанной для трансплантации костного мозга (49).
Предположение о том, что клетки, сохраняющие способность к самообновлению, дифференцировке и делению, циркулируют в периферической крови в составе фракции лимфоцитов, было впервые высказано русским ученым Максимовым А. в 1909 году на лекции в Берлине (50). В 1962 году J.Goodman и G.Hodson впервые ввели термин «стволовые клетки периферической крови» (ПСК) (51). В это же время в опытах in vitro и экспериментально на животных было показано, что в крови циркулируют как истинные стволовые, так и полипотентные клетки, способные восстанавливать гемопоэз у летально облученных животных (52, 53). Первая удачная аутологичная трансплантация ПСК у собаки была осуществлена в 1964 году Cavins et al., а в 1965 году Freireich et al. осуществили первый сбор ПСК на непрерывнопоточном сепараторе у человека (54, 55). С момента первой трансплантации аутологичных ПСК у больного с хроническим миелолейкозом в 1981 году под руководством J.Goldman этот метод все активнее внедряется в клиническую практику (56). В настоящее время с использованием ПСК проводится более 90% всех аутологичных трансплантаций, этот процент ниже для аллогенных трансплантаций, однако он неуклонно растет (57, 58). См. рисунок 1.
Сбор ПСК уже стал рутинной процедурой у больных, нуждающихся в аутотрансплантации. Имеющиеся в педиатрической практике проблемы, связанные с малым объемом циркулирующей крови, высоким риском гиповолемических осложнений, необходимостью заполнять экстракорпоральный контур донорскими эритроцитами, к настоящему времени успешно преодолены (5, 59). Параллельно с этим у детей существует целый ряд проблем, связанных с выбором оптимального времени начала сепарации, техникой сбора, что в свою очередь вызвано интенсивной и, как правило, длительной XT до начала сбора ПСК, малым объемом циркулирующей крови, низкой массой тела и отсутствием хорошего венозного доступа. Таким образом, возможные метаболические и гемодинамические нарушения, маленькая скорость проведения процедуры, а подчас и отсутствие контакта с ребенком представляют собой особенности проведения лейкафереза в педиатрической практике.
Если для аутотрансплантации ПСК в настоящее время являются предпочтительным и ведущим источником клеток, то для аллогенной трансплантации используются как ПСК, так и костный мозг. Оба источника имеют свои преимущества и недостатки, как со стороны реципиента, так и донора. Содержание стволовых клеток (СК) в крови у здоровых индивидов в норме чрезвычайно низкое и составляет приблизительно 0,1 клетка на 1 мл, тогда как в костном мозге содержание стволовых клеток при аналогичных условиях в 100 раз выше (60). В подобных обстоятельствах периферическая кровь не может служить адекватным источником стволовых клеток. Для увеличения в 10-50 раз количества циркулирующих СК C.Richman et al. в 1976 году впервые использовали феномен возрастания количества этих клеток в фазе выхода из аплазии кроветворения, индуцированной циклофосфамидом. С тех пор предложено множество мобилизационных режимов, включающих различные комбинации химиопрепаратов.
С появлением колониестимулирующих факторов (КСФ) методика сепарации совершенствуется. Мобилизация при помощи КСФ самостоятельно или последовательно с XT позволяет добиться увеличения количества циркулирующих СК в 370 раз и более в сравнении с условной нормой и достоверно улучшить качество собираемого материала (60). Несмотря на отсутствие рандомизированных исследований, комбинация ХТ+КСФ признается более эффективной большинством авторов по сравнению с раздельным назначением XT и/или КСФ (61, 62). При этом по данным специалистов Европейской Школы Онкологов, назначение гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) в сочетании с XT вызывает в 10 раз больший прирост циркулирующих СК, чем назначение одного Г-КСФ. Традиционно КСФ назначается на следующий день после окончания XT. По данным Европейской группы по трансплантации крови и костного мозга (ЕВМТ) 83% сеансов сепарации ПСК проводится после комбинированной мобилизации XT в сочетании с тем или иным КСФ. (рисунок 2).
Анализ зависимости скорости восстановления гемопоэза от характера трансплантируемого материала
Исследования показали, что благодаря фето-материнской трансфузии в процессе вынашивания беременности развивается толерантность к HLA антигенам отца (147). Используя метод ПЦР, удалось показать наличие персистирующего смешанного химеризма в крови матери через 17 лет после родов и наличие толерантности ее иммунокомпетентных клеток к HLA антигенам сына (148). Подобный феномен известен при трансплантации солидных органов (149).
Первая успешная гаплоидентичная трансплантация ПСК без предварительной Т-деплеции, базирующаяся на доказанной персистенции толерантности со стороны матери, была осуществлена больному с ХМЛ группой ученых из Японии в 2001 году (148). Суммируя результаты частично-совместимых трансплантаций, необходимо отметить следующее: 1) подавляющее количество трансплантаций проводится с использованием деплеции иммунокомпетентных клеток, 2) критической дозой Т-клеток в трансплантате, позволяющей не проводить посттрансплантационную профилактику РТПХ, является 2,0x104 СДЗ+/кг, 3) реакция отторжения трансплантата может быть успешно преодолена включением в режим кондиционирования флюдарабина и моно-/поликлональных антител, 4) большие дозы СД34+ клеток ( 15х106/кг) ускоряют восстановление гемопоэза и иммунной системы и снижают раннюю посттрансплантационную летальность, однако трансплантация таких доз клеток трудно выполнимая задача, особенно у взрослых, 5) исследования последних лет в области NK-клеток и их роли в противоопухолевом иммунитете открывают новые перспективы использования феномена «трансплантат-против-опухоли», даже в случае удаления
Т-клеток из трансплантата, 6) посттрансплантационная летальность, острая и хроническая РТПХ при гаплоидентичных трансплантациях не превышает таковой при не родственной совместимой трансплантации, что заставляет по-новому взглянуть на необходимость регистра доноров, 7) интересной перспективой является сочетание гаплоидентичной трансплантации с немиелоаблативными режимами кондиционирования, что может снизить посттрансплантационную летальность.
На ранних этапах развития трансплантации гемопоэтических клеток противоопухолевый эффект связывался с химическими и/или физическими агентами, а трансплантация рассматривалась лишь как способ преодолеть гематологическую токсичность режимов кондиционирования. В конце 50-х начале 60-х годов с использованием экспериментальных моделей и клинических наблюдений, было показано наличие эффекта «трансплантат-против-лейкоза», обеспечиваемого донорскими клетками (150, 151). Позднее, с ростом числа наблюдений, наличие этого эффекта было подтверждено более низким риском развития рецидива у больных с РТПХ и более высоким риском у больных с Т-клеточной деплецией трансплантата и после трансплантации от сингенных доноров (152-154).
Прямым доказательством наличия эффекта «трансплантат-против-опухоли» послужила возможность индукции ремиссии у больных ХМЛ, рецидивировавших после родственных трансплантаций, путем инфузии донорских лейкоцитов (155, 156).
Результаты проведения миелоаблативных режимов серьезно скомпрометированы высоким процентом развития фатальной токсичности, тяжелых инфекций, длительной миелосупрессии, высоким риском развития РТПХ, выраженность, которой напрямую связана с химиолучевым поражением тканей реципиента (Менткевич Г., 1994). В 1976 году Slavin S. и другие исследователи показали возможность проведения успешной трансплантации и реализации эффекта «трансплантат-против-опухоли» при применении низких, немиелоаблативных доз лучевой терапии. (157-161).
Режимы кондиционирования со сниженной интенсивностью позволили расширить показания для трансплантации в группе больных старше 50 лет, больных с выраженной соматической или инфекционной патологией, а также по новому взглянуть на задачи аллогенной трансплантации и на реализацию эффекта «трансплантат-против-опухоли» у больных с солидными новообразованиями, где этот вид лечения был незаслуженно забыт в связи с крайне высокой посттрансплантационной летальностью на фоне миелоаблативных режимов кондиционирования. Результаты последних лет свидетельствуют в пользу наличия эффекта «трансплантат-против-опухоли» у больных с метастатической светлоклеточной саркомой почки, где было получено 10 из 19 положительных ответов (из них 3 полные ремиссии), раком яичника мелкоклеточным раком легкого, раком молочной железы (162, 163). Возможность получать смешанную или полную гемопоэтическую химеру, при незначительной токсичности, существенно изменила прогноз и подход к лечению неопухолевых, наследственных заболеваний.
Анализ используемых режимов кондиционирования
В структуре посттрансплантационной летальности ведущее место в группе ПСК занимала инфекция. Всего в группе ПСК погибло 11 больных. Схожей была и структура летальности, связанной с трансплантацией в подгруппах. В подгруппе А и Д по одному больному погибло от сепсиса (12,5%), в подгруппе В погибло 6 больных (25%) (четверо больных погибли от сепсиса, один больной ото тяжелой ВОБ и 1 больной от тромбоэмболии легочной артерии). В подгруппе С от сепсиса погибло 3 больных (12%).
Учитывая сходные тенденции в подгруппах, где количество трансплантированных СД34+ клеток бьшо субоптимальным (подгруппы А и В), по сравнению с подгруппами С и Д и для удобства анализа, мы объединили эти группы попарно. В группу I вошли все больные, получившие менее 5,0x106 СД34+/кг (подгруппа А и В), а в группу II больные, получившие 5,0х106 СД34+/кг и более (подгруппы С и Д). При слиянии подгрупп влияние дозы СД34+ клеток в трансплантате на восстановление кроветворения, потребности в трансфузиях и длительность терапии КСФ сохранились и даже усилились. В группе I было перелито в среднем 3,1 (1,3-11,0)х108 ЯК/кг, содержащих 3,2 (0,2-4,9)х106 СД34+ клеток/кг, против 3,3 (1,5-10,8)хЮ8ЯК/кг, содержащих 6,8 (5,0-18,0)х106 СД34+ клеток/кг (рИ),5 и р 0.005, соответственно). Достоверно более быстрое восстановление лейкоцитов 1,0х109/л отмечалось в группе II по сравнению с группой I и составило 10 (8-16) дней против 12 (8-32) дней (р=0,002). Восстановление тромбоцитов 20,0x109/л происходило быстрее в группе II, в среднем на 14 (0-64) день, чем в группе І, в среднем на 24 (0-180) день, однако разница не была достоверной (р=0,1), как и в случае анализа по четырем подгруппам, где достоверность наблюдалась только для крайних групп. Зато при анализе сроков восстановления тромбоцитов более 50,0x109/л более заметно проявились преимущества трансплантации больших доз СД34+ клеток. Во II группе сроки восстановления этого показателя составили в среднем 18 (0-60) дней против 39 (0-102) дней в I группе (р=0,008). Соответственно, больные II группы потребовали достоверно меньше трансфузий тромбоконцентрата. В группе I было перелито в среднем 7(0-13) доз против 4 (0-11) доз во П группе (р=0,037). Количество СД34+ клеток, как и при анализе по подгруппам, не оказало влияния на количество трансфузий эритроцитарной массы и СЗП. Несмотря на одинаковую среднюю дозу КСФ, используемых в группах (7,5 (4-13) мкг/кг против 7,5 (3,6-12,0) мкг/кг в группах I и II, соответственно), длительность его применения достоверно отличалась и составила 14 (4-32) дней против 12 (7-20) дней в группах I и II, соответственно (р=0,5 и 0,007, соответственно).
Одним из самых важных преимуществ трансплантации ПСК, по сравнению с КМ, является достоверно более короткий период аплазии кроветворения после их трансплантации. В среднем, по данным литературы, он составляет 11-13 дней для восстановления лейкоцитов 1,0х109/л и 15-17 дней для восстановления тромбоцитов 20,0х109/л. В нашем исследовании, в тех случаях, когда восстановление лейкоцитов более 1,0х109/л наблюдалось в течение первых 14 дней от трансплантации (группа быстрого восстановления (БВЛ, п=50)) было перелито 5,2 (0,2-18,0)х106 СД34+/кг против 3,2 (1,0-6,2) х106СД34+/кг в группе больных с более медленным восстановлением (группа медленного восстановления (МВД, п=8)) (р=0,009). При сравнении с группой, где больные погибли от токсичности кондиционирования, не восстановив лейкоциты, не выявлено достоверной разницы ни в количестве перелитых СД34+ клеток (в среднем в группе больных с фатальной токсичностью перелито 5,6 (2,9-10,2)хЮ6СД34+ /кг (рЮ,9 по сравнению с группой БВЛ и р=0,06 по сравнению с группой МВД), ни в дозе КСФ (средняя доза 10,0 (3,6-12)) мкг/кг (р=0,5 и р=0,4 с группами БВЛ и MB Л, соответственно). Больные перед трансплантацией получили 6 (4-7), 5 (4-18) и 6 (2-7) курсов, химиотерапии в группах БВЛ, МВЛ и группе больных, погибших от токсичности без восстановления кроветворения (ТСЛ, п=7). Несмотря на отсутствие видимой разницы в абсолютных цифрах, при статистической обработке данных прослеживалась тенденция к более интенсивному лечению в группе БВЛ и ТСЛ (в среднем по 6 курсов химиотерапии) по сравнению с группой МВЛ (в среднем 5 курсов химиотерапии) (р=0,06 между группами МВЛ и ТСЛ и р=0,05 между группами БВЛ и МВЛ). Подробно сведения в таблице 18.
Профилактика острой РТПХ и факторы, влияющие на развитие острой РТПХ
Профилактика РТПХ циклоспорином А в посттрансплантационном периоде осуществлялась в 10 случаях родственной частично совместимой трансплантации и одном случае родственной совместимой трансплантации. Длительность внутривенного введения циклоспорина А зависела от присоединившейся инфекции, сроков восстановления кроветворения, степени выраженности стоматита и колебалась от 9 до 40 дней. После чего больные переводились на пероральный прием препарата. Профилактика РТПХ циклоспорином А продолжалась в среднем до дня+61 (32-167) и была отменена в связи с исчезновением симптомов РТПХ в 1 случае (день+167), с развитием рецидива основного заболевания в 3 случаях (дни +29, 41, 81), неэффективностью профилактики в связи с заменой на другие иммуносупрессоры в 2 случаях (дни +84 и +120), неприживлением донорского трансплантата в одном случае (д+70) и смертью больных в 4 случаях. Профилактика прерывалась в 4 случаях. В связи с органотоксичностью в 3 случаях (дни +14, 29, 50) и высоким уровнем в крови в одном случае (д+11). Органотоксичность характеризовалась подъемом креатитина и мочевины сыворотки более 2 нормальных величин в 2 случаях, развитием острой почечной недостаточности в I случае. Во всех случаях уровень циклоспорина в крови не превышал 350 нг/мл. Во всех 3 случаях отмены циклоспорина введение было возобновлено со снижением дозы на 30% при нормализации биохимических показателей крови. В одном случае у больной отмечалось повышение креатинина в 1,5 раза от нормы и уровень циклоспорина составил 840 нг/мл на день +11. Циклоспорин был отменен на 4 дня и возобновлен при достижении уровня в 140 нг/мл. В 2 случаях больные были переведены на прием микофенолат мофетила в комбинации с моноклональными или поликлональными антителами. Смерть больных наступила от острой резистентной РТПХ в одном случае, тяжелой веноокклюзионной болезни в одном случае и от инфекции в 2 случаях.
В 3 случаях применялась профилактика метотрексатом в сочетании с циклоспорином А по схеме: метотрексат 10 мг/м2 на дни 1 и 3 и 5 иг/и2 на день 6 (в 2 случаях, при трансплантации ПСК на день 0 и +1 введения метотрексата переносились на один день, дни 2,4, 7) и циклоспорин А 3 мг/кг/день на 2 приема, внутривенно за 4 часа с день-l. В одном случае, несмотря на немиелоаблативный режим кондиционирования, ко дню+6 наблюдался стоматит 2 степени. Однако, несмотря на введение третьей дозы метотрексата, на день +7 не было отмечено нарастание мукозита у больного. Метилпреднизолон в качестве первичной профилактики острой РТПХ использовался в 3 из 17 случаях аллогенной трансплантации (18%). Доза варьировала от 1 до 3 мг/кг. Введение метилпреднизолона в одном случае было прервано в связи с развившимся желудочно-кишечным кровотечением. Доза метилпреднизолона была увеличена до 10 мг/кг в 2 случаях в связи с развитием острой РТПХ. Подробно о режимах профилактики острой РТПХ в таблице 14.
В 2 случаях, когда циклоспорин А не назначался в качестве первичной профилактики РТПХ, он был назначен в качестве терапии острой РТПХ в дозе 3 мг/кг на день +6 и +14, соответственно.
Острая РТПХ II степени наблюдалась в 9 из 14 случаях (64%) частично-совместимой трансплантации и 9 из 10 (90%) случаях восстановления гемопоэза. В 1 случае наблюдалась острая РТПХ I степени с поражением кожи 2 стадии. Острая РТПХ не наблюдалась в 2 случаях сингенной трансплантации, в 1 случае родственной полностью совместимой трансплантации от сиблинга. В 3 случаях родственной частично совместимой трансплантации острая РТПХ не наблюдалась у 2 больных, у которых не отмечалось восстановления лейкоцитов 1,0х109/л и в I случае у больного с отторжением трансплантата и восстановлением аутологичным костным мозгом. Острая РТПХ I-II степени наблюдалась в 5 случаях и III-IV степени в 5 случаях родственных частично совместимых трансплантаций, где больные восстановили лейкоциты более 1,0х109/л. Не наблюдалось достоверного влияния количества СДЗ+ клеток на степень проявления острой РТПХ. У больных с I-II степенью острой РТПХ было перелито 3,1 (2,5-8,6) против 3,2 (2,4-39,2) хЮ8 СДЗ+ клеток/кг в группе больных с острой РТПХ III-IV степени (р=0,5).
В группе, где наблюдалась острая РТПХ, первые ее признаки появлялись достаточно рано, по сравнению с данными литературы, анализирующими трансплантации от родственных и неродственных совместимых доноров. В среднем интервал от аллогенной трансплантации до появления первых симптомов острой РТПХ составил 10 (5-45) дней. В группе больных, которым профилактика проводилась с применением метотрексата и АТГ вводился по схеме через день с дня-5 по день+l, симптомы острой РТПХ возникали значительно позднее, в среднем на 17 (16-45) день. В группе больных, которым АТГ вводился по стандартной, ежедневной схеме на день с-4 по -1 в комбинации только с циклоспорином или без него, средний срок возникновения острой РТПХ составил 8(5-12)дней.(р=0,048).
Во всех 10 случаях поражались кожные покровы. Поражение кожи наблюдались в виде эритематозной макулопапулезной сыпи, проявляющейся первоначально в области ладоней, подошв и на кончиках пальцев. Появление сыпи в 90% случаев сопровождалось умеренным кожным зудом. В дальнейшем сыпь распространялась на кожу туловища и конечности. В 4 случаях (40%) наблюдалась гиперемия лица. При прогрессировании острой РТПХ характер сыпи видоизменялся на буллезный, присоединялись признаки эпидермолиза (положительный симптом Никольского). Эпидермолиз был преимущественно выражен на коже туловища. Папулезная сыпь принимала вид сливных застойных пятен. Отмечалось диффузное мелкопластинчатое шелушение кожи. Одновременно поражались слизистые: отмечалась отечность слизистой, субатрофический фарингит, гингивит, ороговение эпителия на внутренней поверхности щек в виде нежного белесоватого налета по типу поражения слизистой оболочки, встречающейся при красном плоском лишае, отличного от грибковой инфекции. У больных отсутствовали жалобы на боли, но отмечался дискомфорт и сухость в полости рта. Одновременно, у 2 больных женского пола отмечались жалобы на зуд в промежности, однако, учитывая клиническую картину вульвовагинита, аплазию кроветворения, массивную антибиотикотерапию и высевы из влагалища грибов рода Candida, эти проявления трактовались и лечились, как грибковые поражения. В 3 случаях наблюдалась острая кожная РТПХ 1 стадии, в 3 случаях- 2 стадии, в 3 случаях-3 стадии и в I случае-4 стадии. Поражение кожи являлось первым признаком развития острой РТПХ в нашем исследовании.
