Введение к работе
Актуальность работы.
Онкогены семейства RA3 причзстны к развитию широкого спек
тра опухолей человека и лиеогных. В некоторых типах неоплазм у
людей обнаружено до 90% случаев мутаций в "горячих" кодонах
генов HRA31, KRA.S2 или NRAS, а их повышенная экспрессия пска1-
-вана-- примерно - в половине изученных новообразовании (Weinberg
R. et al. ,1987; Еоз J. L, 1989). Мутациі в онкогене KRAS1 ре
гистрируются, в целом, реже; чем' в KRAS2 или HRAS. Однако
HRAS1 является одним из наиболее часто экспреесирукяцихся в
злокачественных опухолях человека онкогенов, наряду с KRAS2,
CMYC и CFCS (Slamon D.J. et al. , 1964). Нэ исключена вероят
ность того, что конститутивные особенности гена HRAS1,. отлича
ющегося от других генов RAS аллельным полиморфизмом, .оказывают
влияние на изменение его экспрессии и, возможно, на ЗЛОКачеСТ.-
ВеННОе ПерэрОЗДеНИе КЛЄТ0К. ,
Полиморфизм длин рестрикционньк фрагментов (ПДР-Ї) онкогена HRAS1 . в геноме.человека обусловлен наличием на 3'- конце гена области вариабельно-тандемного повтора (ВТП), структурной еди-' ницей которого является палиндромная последовательность, длиной 28 пар нуклеотидов (Capon D. J. et al. ,1983, см. рис.1). Эволюцией оказались отобраны 4 варианта амплификации этой последовательности, формирующие 4 основных аллеля (ОА) гена': А1, А2, A3 и А4 (Krontlris Т. D. et al. ,1985). Они составляют 96% ст. всех выявленных аллелей. Помимо ОА в геноме человека было найдено несколько, редких аллелей (РА), встречающихся у 4-5% людей и незначительно, на, 0,1-0,3 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.),. отличающихся по своему размеру от основных.
Т. D. Krontlris с соавт. (1985) обнаружили у онкологических больных, по сравнению со здоровыми донорами, вдвое большую частоту РА(10% и 5%, соответственно). Те же авторы предположили, что область ШТ1 онкогена HRAS1 может вести себя как знхан-сер и показали в опытах по трансакции увеличение в 5-10 раз экспрессии HRAS1 под влиянием ІЇЇП. R, Lidereou с соавт. (1966) выявили не толіко значительно Панкину» частоту РА у больных раком молочной ж?лззм (41";, по сравнения с. 10% в здоровой попу-
Рис. і ,'Сх-жи рас!]'олс.!;ліИл кодирушлх дсслс-доаат^лыюитей (черные іір.іі.іоугожпігн-іі) и области вариабельно-тан-дзиисго поЕтеріДЬТП - белый прямоугольник) FJ-liRASi-оцкогена (Capon и. J. et al. , 1Й83)
1 Z 3 4 5 6 7т.п.н.
8am HI Mspl Hspl BnmHI
5'1 rar—— ^^===^ '—13"
PniU PvuII BTn PvuII
PVUH- ФРАГМЕНТ,
РАЗМЕРОМ 2,6Т.П.Н. PvuH-фрдгмЕнт,
РАЗМЕРОМ 2,7 т.п.н.
: Вертикальными лишим» сіючши сайты рестрикции эидонуклоаэ ВапШ, PvuII и blspl.
ляции), но и окязь РА с агрессивным течением .опухолевого габо-.лзвания. Однако сразу в нескольких цослодоразепх публикациях били представлены данные о примерно равной доле-РА у. Сольных и 8Доровых людей, в том числе и у больных-раком молочной' лелееы (White G.R.H et al., 15S8). '....-
ПДРФ HRAS1 позволяет, не только опр;-д:-.г.и':'ь комбинацию аллэ-лен или генотип.индивида, но к вылвлн'гь е опухолевой ДНК перестройки онкогена, например, потерю одного из его -аллелей.' Шредкие делеции (20-60) последовательностей короткого плеча. 11 хр'оыэсош, в том числе и гена HRAS1 (р15.5); были найдены в опухолях Вкльмса, рабдомиосаркомах, карциномах ,мочевого пузыря, молочной железы'и некоторых других,злокачественных НОЕООб-разованиях человека (Koufos.F. et al., 1985; Scrable Н. J. et al., 198У; Fearon E. R. et ai. , 1984; -1985^ Theilleb С. et al. , 1986). ' ,
ДеЛбЦИЯ Нормальних КЛЄТОЧНІІХ ПОСЛЄДОГ/ДТЄЯЬНОСТЄ-ft MOS-5T
біігь следствием высокой генетической кїєтсОиліности опухолешх клеток, to как было показано для аішюнксгенов - гена роти- .
.. з - исбластомы и гена р53, потерн алладя дикого типа иокет.также демаскировать рецессивную мутацию другого. оллеля/ что в свою очередь ішдуцкруег развитие опухоли (Cavenee , VAK. et al. , 1933). С этой точки зрения, частые делении какого-либо "гена свидетельствуют о его возможной сунресспрую'дей функции в кдет-
-ке.- -Учитывай то, что гены 11 хромосомы, особенно последовательности короткого плеча, вовлечены в- супрессию туморогеннос-ти клеток HeLa (Strivatsan Е. et al. ,1988;' Sa>:on P. J. et al.,1986), мокно сделать предположение сб участии онкогена HRA31 в подавлении неопластического фенотипа, а значит и о том. что какой-либо аллель HRAS1 дикого типа способен нивели-
. ровать действие мутантного гомолога.
Число работ, посвященных изучению структуры и функции онкогена HRAS1 в неоплазмах человека, сравнительно невелико. Основное внимание до последнего времени уделялось линиям опухолевых клеток, которые, как известно, не по всем параметрам адекватно отражают ситуацию in vivo. В большинстве исследований ІЩРФ онкогена HRAS1 в первичных опухолях ассоциаций каких-либо ОА с предрасположенностью к развитию рака не было наедено. Существуют только 4 работы, в которых была установлена повышенная частота самого большого аллеля А4 у больных ке-мелкоклеточным раком легкого, раком толстой кищси и меланомой (Heighway J.et al. ,1935; Vyllie F.S.et al. ,19S8; Radice P. et al. ,1987; Hayvcrd N. K. et al. ,1989). Вследствие неполноты и разрозненности данных о ПДРФ онкогена HRAS1, в настоящий момент не существует каких-либо конкретных заключений о функции определенных аллелей HRAS1 в канцерогенезе у человека, а тага» о частоте-и специфичности его 'делеций.
Поэтому представляется важным и весьма перспективным изучение конститутивных различий гена HRAS1 у онкологических больных в сопоставлении со здоровыми людьми. Детальный сравнительный анализ частот и перестроек аллелей онкогена HRAS1 в ДНК опухолей разных локалиеацнй, гистологических типов, стадии прогрессии поможет прояснить роль аллелей этого гена в возникновении карцином определенного тип?.. Кроме того, это позволит
- 4-глуб* поіілгь ' рогулятирний характер области ВТП онкогена tii:;,',:li.,-a" їаи.а возможные шхакиамы его активации.
liMfc ^^Д':!!1^^1С/-^У.&?1*31Лель! настоящей работы является .
п:..учиние распределения и перестроек аллелей онкогена KRASI'b'
і'.-5кгіторь(х распространенных карциномах человека. В связи с этим
'поставлены следушке задачи: ' . '
-
анализ распределения аллелей'- прстоонкогена HRAS1 у больных ракзм молочной ?,еле<ш (ИМ), толстой кишки (РТЮ, легкого (РЛ), щитовидной '*глеги (ПДЮ it яичникоб (РЯ), б сравни- ' нии с популяцией спорових доноров; .
-
исследование структурных перестроек.онкогена: делеций, амплификации, изменеиид длшш аллеля - в первичных и мзтасга-.' тических опухолях тех кз нозологических групп;' .-..'. ,. .
; ;3) вьяЕлзиие ассощіаций ..определенных аллелей HRAS1 и их структурних нарушений, со стадией' прогрессии -злокачественных ' признаков опухолей, например, уровнем штастазцрования и другими клшшко-патологическиш параметрами еаболевания,
' Научная новизна и практическая значимость \ полученных результатов. 3 результате выполнения диссертационного исследования получен ряд новых данных:
- впервые на большем количестве клинического материала
(255 больных) представлено распределение аллелей онкогена'
' HF2AS1 в основных типах рака человека, по сравнении с популяци
ей здоровых доноров; . : . '
- в результате сравнительного,анализа собственных и лите
ратурных данных впервые показана' значимая еьЛзь редкого аллеля
А6 онкогена HRAS1" с развитием" злокачественных опухолей
(P'.O'.OI); . . ' . ' " '.'"''. '
-"впервые обнаружена ассоциация аллеля А2 онкогена HRAS1 с активным мотастазированием РШ, низкий уровнем эстрогеновых и нрогеетероновых рецепторов (Р<0,05) и пременопаузальным статусом больных РІД (Р<0,05). Большая часть делеций (7 из 10 случаев) также найдена в ДШГ опухолей,- содержащих Л2 аллель;
- установлена статистически достоверная сеязь встречаемое- '
ти онкологических заболеваний среди бли:кайш'.х 'родственников
- 5 - ' больных РЮК с наличием в их генотипе А2 аллеля онкогена HRAS1 (Р<0,01) и с повышенной частотой делеции короткого пле-ча(р15.5) 11 хромосомы в опухолевой ДНК этих больных (Р<0,02);
выявлена тенденция к повышению частоты аллеля Л2 онкогена HRAS1 и понижению А4 у больных с активно метастазирующики, низкодифференцированными РЯ (Р<0,1) и инвазивными РВД (Р<0,1);
показано у кеншин с порамениеь- различных органоз (РШ, РЯ, РЩІ, РЛ и РТК) значительно' большее содержание аллеля А2 в возрастной группе до 50 лет, чем з группах от 50 до 65 и, особенно, старше 65 лет (Р<0,05). Напротив, для мужчин, имеющих этот аллель в генотипе, отмечена тенденция к более поздним срокам возникновения онкологического заболевания (РЛ, РТК) -старше 65 лет, а в группе до 50 лет был обнаружен всего один пациент с аллелем А2 онкогена HRA31 (Р<0,1)-,
. - впервые обнаружена значимая связь повышенной частоты перестроек локуса гена HRAS1 в немелкоклеточных РЛ с присутствием в последних аллеля А4 (Р<0,01). В большинстве выявленных нарушений онкогена (6 из 8 случаев) аллель А4 . либо оставался неповрежденным при делеции или изменении длины другого аллеля, либо число его копий увеличивалось. У больных РЛ указанный аллель ассоциировался тага с прогрессией злокачественных признаков опухолей и низкой выживаемостью.
Диссертационная работа имеет научно-теоретический характер. Ее практическая значимость характеризуется следующим.
Данные о распределении и перестройках аллелей онкогена HRAS1 в РШ, РТК, РЛ, РШД и РЯ могут быть использованы для дальнейшего изучения кооперативного участия генов RAS и других онкогенов- в развитии этих типов карцином, а в будущем, возможно, лля разработки молекулярно-генетических тестов, применимых в диагностике злокачественных новообразований у человека и прогнозе течения заболевания. Выявление сеязи аллеля А2 онкогена HRAS1 с определенными признаками семейного заболевания РМЕ, открывает перспективу использования А2 аллеля как маркера генетической предрасположенности к заболевании ?!/5. Обнаруженная ассоциация аллелл Лч с агрессивными пог'ътни^м ?Л и nosy-
шенной частотой перестроек в карциномах, содержащих А4, позволяют с определенной осторолшостыо рассматривать А4 аллель онкогена HRAS1 как эндогенный фактор риска заболевания немелкок-леточным РЛ.
Апробация работы. Основные положения . диссертации били представлены на республиканской конференции "Механизмы канце-ро- и лейкозогенеза" (Киев, 1990), советско-французских симпозиумах "Вирусология и молекулярная онкология" (Париж, 1988;. Рига, 1990), симпозиумах "Современные направления в изучении лейкемий человека YIII и IX" (Гамбург, ФРГ; 1989 и 1990), а также на'совместном заседании.лабораторий биохимии, онкоимму-нологии,' экспериментальных опухолей и эндокринологии НИИ онкологии им. проф. Е Н. Петрова Ыинздрава СССР.
Структура и объем диссертации, диссертация изложена на 171 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав материалов и методов, результатов исследований, обсуждения полученных данных и выводов. Работа идлюстри-. рована 18 таблицами и 22 рисунками. Библиографический указатель включает 171 публикацию на русском' и английском языках.
