Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 13
1.1. Заболеваемость, смертность, выживаемость, факторы риска рака яичников 15
1.2. Наследственный рак яичников 18
1.3. Химиотерапия распространенного рака яичников 3 О
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 46
2.1. Клиническая характеристика обследованных групп больных 44
2.2. Методы исследования 43
ГЛАВА III. Результаты собственных исследований 56
3.1. Частота встречаемости и клинико-морфологические особенности наследственного рака яичников 58
3.2. Сопоставление эффективности стандартных схем неоадъювантной химиотерапии у больных распространенным РЯ носительниц мутаций в гене BRCA1/2 и больных без мутаций 59
3.3. Оценка эффективности и токсичности монохимиотерапии препаратом цисплатин в сравнении с комбинированной платиносодержащей химиотерапией у больных наследственным РЯ 66
3.4. Анализ результатов циторедуктивных операций у пациенток после проведенной неоадъювантной химиотерапии в группах сравнения
ГЛАВА IV. Обсуждение результатов 80
Выводы 85
Практические рекомендации з
Приложение 89
Список литературы
- Наследственный рак яичников
- Методы исследования
- Сопоставление эффективности стандартных схем неоадъювантной химиотерапии у больных распространенным РЯ носительниц мутаций в гене BRCA1/2 и больных без мутаций
- Анализ результатов циторедуктивных операций у пациенток после проведенной неоадъювантной химиотерапии в группах сравнения
Наследственный рак яичников
Заболеваемость злокачественными новообразованиями яичников занимает третье место в структуре онкогинекологической патологии [1]. В мире малигнизированные опухоли яичников диагностируются у 9-17 на 100 тыс. женщин в год [2]. В России в 2013 г. стандартизированный показатель заболеваемости злокачественными опухолями яичников составил 10,73 на 100 тыс. населения. Эпидемиологические исследования показывают, что за последние десятилетия отмечается неуклонный рост заболеваемости малигнизированными опухолями яичников. Среднегодовой темп прироста заболеваемости раком яичников в России составляет 1,58 [3].
Несмотря на внедрение современных методов лечения, летальность при раке яичников занимает первое место в структуре смертности от онкогинекологических заболеваний [2,3]. На первом году с момента установления диагноза умирает 27,4 % больных. Стандартизированный показатель смертности при малигнизированных опухолях яичников в России в 2013 г. составил 5,84 [2,3].
Ежегодно в мире регистрируется более 165 тысяч новых случаев рака яичников (РЯ) и более 100 тысяч смертей от злокачественных опухолей яичников (данные Международного агентства по изучению рака). Наиболее высокие стандартизованные показатели заболеваемости в северной части Европы и в Северной Америке - более 12 на 100 тыс.. В России ежегодно рак яичников выявляют более чем у 11 тыс. женщин (10,17 на 100 тыс.). Прирост заболеваемости в России за последние 10 лет составил 8,5%.
Большинство опухолей яичников являются эпителиальными. Все опухоли могут быть разделены на доброкачественные и злокачественные. Статистические сведения о частоте опухолей яичников в женской популяции касаются только их злокачественных форм. Среди злокачественных опухолей женских половых органов опухоли яичников (карциномы, стромальноклеточные и герминогенные опухоли) занимают третье место после рака шейки и тела матки, их доля достигает 30%. Среди всех злокачественных новообразований у женщин рак яичников занимает седьмое место по частоте, составляя 4-6%.
По данным Международного агентства по изучению рака ежегодно в мире регистрируется более 165 000 новых случаев рака яичников, и более 100 тыс. женщин погибают от злокачественных новообразования яичников. Если удельный вес (%) рака яичников в онкологической заболеваемости женщин во всех странах мира примерно одинаков, то частота заболеваемости на 100000 женского населения (%ооо) значительно варьирует. В Европе, особенно в Северных странах и Великобритании, а также в Северной Америке, стандартизованные показатели заболеваемости наиболее высокие (10 и более на 100 000). В Центральной и Южной Америке, Африке и Азии, включая индустриальные страны, такие как Япония, но исключая Израиль, эти показатели значительно ниже (7 и менее на 100 000). За последние 20 лет уровни заболеваемости раком яичников в большинстве стран с высоким риском (Скандинавия, Великобритания, США, Канада) остаются стабильными и даже несколько снижаются. В то же время отмечено повышение заболеваемости в странах с низким риском, таких как Япония, Индия, Сингапур, а также в некоторых странах Южной и Восточной Европы (Португалия, Испания, Югославия, Польша).
В России ежегодно рак яичников выявляется более чем у 11 000 женщин (10, 17 на 100 000), занимая седьмое место в структуре общей онкологической заболеваемости (5%) и третье — среди гинекологических опухолей после рака тела и шейки матки [2]. За последние 10 лет в стране произошел прирост заболевания на 8, 5%.
По показателям смертности рак яичника опережает рак тела и шейки матки, занимая 5-е место среди причин смерти от всех опухолей у женщин. В большинстве индустриальных стран мира рак яичников имеет самые высокие показатели смертности среди всех гинекологических опухолей, что связано с поздней диагностикой заболевания. Летальность больных раком яичников на первом году после установления диагноза составляет 35%. По сводным данным популяционных раковых регистров стран Европы, однолетняя выживаемость больных раком яичников составляет 63%, трехлетняя — 41%, пятилетняя — 35%. За последнее десятилетие отмеченное в Европе увеличение пятилетней выживаемости больных злокачественными опухолями яичников на 3% (с 32% до 35%), а в США — на 4% (с 36% до 39%) объясняется не столько улучшением диагностики, сколько эффективным применением платиновой химиотерапии в лечении диссеминированных форм рака яичников и герминогенных опухолей. Риск заболеть раком яичника на протяжении жизни составляет 1,5%, и 1 из 100 женщин может умереть от этого заболевания [2].
Затрудненность ранней диагностики, быстрый рост, раннее имплантационное метастазирование по серозным оболочкам малого таза и брюшной полости, неудовлетворительные результаты лечения распространенных форм - все это дает основание считать рак яичников одной из наиболее злокачественных опухолей с крайне неблагоприятным прогнозом.
Заболеваемость раком яичников высока в индустриально развитых странах. Даже при высоком уровне медицинской помощи рак яичников в 65 -80% случаев распознается в III - IV стадиях.
Общепринятой гистологической классификацией опухолей яичников является классификация ВОЗ (1992 г.).
Для опухолей, не относящихся к эпителиальным, существуют существенные отличия, как в плане тактики лечения, так и в отношении прогноза. Прогноз, как правило, более благоприятен, чем для собственно рака яичников. В структуре эпителиальных злокачественных опухолей 42% составляют серозные карциномы, 15% - муцинозные, 15% -эндометриоидные и 17% - недифференцированные. Прогностическая значимость гистотипа опухоли в случаях распространенного рака яичников на сегодня остается предметом дискуссии. Для раннего рака яичников наименее благоприятным в плане прогноза является светлоклеточный гистотип. Низкая степень дифференцировки опухоли - неблагоприятный прогностический фактор. Однако и в данном случае речь идет в первую очередь о ранних стадиях рака яичников.
Методы исследования
Исследуемый материал большей частью был получен из архива патологоанатомической лаборатории НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова и представлял собой срезы парафиновых блоков удаленных опухолей больных РЯ в период с 1990 по 2006 годы. Другая часть материала была получена из цитологических препаратов больных РЯ, находившихся на лечении в гинекологическом отделении клиники НИИ онкологии им. Н.Н.Петрова в 2005 - 2007 гг., приготовленных из асцитической жидкости - пациентки подвергались лапароцентезу как в лечебных, так и в диагностических целях.
Материалом для исследования служили архивные патоморфологические препараты, полученные из удалённых в ходе операции опухолевых тканей пациенток. Под контролем световой микроскопии, при помощи санного электронного микротома были выполнены срезы ткани вне опухоли с 206 парафиновых толщиной 20 мкм. С целью депарафинизации дважды проводилась инкубация срезов в ксилоле (500 мкл) при комнатной температуре, а затем промывка образцов один раз - в 96% этаноле (20-30 мин). Тканевой лизис осуществлялся путем добавления 200 мкл лизирующего буфера: 1хТЕ (10 ммоль Tris-HCl (рН=8,0)), 0,1 ммоль ЭДТА, также 2% натрия додецилсульфата и 3,5 мкл протеинкиназы К, а затем инкубации образцов при 60 градусах по Цельсию. Реакция продолжалась 16-20 часов до полного растворения ткани. Далее лизат очищался путем добавления 200 мкл нейтрального фенола и 60 мкл смеси хлороформ-изоамилового спирта, с последующим центрифугированием в течение 30 минут. В очищенный тканевой лизат, составляющий верхнюю фазу, добавлялся хлороформ (60 мкл). Повторно проводилось центрифугирование, вновь собиралась верхняя часть раствора и переносилась в чистые пробирки. После добавления 1/10 объема натрия ацетата, 1 объема изопропанола и 1 мкл гликогена тканевой лизат осаждался при -20 градусах по Цельсию в течение 2-4 часов. Осадок, полученный после центрифугирования, растворяли в 100 мкл дистиллированной воды при 60 градусах по Цельсию.
Анализ мутаций BRCA1 5382 ins С, BRCA1 4153 del A, BRCA2 6174delT, BRCA1 185delAG проводился методом аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени (iCycler iQ5 Real Time Detection System (Bio-Rad), DTprime (ДНК-технология)). Объем реакционной смеси во всех случаях составлял 20 мкл и содержал 1 мкл ДНК-лизата, 10 мкл 2,5-кратный ПЦР-буфер, 280 мкМ дЦТФ 280мкМдТТФ 280мкМдГТФ 280мкМдАТФ , 2 ЕД Taq-полимеразы, 2мкМ каждого праймера. В качества красителя использовался SYBR Green. Для детекции перечисленных выше мутаций применяли следующие параметры и праймеры изготовленные промышленным способом фирмой Синто л (г. Москва) (Таблица 4).
Учет результатов производился при помощи оценки графиков амплификации и кривой плавления. На графике 1 показана кинетическая кривая ПЦР в координатах "уровень флуоресценции - цикл амплификации" при отсутствии мутации в гене BRCA1/2, а на графике 2 при обнаружении мутации.
Также выполняли анализ потери гетерозиготности (Loss of Heterozygosity (LOH)) в образцах ткани позитивных по BRCA1 и BRCA2 мутациям. Для этого опухолевые участки ткани были отделены от контаминирующих нормальных тканей посредством микродиссекции, а полученная ДНК использовалась для LOH- анализа. В качестве контроля конституционального ДНК использовались образцы тканей вне опухоли тех же пациенток. Статус гена BRCA1/2 в опухоли был оценен с помощью алелель - специфических олигонуклеотидов, специфичных к нормальной и мутантной последовательностям и общего олигонуклеотида методом аллель-специфической ПНР в режиме реального времени (амплификатор DTprime фирмы ДНК-технология (Россия)). О потере «дикого» или мутантного аллеля судили по разнице в кинетике амплификации с олигонуклеотидами, специфичными к соответствующему аллелю.
На рисунке 3 показана потеря гетерозиготности в образце с мутацией BRCAl 5382insC: выводы об утрате аллельных копий были сделаны на основании уменьшения числа продуктов ПНР (красная лунка -"дикий" аллель гена BRCA1, черная лунка - мутантный аллель). На рисунке 4 показаны кривые амплификации в координатах "уровень флуоресценции -цикл амплификации" при отсутствии потери аллельных копий нет снижения кинетики реакции. Для исключения возможных арте-фактов генотипирование каждой пары образцов про-водилось трехкратно с соблюдением принципа «слепого» контроля.
Сопоставление эффективности стандартных схем неоадъювантной химиотерапии у больных распространенным РЯ носительниц мутаций в гене BRCA1/2 и больных без мутаций
Хирургическую стадию определяли по FIGO (International Federation of Gynecology and Obstetrics) после анализа анамнеза и данных, полученных в ходе операции и патоморфологического исследования Показатели эффективности лечения устанавливали по Response Evaluation Criteria In Solid Tumors (RECIST) версия 1.1 . Диагностические мероприятия включали в себя инструментальные исследования - УЗИ органов брюшной полости и малого таза, компьютерная томография брюшной и грудной полости, магнитно-резонансное исследование органов малого таза с внутривенным контрастированием, рентгенограмму грудной клетки. Для исключения первично-множественных образования и исключения вторичного поражения яичников в диагностический минимум включали фиброгастроскопию, колоноскопию и маммографию. Онкомаркер СА-125 также использовали при оценке ответа на неоадъювантную химиотерапию. Опухолевые очаги, измеряемые в трех размерах, сравнивали до начала проведения химиотерапии и после каждого 2-го курса XT. За полный ответ принимали исчезновение всех измеряемых очагов; за неполный ответ - уменьшение на 30 % суммы наибольших диаметров измеряемых очагов; за прогрессирование заболевания - увеличение на 20 % суммы наибольших диаметров измеряемых очагов; стабилизация заболевания определялась как изменения, не соответствующие ни одному из перечисленных выше критериев. После проведения неоадъювантной химиотерапии пациентка обсуждалась на консилиуме с хирургами, где решался вопрос о возможности проведения циторедуктивной операции или продолжения XT.
Статистической обработке подвергались показатели ответа после предоперационной XT в группах сравнения, а также изучалась корреляция ПГ-статуса в опухолях носителей мутаций в гене BRCA с патоморфологическим ответом (% ). Для всех статистических анализов использовался пакет SPSS (версия 13).
Больные с неоперабельным распространенным РЯ, поступившие на лечение в НИИ онкологии, у которых диагноз был подтвержден морфологическим методом, направлялись на консультацию к онкологу-химиотерапевту. Выбор химиотерапии был большей частью эмпирическим -начинали неоадъювантную химиотерапию с " золотого стандарта" - это схема паклитаксел 175 мг/м + карбоплатин (6 AUC). каждые 3 недели, либо циклофосфамид 500 мг/м + доксорубицин 60 мг/м + цисплатин 50 мг/м с ежемесячной оценкой общего статуса шкале ECOG и шкале Карновского. Каждые 6 недель химиотерапии осуществляли оценку эффективности по шкале RECIST с решением вопроса о возможности выполнения хирургического этапа комбинированного лечения Обязательным условием включения пациентки в исследование стало добровольно подписанное информированное согласие на лечение, обследование и обработку персональных данных. Если химиотерапия признавалась не эффективной пациентка переводилась на вторую линию химиотерапии - это гемцитабин 1000 мг/м , либо 5-фторурацил 100 мг/м + метотрексат 60 мг/м + циклофосфамид 100 мг/м . Пациентки, предварительно тестированный на носительство мутаций в гене BRCA1/2, при обнаружении мутации Были включены в исследование и получали препарат Цисплатин (Cisplatin) в неоадъювантном режиме внутривенно в дозе 100 мг/м с предварительной гидратацией каждые 3 недели с ежемесячной оценкой общего статуса шкале ECOG и шкале Карновского. В зависимости от ответа на проводимую предоперационную XT пациентки получили от 1 до 9 циклов, в среднем 3 курса - для BRCA- позитивных больных 3.3, а для BRCA-негативных 3.0 (Таблица 3).
При оценке объема первичной циторедукции за оптимальную операцию принимали ту, при которой максимальные размеры оставшихся опухолевых образований не превышают 1 см; субоптимальной циторедукции соответствовал размер оставшейся опухоли 1-2 см. При размерах оставшихся опухолевых масс более 2 см объем операции считали неоптимальным. Для описания элементов остаточной опухоли по архивным протоколам операции заполнялась анкета (Рисунок 5), где учитывался показатель распространения опухли по париетальной и висцеральной брюшине, паренхиматозным органам. Перитонеалькарцинозный индекс (PCI) - полуколичественный показатель степени распространения поражений брюшины. Также учитывался объем выполненной циторедуктивной операции. Стандартной операцией при распространенном РЯ по-прежнему остается экстирпация матки с придатками с оментэктомией. Комбинированные хирургические вмешательства применялись в случае, если при расширении объема операции достигалась её оптимальность. Если в ходе хирургического вмешательства при ревизии органов брюшной полости и малого таза обнаруживался распространённый опухолевый процесс и коллегиально принимали решение о нецелесообразности выполнения циторедуктивной операции, тогда ограничивались выполнением диагностической операции с взятием биопсии.
Анализ результатов циторедуктивных операций у пациенток после проведенной неоадъювантной химиотерапии в группах сравнения
Идентификация генов BRCA1 и BRCA2 по праву считается главным достижением молекулярной онкологии в 90-х гг. XX века [20]. Ген BRCA1 был выделен в 1994 г. в области хромосомы 17q21, а спустя 2 года был клонирован второй ген - BRCA2 в области хромосомы 13ql2. К настоящему времени получена существенная информация о структуре и функции генов BRCA1 и BRCA2. В частности установлено, что эти гены участвуют в регуляции пролиферации клеток, стабильности хромосом и репарации молекулы ДНК посредством механизмов гомологичной рекомбинации [4]. Потеря такой роли вследствие инактивации гена может быть ключевым событием, приводящим к хромосомной нестабильности и злокачественной трансформации клетки. Установлено, что 10-15% случаев РЯ обусловлено наследственными мутациями в генах BRCA1/2 [8]. В настоящее время большинство авторов[8,9,12] пришли к заключению, кумулятивный риск развития РЯ у женщин-носительниц мутаций в гене BRCA1 составляет от 39-54%, а носительниц мутаций в гене BRCA2 от 10-22% [6], тогда как в общей популяции риск заболеть РМЖ и/или РЯ составляет 1.8 %.
Однако, большинство случаев РЯ не связано с наследственными мутациями. Безусловно, факторы внешней среды - основные этиологические детерминанты спорадического РЯ и других эпителиальных злокачественных опухолей у человека. Так, наивысшую заболеваемость отмечают в развитых странах, где, возможно, физические и химические факторы промышленности вызывают злокачественные заболевания. Однако до настоящего времени нет убедительных данных о специфическом влиянии диеты или других экологических составляющих на развитие РЯ.
Было замечено, что опухоль, которая развивается у носителей мутаций в гене BRCA1/2 демонстрирует чрезвычайно высокую чувствительность к широкому спектру современных химиопрепаратов, в часности препаратам плптины. Существует несколько механизмов обеспечивающих такую уникальную чувстрительность. Прежде всего речь идет о потери контроль над клеточным циклом репарации молекуля ДНК. Клетки с нарушенной функцией генов BRCA1/2 не способны восстанавливать разрывы двойной цепи ДНК и демонстрируют высокую чувствительность к препаратам платины, точкой приложения которых и является молекула ДНК опухолевых клеток. Таким образом, «недостаточные» функциональные возможности систем репарации в клетки опухоли могут служить поводом для выделения группы пациентов с повышенной чувствительностью к определенной цитостатической терапии. Однако, исследования Tassone Р и соавторов, Egawa С и соавторов указывают на различия между химиочувствительностью при изменении транскрипционной активности гена BRCA1 в спорадическом РЯ и полном «выключении» гена в случае наследственного РЯ. Таким образом, опухолевую клетку с дефицитной функцией гена BRCA можно рассматривать как исключительную цель для ДНК-повреждающих агентов. Прежде всего речь идет о доступных препаратах платины- Цисплатин, Карбоплатин. Современные исследования подтверждают эффективность использование и совершенно нового препарата PARB-ингибиторов у носителей мутаций, которые уже начинают использоваться в клинической работе. [56]
Концепция ДНК повреждающего препарата для опухоли с дефицитной функцией гена BRCA1/2 сводиться к тому, что большинство таких опухолей демонстрируют соматическую инактивацию оставшегося аллеля гена. Эта особенность предоставляет уникальное терапевтическое окно. Большинство нормальных клеток в организме BRCA-носителя сохраняют функцию гена, тогда как в опухолевых клетках оба аллеля гена повреждены, что определяет высокую чувствительность опухоли к ДНК-повреждающим агентам. Впервые феномен потери гетерозиготности был обнаружен в середине 90-х годов, когда был применен метод молекулярного анализа с использование микросателитных маркеров [16,58]. Однако было установлено что эпигенентическая инактивация функции гена BRCA1/2 также не редкое событие в эпителиальных опухолях яичников и встречается с частотой до 90% [44-46]. Однако нужно отметить, что в описанных работах использовался иммуногистохимический метод определения экспрессии гена. Что часто может давать завышенные результаты. Все же, суммируя множество литературных данных, приходиться признать, что в спорадическом рак частота инактивации в гене BRCA выше, но роль этого событии в канцерогенезе спорадических опухолей до конца неясна. Механизмов эпигенетической инактивации на сегодняшний день описано несколько и они включают в себя гиперметилирование (15-31 %) и феномен потери гетерозиготности в 60-75% случаев.
Настоящее исследование подтверждает, что соматическая инактивация одного аллеля гена BRCA1/2 коррелирует с как с клиническим так и патогенетическим ответом. Это исследование имеет некоторые ограничения. В частности, тестирование проводилось только по основным мутация в гене BRCA1 и BRCA2, определенными как славянские мутации.
Примечательно, что мутации в BRCA1 или BRCA2 наблюдаются не более чем в 20 30% семейных случаев РМЖ/РЯ. Первые данные о причастности генов BRCA1 и BRCA2 к возникновению РМЖ и РЯ были получены на пациентках, проживающих в Европе и Северной Америке. Оказалось, что спектр мутаций в этих генах исключительно широк. Это обстоятельство значительно затрудняет диагностику соответствующих нарушений нуклеотидной последовательности; действительно, полноценный анализ BRCA1 и BRCA2 включает в себя не только полное секвенирование всех кодирующих участков этих достаточно протяжённых генов, но и детекцию перестроек посредством метода MPLA (multiple ligation dependent probe amplification). Ещё в середине 1990 х гг. было обнаружено, что относительно небольшие, биологически изолированные народности характеризуются выраженным эффектом предшественника (founder effect) -пре обладанием т. н. повторяющихся мутаций в BRCA1 и BRCA2. Например, у евреев европейского происхождения (евреев Ашкенази) практически все повреждения генов BRCA1 и BRCA2 сводятся к мутациям BRCA1 185delAG, BRCA1 5382insC и BRCA2 6174delT, у жителей Исландии - к аллелю BRCA2 999del5. Особенности спектра мутаций в том или ином географическом регионе в значительной мере отражаются на организации диагностики наследственного РМЖ. В странах без выраженного эффекта предшественника генетическому анализу подвергаются преимущественно те случаи онкологического заболевания, при которых вероятность обнаружения мутаций достаточно высока, а именно пациентки с выраженным семейным онкологическим анализом и/или больные с первично множественными опухолями и/или молодые женщины с РМЖ или РЯ. Присутствие «эффекта предшественника» значительно упрощает процедуру тестирования ДНК, предоставляя возможность для про ведения широкомасштабных исследований, в частности для изучения вклада мутаций в генах наследственного рака в общую заболеваемость РМЖ и РЯ, а также анализа распространённости соответствующих генных дефектов у здоровых людей.
А это все говорит о том что нарастание чувствительности клетки к химиотерапии цисплатином можно ожидать в BRCA - дефицитных клетках опухоли [57]. BRCA участвует в восстановление молекулы ДНК через множество каскадов основные из них. Тем самым BRCA1 недостаточность становиться определяющим предиктивным фактором чувствительности опухоли к препаратам платины [56,58,59]
