Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Современные представления о канцерогенезе и опухолевой прогрессии 10
1.2. Молекулярно-биологические аспекты этиологии и прогноза рака молочной железы 22
1.3. Свободнорадикальные процессы и злокачественный рост 29
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 44
2.1. Характеристика больных и методов лечения 44
2.2. Подготовка материала исследования 46
2.3. Методы исследования 46
ГЛАВА 3. Исследование показателей свободнорадикального окисления, антиоксидантной системы и состояния плазматических мембран в крови больных местнораспространенным и генерализованным раком молочной железы 50
ГЛАВА 4. Оценка прогностической значимости исследования интенсивности хемилюминесценции, активности церулоплазмина и состояния мембран лимфоцитов и эритроцитов в крови больных раком молочной железы 64
ГЛАВА 5. Изучение показателей свободнорадикального окисления, антиоксидантной системы и состояния мембран лимфоцитов и эритроцитов в крови больных раком молочной железы с различной эффективностью химиотерапии на аутосредах 77
5.1. Исследование интенсивности хемилюминесценции, активности церулоплазмина и состояния мембран лимфоцитов и эритроцитов в крови больных раком молочной железы с различной эффективностью аутоплазмохимиотерапии 77
5.2. Исследование интенсивности хемилюминесценции, активности церулоплазмина и состояния мембран лимфоцитов и эритроцитов в крови больных раком молочной железы при аутомиелохимиотерапии 89
Заключение 97
Выводы 117
Практические рекомендации 118
Указатель литературы
- Современные представления о канцерогенезе и опухолевой прогрессии
- Исследование показателей свободнорадикального окисления, антиоксидантной системы и состояния плазматических мембран в крови больных местнораспространенным и генерализованным раком молочной железы
- Оценка прогностической значимости исследования интенсивности хемилюминесценции, активности церулоплазмина и состояния мембран лимфоцитов и эритроцитов в крови больных раком молочной железы
- Исследование интенсивности хемилюминесценции, активности церулоплазмина и состояния мембран лимфоцитов и эритроцитов в крови больных раком молочной железы с различной эффективностью аутоплазмохимиотерапии
Введение к работе
Актуальность работы. Заболеваемость и смертность от рака молочной железы (РМЖ) среди женского населения продолжают неуклонно расти как в нашей стране, так и за рубежом. В структуре заболеваемости злокачественными опухолями в мире РМЖ занимает третье место после рака легкого и рака желудка и составляет 10% от всех случаев онкопатологии. В России доля РМЖ среди злокачественных новообразований составляет 23% и имеет устойчивую тенденцию к увеличению, причем у 40-56% впервые зарегистрированных больных выявляются III-IV стадии опухолевого процесса. В структуре смертности от онкозаболеваний у женщин РМЖ составляет 13,7% (Заридає Д.Г., 2002; Ушакова Т.И. и соавт., 2002; Алясова А.В., 2004).
В связи с выше изложенным, весьма актуальными остаются ранняя диагностика РМЖ и выбор оптимальной тактики лечения данной категории больных. Для решения этих задач продолжается поиск, разработка и внедрение различных методов диагностики и прогноза, в том числе и биохимических, способных выявлять наличие и прогрессию опухолевого процесса и адекватно оценивать эффективность проведенной терапии.
Известно, что среди факторов риска развития злокачественных новообразований важная роль принадлежит нарушению равновесия в системе свободнорадикальное перекисное окисление липидов (ПОЛ) - антиоксидантная защита организма. При нарушении адекватного соотношения окислительных и антиокислительных процессов, несостоятельности антиоксидант-ных механизмов происходит избыточное накопление свободных радикалов, приводящее к повреждению нуклеиновых кислот, индукции хромосомных аберраций, нарушениям регуляции клеточной пролиферации и апоптоза, играющих важную роль в злокачественной трансформации клеток и опухолевой профессии (Савина Е.В. и соавт., 2001). Несомненная роль процессов ПОЛ при злокачественных новообразованиях подтверждена многочисленными исследованиями (Франциянц Е.М. и соавт., 1995; Пальмина Н.П., 2000;
Das U.N., 2002; Kohen R., Niska A., 2002; Ray G., Husain S.A., 2002). Это позволяет рассматривать опухолевую болезнь как одну из форм свободыоради-кальной патологии.
Имеющиеся в литературе сведения о состоянии системы ПОЛ у больных РМЖ достаточно противоречивы. Показано как усиление процессов ПОЛ (Сирота В.Г., 2000), так и отсутствие их достоверных изменений (Савина Е,В. и соавт., 2001), представлены так же доказательства снижения уровня ПОЛ у больных РМЖ (Корман Д.Б. и соавт., 1992; 1995; 1997). Неоднозначные данные о состоянии прооксидантных и антиоксидантных показателей могут быть связаны как с гетерогенностью опухолей, так и с фазностью изменения антиокислительной активности липидов в процессе развития злокачественного новообразования (Бурлакова Е.Б. и соавт., 1975; Барабой В.А., Орел В.Э., 1983; Зенков Н.К. и соавт., 2001).
Исходя из этого, важным представляется изучение показателей свободи орадикального окисления, антиоксидантной системы и тесно с ними связанного структурно-функционального состояния клеточных мембран в крови больных РМЖ с различной степенью выраженности патологического процесса и различной чувствительностью к проведенному химиотерапевти-ческому воздействию. Необходимость химиотерапии, как одного из компонентов лечения данной категории больных, на сегодняшний день не вызывает сомнений. С этих позиций большой интерес представляют разработанные академиком РАМН Ю.С. Сидоренко методы аутобиотерапии с использованием естественных сред организма и, в частности, методики аутоплазмо- и ау-томиелохимиотерапии. Опыт применения и дальнейшая разработка этих методов в лечении больных РМЖ доказывает их высокую эффективность, обеспечивает снижение токсичности, возможность преодоления множественной лекарственной резистентности, иммуномодулирующий эффект (Владимирова Л.Ю., 2000; Николаева Н.В., 2003).
7 Цель работы:
Определить биохимические показатели в крови больных РМЖ, отражающие степень распространенности опухолевого процесса и позволяющие объективно оценить эффективность проводимого химиотерапевтического воздействия.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Изучить особенности протекания свободнорадикального окисления, функционирования антиоксидантной системы и состояния клеточных мембран в крови больных с местнораспространенным и генерализованным РМЖ.
Изучить интенсивность хемилюминесценции плазмы крови, активность церулоплазмина и показатели структурно-функционального состояния мембран эритроцитов и лимфоцитов у больных РМЖ с различной эффективностью химиотерапии на аутосредах (аутоплазмохимиотерапия, ау-томиелохимиотерапия).
Разработать биохимический способ определения распространенности опухолевого процесса.
Разработать биохимический способ оценки эффективности противоопухолевого лечения в клинике.
Научная новизна работы:
Впервые на большом клиническом материале проведено комплексное исследование некоторых показателей свободнорадикальныного окисления, антиоксидантного статуса и структурного состояния клеточных мембран в крови больных РМЖ с различной распространенностью опухолевого процесса и эффективностью проведенной химиотерапии. Показано, что прогресси-рование злокачественного процесса у больных РМЖ характеризуется снижением уровня свободных радикалов на фоне увеличения оксидазной активности церулоплазмина и нарастанием мембранотоксических эффектов, прояв-
8 ляющихся в снижении текучести клеточных мембран, а также изменении полярности и погруженности белков в липидный матрикс. Впервые при применяемых в Ростовском научно-исследовательском онкологическом институте методах химиотерапии - аутплазмо- и аутомиелохимиотерапии установлены закономерности изменения уровня свободных радикалов и активности церулоплазмина в плазме крови, а также погруженности белков в липидный матрикс плазматических мембран лимфоцитов и эритроцитов и их текучести у больных РМЖ в зависимости от эффективности проведенного лечения. Показана прогностическая значимость исходного состояния процессов ПОЛ и структурной организации мембран клеток крови в плане оценки распространенности опухолевого процесса и результатов химиотерапии.
Практическая значимость исследования:
Выявленные на основе биохимических исследований в крови больных РМЖ прогностически значимые параметры состояния свободнорадикального окисления и структурно-метаболического статуса клеточных мембран позволяют разработать критерии для определения распространенности злокачественного процесса, способствующие индивидуализации лечения данной категории больных. На основании полученных данных предложены "Способ определения распространенности патологического процесса при онкологических заболеваниях" и "Способ прогнозирования эффективности лечения больных раком молочной железы ІІГ-IV стадий". Использование способов будет способствовать раннему выявлению генерализации опухолевого процесса, улучшению контроля за проводимой химиотерапией, что позволит планировать необходимую тактику лечения больным РМЖ.
На защиту выносятся следующие положения:
1. Увеличение распространенности опухолевого процесса при РМЖ сопровождается снижением интенсивности свободнорадикальных процессов
на фоне увеличения активности изученных компонентов антиоксидантной системы и нарушением структурно-функционального состояния клеточных мембран,
2. Нормализация показателей структурно-функциональной целостности мембран форменных элементов крови и значительная коррекция соотношения свободнорадикальных процессов и антиоксидантной активности являются одним из механизмов реализации клинического эффекта при проведении химиотерапии на аутосредах — аутоплазмо- и аутомиелохимиотерапии.
Современные представления о канцерогенезе и опухолевой прогрессии
Исследование интенсивности хемилюминесценции, активности церулоплазмина и состояния мембран лимфоцитов и эритроцитов в крови больных раком молочной железы с различной эффективностью аутоплазмохимиотерапии
В настоящее время в России, как и в большинстве развитых стран мира, отмечается тенденция к неуклонному росту заболеваемости злокачественными новообразованиями и смертности от них. Согласно данным В.И. Чиссова и соавт. (1998), за период с 1988 по 1998 г. количество больных с впервые в жизни установленным диагнозом злокачественной опухоли в Российской Федерации увеличилось на 13,7%, при этом среди мужчин на 10,6%, среди женщин на 13,5%. В структуре смертности населения земли смертность от онкопатологий занимает второе — четвертое место, в РФ в 1994 г. оказалась на третьем месте и составила 14%.
В связи с вышеизложенным, к одной из первоочередных задач здравоохранения отнесено изучение механизмов онкогенеза. За последние 10-15 лет получены результаты, позволяющие существенно расширить наши представления о механизмах возникновения и развития опухоли, охарактеризовать на молекулярном, биохимическом, клеточном, тканевом и организмен-ном уровнях различные этапы в развитии злокачественного новообразования (Якубовская Р.И., 2000).
Значительный прогресс в понимании механизмов канцерогенеза связан с открытием сначала онкогенов и протоонкогенов, а затем - опухолевых супрессоров и мутаторных генов. Онкогены - это клеточные или вирусные (вносимые вирусом в клетку) гены, экспрессия которых может привести к развитию новообразования. Протоонкогены - нормальные клеточные гены, усиление или модификация функции которых превращает их в онкогены. Опухолевые супрессоры - (антионкогены, рецессивные опухолевые гены) -клеточные гены, инактивация которых резко увеличивает вероятность возникновения новообразований, а восстановление функции, наоборот, может подавить рост опухолевых клеток. Следует заметить, что причисляемые у опухолевым супрессорам так называемые «мутаторные» гены, т.е. гены, нарушение функции которых тем или иным способом увеличивает темп возникновения мутаций и/или других генетических изменений, могут и не влиять на рост неопластических клеток, однако их инактивация столь сильно увеличивает вероятность появления различных онкогенных мутаций, что образование опухоли становится лишь делом времени (Копнин Б.П., 2000).
Очевидное значение концепции онкогенов состоит в том, что она способствует унифицированному представлению о механизмах канцерогенеза в противоположность еще недавно существовавшим, не связанным друг с другом «теориям» вирусного, химического и физического канцерогенеза. Сегодня кажется несомненным, что этиологических факторов канцерогенеза может быть много, тогда как патогенез един - повреждение ДНК, Поражения ДНК происходят при химической нестабильности ДНК, спонтанных ошибках в процессах репликации и репарации ДНК, при образовании эндогенных реактивных альдегидов, активных форм кислорода и т. п. (Gupta R.C., Lutz W.K., 1999). Экзогенными источниками повреждения ДНК служат ионизирующее и ультрафиолетовое излучение - физический канцерогенез, природные изотопы и многочисленные генотоксические составляющие пищи и окружающей среды - химический канцерогенез, а также вирусная экспансия -вирусный канцерогенез (Птицина С.Н. и соавт., 2001; Ferguson L., 1999; Wang YJ. et al., 2001; Noshchenko A.G. et al., 2002). Получены данные, согласно которым метаболиты эстрогенов вызывают мутации в ДНК, инициирующие развитие рака. Высокий уровень эстрогенов коррелирует с частотой встречаемости рака молочной железы, легкого и толстой кишки среди женщин (Service R.F., 1998).
Вирусная этиология злокачественных новообразований изучена в настоящее время лучше всего, и теория вирусогенетического происхождения опухолей, предложенная в 1945 г. Л.А. Зильбером, нашла подтверждение в отношении определенных онкопатологий. Показано, что инфицирование Helicobacter pylori удваивает риск развития рака желудка (Schraub S., 1999); в 50% случаев рак печени связывают с вирусом гепатита В (Arbuthot P., Rew М., 2001); риск рака шейки матки, связанный с вирусом папилломы человека, отмечается в 85% случаев в развитых странах и в 91% случаев в развивающихся странах (Александрова Ю.Н. и соавт., 2001; Rolon P. A. et al., 2000); есть данные о роли вирусов группы герпеса (HHV 8 и вируса Эпштейна-Барр) в этиологии и патогенезе таких опухолей, как саркома Капоши, рак носоглотки, лимфома Беркита и В-клеточные лимфомы у больных с иммунодефицитом (Botella-Estrada R. et al., 1999); также известны вирусы Т-клеточного лейкоза взрослых (HTLVI) (Киселев Ф.Л., 2000). Механизм опухолевой конверсии под действием вирусов специфичен для каждого типа вируса, но, как правило, он связан с нарушением функций клеточных генов, участвующих в процессах деления и пролиферации клеток. Вирус является инициирующим фактором и для полного проявления онкогенного потенциала вирусных генов необходимы дополнительные генетические изменения в геноме инфицированной клетки, приводящие к формированию моноклональ-ной популяции клеток с неконтролируемой пролиферацией (Киселев Ф.Л., 2000;КицакЛ.Я.,2001).
Вирусные онкогены ответственны за очень небольшую часть неоплазм человека, поэтому внимание молекулярных онкологов главным образом сосредоточено на клеточных онкогенах. Для возникновения опухоли человека нужно в среднем около 10 изменений в различных онкогенах или ге-нах-супрессорах опухолей (теория многоступенчатого канцерогенеза). Обычно разные опухоли содержат разный набор измененных генов. Каждая опухоль имеет свой генетический портрет. Однако некоторые гены оказываются поврежденными особенно часто. Сюда относится опухолевый супрес-сор р53, поврежденный в 50% опухолей человека, и онкоген ras, активированный в 25% опухолей человека (Георгиев Г.П. и соавт., 2003).
Подавляющее большинство известных протоонкогенов и опухолевых супрессоров являются компонентами нескольких сигнальных путей, контролирующих клеточный цикл, апоптоз, целостность генома, морфогенетиче 13 ские реакции и дифференцировку клеток (Копнин Б.П., 2000). Так, продукт гена-супрессора злокачественного роста р53 индуцируется в ответ на различные стрессовые воздействия, способные привести к появлению в организме наследственно измененных патологических клеток, и является важным звеном в процессе запуска механизма апоптоза, который обеспечивает удаление из организма таких потенциально опасных клеток (Чумаков П.М., 1998; Cetin-Atalay R., Ozturk М., 2000). Протоонкоген ras - один из ключевых компонентов пути передачи внеклеточных сигналов в ядро клетки, контролирующий несколько сигнальных каскадов, результатом конститутивной или временной активации которых могут быть пролиферация клеток, их опухолевая трансформация, апоптоз или предотвращение апоптоза, дифференциров-ка. Это зависит от характера сигнала, от того какой именно каскад активируется, от фенотипа клеток (Лянгузова М.С. и соавт., 2001).
Исследование показателей свободнорадикального окисления, антиоксидантной системы и состояния плазматических мембран в крови больных местнораспространенным и генерализованным раком молочной железы
В данном разделе работы нам представлялось интересным исследовать ряд показателей, характеризующих уровень свободнорадикальных процессов, активность антиоксидантной системы и состояние плазматических мембран клеток крови больных местнораспространенным и генерализованным РМЖ для выявления возможной зависимости изучаемых показателей от степени распространенности злокачественного процесса.
В этой связи были обследованы 24 больные местнораспространенным РМЖ (T2-4N1.2 М0-ь где Mi - метастазы в надключичные лимфоузлы на стороне поражения) в возрасте от 32-68 лет и 15 больных генерализованным РМЖ (ТЛЮбое NjuosoeMi) в возрасте от 48-68 лет. Полученные данные сравнивали с соответствующими показателями у 20 женщин без онкопатологии, сопоставимых по возрасту с обследованными больными, которые составили группу "условно здоровых".
Об интенсивности свободнорадикальных процессов в крови больных РМЖ мы судили по изменению светосуммы хемилюминесценции плазмы крови в системе перекись водорода - люминол и накоплению молекулярного продукта ПОЛ - МДА в плазме и эритроцитах периферической крови.
Как видно из таблицы 2 в обеих группах больных РМЖ имел место сниженный уровень светосуммы хемилюминесценции по сравнению со значением у здоровых женщин - на 30,5% у больных с местнораспространенным процессом и на 56,1% у больных с генерализованным процессом, при этом интенсивность хемилюминесценции в группе с генерализованным РМЖ была достоверно ниже - на 37,7%, чем в группе с местнораспростра-ненной формой заболевания. Содержание МДА в плазме крови больных ге 51 нерализованным РМЖ было на 11,6% ниже, чем у больных местнораспрост-раненным РМЖ и достоверно не отличалось от уровня у здоровых женщин, тогда как при местнораспространенном процессе этот показатель превышал норму на 23,4%. Достоверных изменений содержания МДА в эритроцитах в исследуемых группах выявлено не было.
В литературе последних лет достаточно много внимания уделено изучению ХЛ при новообразованиях, однако акцент смещен в сторону экспериментальных исследований. Так, в первых работах по биохемилюминес-цесции тканей экспериментальных опухолей (саркоса С-45, саркома Йенсе-на, карцинома Уокера) показано, что интенсивность их свечения ниже, чем нормальных тканей, и зависит от объема опухоли (Сидорик Е.П. и соавт., 1989). На модели химического канцерогенеза, индуцированного N-нитрозодиэтиламином, показано, что в период формирования и роста опухолевых узлов в печени крыс (4-5 месяц после введения канцерогена) интенсивность ХЛ в гомогенатах снижалась в 6 раз по сравнению с показателями контрольных животных (Сидорик Е.П. и соав., 1989). При изучении влияния опухолевого роста на интенсивность спонтанной ХЛ на модели карциномы Герена авторы показали, что уровень спонтанной ХЛ гомогенатов тканей изменяется стадийно: на ранних этапах опухолевого роста радикальные процессы преобладают над таковыми в норме, в то время как на последующих стадиях они ослабевают и становятся меньше нормы (Бабенко Г.А. и соавт., 1983). В работе И.Н. Алимовой (2002) показано.что для трансгенных мышей HER-2/neu с высокой частотой РМЖ характерен более низкий уровень люминолзависимой ХЛ сыворотки крови в сопоставлении с уровнем у мышей низкораковой линии СВА.
Данные литературы об исследовании ХЛ у больных РМЖ немногочисленны. I. Popov et al, (2001) приводят данные о повышенном уровне пе-рекись-индуцированной ХЛ в плазме и эритроцитах больных РМЖ по сравнению со здоровыми донорами и предлагают использовать данные показатели в качестве параметров окислительной модификации компонентов крови. В работе ЕЛ. Сидорик и соавт. (1989) показано снижение в 2 раза НгСЬ-РеБСЦ-зависимой ХЛ плазмы крови у больных РМЖ по сравнению с нормой. В исследованиях проведенных в РНИОИ (Горошинская И.А. и соавт., 2001; Ровда Т.А., 2001), указывается на снижение уровня перекись-люминолзави симой ХЛ плазмы крови онкологических больных и больных РМЖ в том числе.
Таким образом, имеющиеся в литературе сведения о динамике ХЛ у больных РМЖ весьма противоречивы, однако данные экспериментальных исследований свидетельствуют о связи уровня ХЛ с течением опухолевого процесса, причем наиболее значительные изменения интенсивности свечения происходят в период наиболее быстрого роста новообразований.
Результаты исследований интенсивности ПОЛ у больных РМЖ в зависимости от распространенности процесса в целом не противоречат литературным данным. В работе Н. Alagol et al. (1999), показан низкий уровень МДА в плазме крови больных РМЖ на поздних стадиях заболевания. При исследовании содержания диеновых конъюгатов, гидроперекисей липидов, кетодиенов, сопряженных триенов, МДА и других ТБК-активных соединений А.Ф. Сафиуллиной (2002) в крови больных РМЖ была выявлена определенная закономерность: нарастание уровня изучаемых показателей ПОЛ от I стадии до Шб стадии рака, а у пациенток с IV стадией интенсивность ПОЛ вновь снижается, приближаясь к уровню больных I стадией. В серии работ, проведенных на большом контингенте больных РМЖ, отличающихся по распространенности процесса, операбельности и продолжительности жизни, при исследовании ненасыщенности липидов крови, которую рассматривают в качестве комплексного показателя интенсивности ПОЛ, показано нарастание уровня двойных связей в липидах плазмы и эритроцитов по мере развития злокачественного процесса и 10-кратное увеличение ненасыщенности липидов плазмы у больных неоперабельным РМЖ, указывающее на снижение ПОЛ у больных РМЖ при прогрессировании заболевания (Корман Д.Б. и соавт., 1992; 1995; 1997).
Интенсивность ПОЛ зависит от сбалансированности работы ферментативных и неферментативных систем, участвующих в инактивации АКМ. Ключевым ферментом антирадикальной защиты принято считать суперок-сиддисмутазу, ускоряющую реакцию спонтанной дисмутации 02 с образованием перекиси водорода. Как правило, СОД работает в комплексе с ферментами, разлагающими перекись водорода - каталазой и пероксидазой. Существенный вклад в общий антиоксидантный потенциал крови вносит церулоплазмин - белок внеклеточных жидкостей млекопитающих, связывающий в сыворотке крови до 96% меди. Помимо основной медь транспортной функции, он обладает рядом ферментативных активностей: ферро-ксидазной, супероксиддисмутирующей, оксидазной, полиаминоксидазной. Считается, что в сыворотке крови церулоплазмин совместно с трансферри-ном образуют антиоксидазную систему, регулирующую концентрацию восстановленных ионов железа, и суммарная антиокислительная активность сыворотки в отношении Fe -индуцированного ПОЛ в основном определяется содержанием в ней данных компонентов (Дремина Е.С. и соавт., 1993). Способность церулоплазмина окислять ионы Fe , а также ингибировать ОН-радикалы делает его наиболее эффективным сывороточным ингибитором АКМ, образующихся в реакции Фентона (Широкопалова А.В. и соавт., 1994; Atanasiu R.L. et al., 1998). По отношению к Ог церулоплазмин примерно на два порядка менее эффективен, чем СОД, однако в связи с тем, что содержание СОД в крови крайне мало, а церулоплазмина примерно на порядок выше, чем концентрация, вызывающая 50% ингибирование ПОЛ in vitro, главную антиоксидазную функцию крови связывают именно с церуло-плазмином (Погосян Г.Г., Налбандян P.M., 1983). Было обнаружено существенное различие в механизме взаимодействия О/ с СОД и церулоплазми-ном: при взаимодействии ЦП с Ог не образуется Н2О2 (Владимиров Ю.А. и соавт., 1991).
Оценка прогностической значимости исследования интенсивности хемилюминесценции, активности церулоплазмина и состояния мембран лимфоцитов и эритроцитов в крови больных раком молочной железы
Выявленные в предыдущей главе изменения позволили предположить, что отдельные из изученных нами показателей могут представлять интерес для оценки распространенности злокачественного процесса.
Проведенные ранее в РНИОИ исследования состояния свободнора-дикальных процессов у больных со злокачественными новообразованиями различной локализации показали, что изменения в плазме крови интенсивности хемилюминесценции в системе перекись водорода - люминол наибольшим образом согласуются со степенью распространенности опухолевого процесса (Ровда Т.А., 2001). Установлена достоверная корреляционная зависимость между свето суммой хемилюминесценции и активностью церу-лоплазмина в плазме крови онкологических больных - г= -0,635 (Горошин-ская И.А. и соавт., 2002).
Важную информацию о состоянии больного удается также получить при изучении структурно-функциональных свойств мембран лимфоцитов и эритроцитов как наиболее доступных для исследования и отражающих изменение во всем организме клеток. В предыдущей главе структурно-фнукциональные свойства клеточных мембран изучались методом люминесцентной микроскопии, однако спекгрофлуориметрический метод облада-ет более широкими возможностями и позволяет помимо текучести оценивать степень погруженности белков в липидный бислой (по тушению флуоресценции ароматических аминокислотных остатков), а также полярность гидрофобных участков мембран. Оценка погруженности белков в липидный матрикс позволяет судить об ассоциации белков с мембранами, а также об олигомеризации мембранных белков, одной из причин которой может быть их окислительная модификация. Полярность липидного би слоя отражает состояние гидрофобной фазы мембраны, уровень в ней гидрофильных кластеров, образующихся гидроперекисями (Добрецов Г.Е., 1989). В работе Т.А. Ровда (2001) были выявлены однонаправленные изменения текучести мембран как с помощью спектрофлуориметрического метода, так и метода флуоресцентной микроскопии, что позволило придти к заключению о равноценности обоих подходов к изучению структурно-функционального состояния мембран. Выбор метода оценки текучести зависит от стоящих задач и наличия той или иной аппаратуры.
В данном разделе работы у 65 больных РМЖ изучены интенсивность хемилюминесценции плазмы крови, активность церулоплазмина, и ряд структурных характеристик мембран лимфоцитов и эритроцитов (текучесть, полярность микроокружения и погруженность белков в липидный матрикс). Из обследованных больных 38 имели III стадию заболевания и 27 - IV стадию. В качестве группы сравнения использовали соответствующие биохимические показатели, исследованные у 20 здоровых женщин.
Как видно из таблицы 5, у больных РМЖ (в целом по группе) выявлены снижение интенсивности хемилюминесценции на 37,6% и увеличение активности церулоплазмина на 56,6% по сравнению с соответствующими показателями у доноров. Таблица 5 Интенсивность хемилюминесценции и активность церулоплазмина в плазме крови больных РМЖ Группы Церулоплазмин мкМ/л Хемилюминесценция имп./б сек. Кхл/цп Доноры п=20 0,710±0,035 3054±368 4301±417 Больные РМЖп=65 1Д12±0,067 р 0,001 1905±149 р 0,01 1859±137 р 0,001
Примечание: р — достоверность различий по сравнению с донорами. Сниженный уровень свободных радикалов, обусловливающий более низкую интенсивность хемилюминесценции, на фоне активации оксидазной способности церулоплазмина является подтверждением высказанного ранее предположения (Ровда т.А., 2001), что одной из причин снижения интенсивности хемилюминесценции плазмы крови у онкологических больных может быть нейтрализация свободных радикалов этим белком, являющимся наиболее эффективным сывороточным ингибитором активных форм кислорода (Зенков Н.К. и соавт., 2001). Увеличение активности церулоплазмина у больных РМЖ показано и в других работах (Ровда Т.А., 2001; Vaidya S.M., Kamalakar P.L., 1998). Полученные нами результаты согласуются с данными Н.А. Добротиной и соавт. (1999), показавших на модельной системе ингиби-рующее действие низких концентраций (до 200 мкг/мл) препарата ЦП на процессы ПОЛ в плазме крови здоровых доноров, что проявлялось в снижении хемилюминесценции.
Текучесть мембран лимфоцитов у большинства обследованных больных РМЖ была ниже нормы, в среднем на 25% в зоне белок-липидных контактов и на 20% в липидном би слое. В эритроцитах снижение текучести мембран в зоне белок-липидных контактов составляло 24%, в липидном бислое наблюдалась тенденция к снижению. Погруженность белков в ли-пидный матрикс превышала уровень у женщин без онкопатологии как в лимфоцитах — на 30,3%, так и в эритроцитах — на 88,2%. Полярность мембран в лимфоцитах больных была выше нормы на 7,5%, а в эритроцитах, напротив, - на 9,9% ниже (табл. 6). Полученные нами данные согласуются с результатами проведенных ранее в РНИОИ исследований структурно-функциональных свойств мембран клеток крови, показавших, что для больных со злокачественными опухолями разных локализаций (рак яичника, желудка, мочевого пузыря, неходжкинские лимфомы, рак молочной железы) характерно снижение текучести мембран лимфоцитов и эритроцитов, сопровождающееся в большинстве случаев увеличением погруженности белков в липидный матрикс (Горошинская И.А. и соавт,, 2001; Ровда Т.А., 2001).
Данные литературы также свидетельствуют о выраженных нарушениях структурно-метаболического статуса эритроцитов у онкологических больных, одним из проявлений которых служит увеличение вязкости ли-пидного бислоя мембран клеток в целом, в том числе в области белок-липидных контактов (Новицкий В.В. и соавт., 2000).
При анализе изучаемых показателей была обнаружена их разнородность среди исследуемого контингента больных РМЖ, Полученные данные позволили выделить три группы. В первую группу вошли 32 женщины с ме-стнораспространенным процессом, III стадия (Тз Nj.; Mo). Во вторую промежуточную группу вошли 16 больных с IV стадией процесса - Т4 Nj.2 Mj, где Mi - метастазы в надключичные лимфоузлы на стороне поражения. Третью группу составили 17 женщин с IV стадией заболевания и наличием отдаленных метастазов в кости, печень, легкие, плевру, мягкие ткани и массивным поражением отдаленных лимфоузлов (Т4 N Mi). Результаты исследования биохимических показателей в зависимости от распространенности заболевания представлены в таблицах 7, 8, 9 и на рисунках 4, 5, 6.
Для больных первой группы было характерно достоверное снижение текучести мембран как лимфоцитов, так и эритроцитов по сравнению с лицами без онкопатологии, в лимфоцитах на 17,8% в липидном бислое и на 19,4% в зоне белок-липидных контактов, а в эритроцитах - на 9,6% и 24,9% соответственно. Отмечалось увеличение погруженности белков на 30,3% в лимфоцитах и на 73,5% в эритроцитах. Активность церулоплазмина возросла на 39,0%о по сравнению с донорами, при этом достоверного снижения интенсивности хемилюминесценции не наблюдалось.
У больных второй группы выявлено достоверное снижение текучести в лимфоцитах на 25,5% в зоне белок-липидных контактов, 18,2% в липидном бислое и на 29,1% в зоне белок-липидных контактов эритроцитов; увеличение погруженности на 85,3% в эритроцитах и на 25,7% в лимфоцитах (тенденция к достоверности) по сравнению с нормой.
Исследование интенсивности хемилюминесценции, активности церулоплазмина и состояния мембран лимфоцитов и эритроцитов в крови больных раком молочной железы с различной эффективностью аутоплазмохимиотерапии
В данной главе представлены результаты исследования ряда показателей, характеризующих уровень свободнорадикальных процессов, активность антиоксидантной системы и непосредственно связанное с ними состояние мембран у больных РМЖ с целью их возможного использования для оценки эффективности аутоплазмохимиотерапии (АПХТ).
Нами изучены текучесть мембран лимфоцитов и эритроцитов в зоне белок-липидных контактов и липидного бислоя, полярность и погруженность белков в липидный матрикс клеточных мембран, а также интенсивность хемилюминесценции и активность церулоплазмина в плазме крови до и после первого курса АПХТ. Проведен анализ динамики исследованных показателей в зависимости от эффективности проведенной химиотерапии.
В главе представлены данные, полученные при обследовании и лечении 48 больных РМЖ, из которых у 36 женщин был местнораспространен-ный процесс (Т2_4 N Mo), а у 12 - РМЖ с отдаленными метастазами в большинстве случаев в кости и печень (Т4 Nb2 М).
Оценка эффективности лечения проводилась через 2 недели после окончания курса химиотерапии согласно критериям ВОЗ по стандартизации оценки результатов лечения. По результатам эффективности химиотерапии больные, вошедшие в это исследование, оказались разделенными на 3 груп 78 пы. В первую группу вошли 13 больных с полной регрессией опухолевых проявлений, во вторую - 23 больные с частичной регрессией опухоли, в третью - 12 пациенток со стабилизацией заболевания.
Полученные данные биохимических исследований представлены в таблицах 10, 11,12 и на рисунках 7, 8, 9.
У больных с полной регрессией опухоли мембраны лимфоцитов до лечения характеризовались следующими особенностями: текучесть была снижена в зоне белок-липидных контактов на 36,2%, в липидном бислое на 16,1%, погруженность белков в липидный матрикс увеличена на 82,6%, полярность мембран не отличалась от уровня здоровых женщин. В эритроцитах изменения структурных показателей мембран имели ту же направленность: текучесть снижена, но в меньшей степени, чем в лимфоцитах (на 21,8% в зоне белок-липидных контактов, в липидном бислое - недостоверно), погруженность белков увеличена на 102,9%. Достоверно сниженной на 8,9% оказалась и полярность мембран в эритроцитах. Активность церуло-плазмина была выше контрольных величин на 52,8%, а интенсивность хе-милюминесценции и отношение интенсивности хемилюминесценции к активности церулоплазмина (коэффициент ХЛ/ЦП) - изначально снижены на 65,3% и на 74,0% соответственно.
Обследование больных с полной регрессией через 3 недели после окончания курса химиотерапии выявило нормализацию большинства изученных показателей. Текучесть мембран увеличилась по сравнению с уровнем до лечения: в лимфоцитах в зоне белок-липидных контактов на 47,3%, в липидном бислое на 9,0%, в эритроцитах на 24,0% и 16,6% соответственно. Погруженность белков в липидный матрикс снизилась на 48,7% в лимфоцитах и на 31,9% в эритроцитах. Все показатели, как текучести, так и погруженности в данной группе больных после АГГХТ достоверно не отличались от нормы. Полярность мембран лимфоцитов незначительно увеличилась и стала достоверно выше уровня у здоровых женщин на 6,3%, в эритроцитах осталась ниже нормы на 7,8%. Интенсивность хемилюминесценции увеличи 19 лась на 187,0%, достигнув уровня доноров. Активность церулоплазмина не изменилась. Коэффициент ХЛ/ЦП увеличился на 175,8% и оказался лишь на 28,2% ниже, чем у здоровых женщин.
В группе больных с частичной регрессией также имело место снижение текучести мембран клеток крови до начала лечения. В лимфоцитах снижение составляло 22,6% в зоне белок-липидных контактов и 23,7% в липидном бислое, в эритроцитах — 32,2% и 8,8% соответственно. Увеличение погруженности белков в липидный матрикс выявлено только в эритроцитах -на 91,2%. Полярность мембран была увеличена в лимфоцитах на 9,2% и снижена в эритроцитах на 10,5%. Интенсивность хемилюминесценции оказалась сниженной на 27,3%, но достоверно не отличалась от нормы, активность це-рулоплазмина увеличена на 69,2%, коэффициент ХЛ/ЦП снижен на 52,3%. После АПХТ большинство исследованных показателей не отличались от фоновых значений, только полярность мембран эритроцитов достоверно возросла на 4,8%, но оставалась ниже нормы. Текучесть мембран была по-прежнему сниженной: в лимфоцитах на 30,1%, в эритроцитах в зоне белок-липидных контактов на 36,5% и в липидном бислое на 12,1% по сравнению с соответствующими показателями у здоровых женщин. Погруженность белков в лимфоцитах, как и до лечения, была в пределах нормы, а в эритроцитах осталась на прежнем повышенном уровне. Активность церулоплазмина была повышена на 87,3%, коэффициент ХЛ/ЦП снижен на 54,4% по сравнению с соответствующими значениями у женщин без онкопатологии, а интенсивность хемилюминесценции не отличалась от нормы.
В группе больных со стабилизацией процесса до лечения изменений текучести мембран не выявлено. Погруженность белков в липидный матрикс в лимфоцитах достоверно не отличалась от нормы, а в эритроцитах была увеличена вдвое. Полярность мембран увеличена на 7,3% в лимфоцитах и снижена на 16,4% в эритроцитах. Активность церулоплазмина увеличена на 69,0%, интенсивность хемилюминесценции и коэффициент ХЛ/ЦП ниже уровня доноров на 32,9% и 60,0% соответственно. После химиотерапии в данной группе больных наблюдали снижение текучести мембран. Эти изменения были более выражены в зоне белок-липидных контактов лимфоцитов - достоверно ниже фоновых значений и уровня доноров « на 36%. В липид 83 ном бислое лимфоцитов и в соответствующих зонах эритроцитов снижение показателей по сравнению с фоном (на 11-15%) было статистически не достоверным, но значимым (на 23-24%) по сравнению с нормой. Полярность мембран эритроцитов увеличилась на 13,0%, погруженность белков не изменилась. Интенсивность хемилюминесценции осталась сниженной (на 39,8% ниже нормы). Активность церулоплазмина увеличилась у большинства обследованных больных по сравнению с фоновыми значениями (р 0,05 по критерию Вилкоксона), превосходя норму на 119,7%, что привело к дальнейшему снижению коэффициента ХЛ/ЦП - на 69,1% по сравнению с донорскими величинами.
