Содержание к диссертации
Введение
Часть I. Обзор литературы 7
Классификация противоопухолевых вакцин 8
Классификация опухолевых антигенов 12
Характеристика дендритных клеток 16
Противоопухолевые вакцины на основе дендритных клеток 22
Способы культивирования дендритных клеток 27
Клиническое применение дендритных клеток в онкологии 29
Часть II. Собственные исследования
Глава 1. Материалы и методы исследования
1.1 Материалы и реактивы 35
1.2 Оборудование 36
1.3 Методы исследования 37
Глава 2. Результаты и их обсуждение
2.1 Культивирование дендритных клеток 45
2.2 Сравнение дендритных клеток доноров и онкологических больных 56
2.3 Получение дендритных клеток из мононуклеаров периферической крови после криоконсервации 61
2.4 Захват экзогенных антигенов дендритными клетками 64
2.5 Влияние опухолевого, лизата на дендритные клетки 69
2.6 Исследование жизнеспособности дендритных клеток 72
2.7 Вакцинотерапия больных меланомой 76
2.8 Определение иммунного ответа больных меланомой на
проводимую вакцинотерапию 82
Заключение 87
Выводы 91
Список литературы 92
- Характеристика дендритных клеток
- Клиническое применение дендритных клеток в онкологии
- Методы исследования
- Получение дендритных клеток из мононуклеаров периферической крови после криоконсервации
Характеристика дендритных клеток
После введения антигена в организм он должен быть захвачен антиген-презентирующими клетками (АПК), процессирован и представлен в виде пептидных фрагментов в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС). Главным недостатком данного подхода является то, что введенные опухолевые антигены преимущественно захватываются макрофагами и клетками Лангерганса, что в конечном итоге приводит к развитию гуморального ответа (90). В случае применения антигенных пептидов захват и переработка не требуются, так как пептиды способны непосредственно взаимодействовать с соответствующими аллельными формами МНС на поверхности клеток самого больного, и, таким образом, -_. —быть-представленными-Т-лимфоцитам (141). Тем-не менее, использование-антигенных пептидов сопряжено с рядом проблем. Так, для нормальной активации Т-лимфоцитов, помимо взаимодействия Т-клеточного рецептора со специфической пептидной последовательностью антигена, представленного молекулами МНС, необходима костимуляция, которая осуществляется за счет молекул CD80 и CD86. Костимулирующие молекулы экспрессируются в основном на АПК, при этом в большей степени на зрелых дендритных клетках (134). В связи с этим для генерации адекватного иммунного ответа в месте введения антигенных пептидов должны находиться в достаточно большом количестве АПК. Без соблюдения этого условия использование пептидов может приводить к генерации слабого иммунного ответа или даже к анергии (132, 133).
Введение нагруженных дендритных клеток позволяет избежать всех сложностей, описанных выше. Дендритные клетки можно нагружать как опухолевыми антигенами (лизатом) (28), так и антигенными пептидами (24). В первом случае нагружают незрелые ДК, которые способны захватывать экзогенные антигены, процессировать и представлять их пептидные фрагменты в комплексе с молекулами МНС, тогда как во втором случае антигенные пептиды нагружают на уже зрелые дендритные клетки.
По сути, введение убитых опухолевых клеток онкологическому больному схоже с введением опухолевых антигенов, так как предполагается, что после инъекции опухолевые клетки будут захвачены АПК, процессированы и представлены в виде антигенных пептидов в комплексе с молекулами МНС. В настоящее время в научных центрах мира проходят исследования по применению противоопухолевых вакцин на основе опухолевых клеток (91). Для генерации более мощного иммунологического ответа опухолевые клетки трансфецируют геном, который кодирует тот или иной цитокин, например гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) (118). Перед введением опухолевые клетки облучают, чтобы они не пролиферировали, тем не менее, в них проходят жизненно важные процессы, в том числе и синтез белка, а значит и соответствующего цитокина, который определенным образом должен активировать иммуннокомпетентные клетки. В основном при создании подобного рода вакцин используют аллогенные опухолевые клетки, т.к. создание аутологичной вакцины сопряжено с рядом трудностей. Во-первых, не всегда удается из опухолевого материала больного получить клеточную линию, а во-вторых, время получения опухолевой культуры занимает, как правило, несколько месяцев, не говоря уже о трудностях в трансфекции и отборе клонов с наибольшим уровнем синтеза цитокина. При использовании аллогенной вакцины решается проблема со временем и трудностью получения клеточной линии, но появляется проблема отторжения трансплантата и выработки трансплантационного иммунитета. Так как при вакцинотерапии необходимо многократное введение опухолевых клеток, то каждое очередное введение будет стимулировать не противоопухолевый, а трансплантационный иммунитет. Возможным решением данной проблемы может быть использование набора опухолевых клеточных. линий, то есть вначале вводится одна опухолевая линия, в. следующий раз другая и т.д. Но, пожалуй, самый главный вопрос это - адекватность использования аллогенных опухолевых клеток для лечения или профилактики рецидивов онкологических заболеваний. Известно, что опухоль одного и того, же гистогенеза у одного больного будет отличаться от опухоли другого больного по спектру экспрессируемых опухолевых антигенов. Безусловно, при подборе опухолевых, клеточных линий для создания вакцины отбирают те линии, которые экспрессируют наибольшее количество известных опухолевых антигенов. Но встает вопрос, а, сколько еще антигенов; остается не идентифицированными? Таким образом, эффективность лечения, при прочих равных условиях, будет зависеть от степени перекрывания опухолевых антигенов, экспрессирующихся на вводимой клеточной линии и опухоли самого больного.
Введение генетической конструкции, кодирующей тот или иной опухолевый антиген, в клинике широко не применяется (36).. Тем не менее, суть этого метода заключается в следующем: после попадания гена в составе вирусного вектора в клетку происходит синтез белка, в данном случае опухолевого антигена, и его пептидные фрагменты будут представлены в комплексе с молекулами МНС I класса, как это бывает со всеми белками, синтез которых идет в клетке. Введение генетической конструкции можно осуществлять непосредственно в_ткань_ пациента, например в мышцу, или в культуру дендритных клеток. Для развития клеточного иммунного ответа на опухолевый антиген, помимо представления пептидной последовательности в . комплексе с молекулами МНС, необходимы костимулирующие сигналы и участие интерлейкина-12 (ИЛ-12) (116). Мышечная ткань не может обеспечить эти условия, в связи с этим развитие иммунологических реакций на опухолевые антигены, после введения соответствующей генной конструкции, по-видимому, связано с презентацией захваченных антигенных пептидов антиген-презентирующими клетками. Если трансфекцию проводят в дендритные клетки, то в этом случае все необходимые условия для развития иммунного ответа будут реализованы самой дендритной клеткой (ПО).
Главным преимуществом использования дендритных клеток, при создании противоопухолевых вакцин, по сравнению с другими подходами является то, что in vitro можно получать антиген-презентирующие клетки с определенными характеристиками, которые необходимы для адекватного развития противоопухолевого иммунного ответа. Между тем для реализации остальных трех подходов требуются определенные условия, а именно: представление антигенов в комплексе с молекулами МНС I и II классов; присутствие костимулирующих молекул (CD80 и CD86); секреция ИЛ-12. Все эти условия реализуются дендритными клетками (112).
По своей природе используемые антигены могут быть синтетическими, рекомбинантными или нативными, т.е. выделенными из опухолевого материала самого больного. Синтетическим способом получают пептидные последовательности опухолеассоциированных антигенов. Антигенные пептиды вводятся либо непосредственно больному (23), либо их предварительно нагружают на дендритные клетки (113). И в первом и во втором случае для использования синтетических пептидов необходимо проводить HLA-типирование больных, так как пептидные последовательности могут взаимодействовать только с соответствующими аллельными формами МНС.
Клиническое применение дендритных клеток в онкологии
Для иммунофенотипирования клетки отмывали двухразовой заменой PBS и переносили в полистирольные пробирки (3x105 клеток в 50 мкл PBS). После чего к клеткам добавляли объем раствора моноклональных антител, предусмотренных инструкцией; к исследуемым "поверхностным антигенам.
Неспецифическую сорбцию антител на поверхности клеток регистрировали с помощью соответствующих изотипических контролей. Инкубация клеток с МКА длилась 30 мин. при 4С. Затем клетки отмывали раствором PBS, и осадок клеток ресуспендировали в 200 мкл 1% раствора формалина в PBS. Анализ иммунофенотипа клеток проводили на проточном цитофлуориметре FACSCalibur. Об экспрессии исследуемых антигенов судили либо по количеству антиген положительных клеток, либо по значению средней интенсивности флуоресценции (MFI). Для сопоставления результатов различных экспериментов полученные данные переводили от абсолютных к относительным значениям MFI. Это обусловлено тем, что настройки проточного цитофлуориметра от опыта к опыту могут различаться между собою. Для получения относительных величин значения MFI исследуемого антигена делили на значение MF! соответствующего изотипического контроля.
Криоконсервация мононуклеаров периферической крови
После выделения МПК небольшую порцию клеток сразу же использовали для культивирования ДК, а оставшиеся клетки подвергали криоконсервации для последующего использования. Криоконсервацию МПК проводили по методике разработанной Д.М. Мхеидзе. После центрифугирования осадок клеток ресуспендировали в среде для замораживания клеток из расчета 50x106 на 1 мл. Состав замораживающей среды: 95% полиглюкин, 5% ДМСО. Суспензию клеток в крио-пробирках объемом на 2 мл помещали в пары жидкого азота. Через 1 час ампулы переносили в жидкий азот для длительного хранения. По мере надобности клетки размораживали, помещая ампулы в теплую воду (37С), затем МПК отмывали от замораживающей среды однократным переосаждением в ПС. Осадок клеток ресуспендировали в полной среде и наносили на чашки Петри для последующего культивирования дендритных клеток.
Захвата экзогенных антигенов дендритными клетками
Фагоцитарную активность определяли у незрелых (7 сутки культивирования) и зрелых (9 сутки культивирования) ДК по захвату антигенов коньюгированных" с" красителем. ""РеІХептор-бгібсредбванньїй эндоцитоз исследовали по поглощению декстрана (40 кДа), коньюгированного с ФИТЦ, тогда как рецептор-независимый фагоцитоз выявляли по захвату бычьего сывороточного альбумина, коньюгированного с ФИТЦ. Дендритные клетки отбирали из чашки Петри, осаждали центрифугированием, осадок клеток ресуспендировали в свежей ПС, после чего переносили в две пробирки, исходя из расчета 3 - 5x105 клеток на образец. Объем инкубационной среды составлял 0,5 мл. Контролем на адгезию антигенов на клеточной поверхности служили клетки, обработанные цитохалазином-Б (конечная концентрация 5 мкг/мл), который, воздействуя на микрофиламенты, блокирует все формы захвата антигенов. В опытный и контрольный образцы вносили БСА-ФИТЦ (конечная концентрация 10 мкг/мл) или декстран-ФИТЦ (конечная концентрация 10 мкг/мл) и инкубировали в течение 30 мин в термостате при 37С и 5% СОг. Цитохалазин-В вносили в контрольную пробирку за 20 мин до внесения антигена. По окончании инкубации клетки отмывали от не захваченного антигена, после чего образцы фиксировали в 200 мкл 1% раствора формалина в PBS. Анализ результатов проводили на проточном цитофлуориметре FACSCalibur.
Сравнение различных условий хранения дендритных клеток
Лекарственную форму вакцины, т.е. нагруженные дендритные клетки, находящиеся в фосфатно-солевом буфере, содержащем 1% ЧСА, оставляли при комнатной температуре, либо при + 4С в течение 24 часов. По окончании инкубации жизнеспособность клеток определяли с помощью окрашивания Annexin-V, коньюгированным с ФИТЦ. Помимо этого проводили иммунофенотипирование дендритных клеток с помощью МКА к поверхностным антигенам. Подобную процедуру проводили для ДК до начала инкубации. Анализ проводили на проточном цитофлуориметре.
Приготовление противоопухолевой вакцины на основе дендритных клеток
На основании протокола, утвержденного на Ученом совете НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ РАМН, проводится I фаза клинических исследований противоопухолевой вакцины на основе дендритных клеток у больных меланомой. У пациентов, включенных в клиническое исследование, проводили забор крови для культивирования дендритных клеток, а также операционного материала опухолевого происхождения для приготовления опухолевого лизата.
Способ забора крови определялся общим состоянием больного и периферических вен. В отделении переливания крови НИИ КО проводили лейкоферез или забор 500 мл крови с последующим возвратом пациенту эритроцитарной массы и плазмы. Из лейкоконцентрата выделяли мононуклеары периферической крови, часть из которых сразу же применяли для культивирования дендритных клеток, а оставшиеся МПК разливали на аликвоты, проводили криоконсервацию и хранили в жидком азоте до использования.
Дендритные клетки культивировали из прикрепленных на пластик моноцитов онкологических больных по методике описанной выше. ДК культивировали в течение 7 суток в среде RPMI-1640 содержащей 2% сыворотки человека в присутствии ГМ-КСФ и ИЛ-4. На 7 сутки культивирования производили замену среды, после чего в культуру вносили опухолевый лизат, исходя из соотношения 1 ДК на 1,5-2 лизированные опухолевые клетки и инкубировали в течение 2 часов. В последующем для созревания ДК в культуру добавляли ФНОа и ПГЕг. Через 48 часов ДК собирали, осаждали центрифугированием, отмывали один раз в PBS, содержащем 1% человеческого сывороточного альбумина (ЧСА), и подсчитывали число клеток. После отмывки, осадок клеток ресуспендировали в 1-2 мл PBS, содержащего 1% ЧСА, переносили в ампулу и доставляли вакцину в клиническое отделение, для введения больному.
Иммунофенотип ДК определяли по реакции иммунофлуоресценции. Во всех случаях ДК, которые вводили больным, имели «зрелый» иммунофенотип, проявляющийся в экспрессии антигенов CD80 и CD83 ( 50%).
Описание группы больных
Вакцинотерапию проводили больным с прогрессированием заболевания, после проведенной химио/иммунотерапии. В данном исследовании описаны пациенты; которым "провели не мёнёе 15 вакцинаций.
Больной А. 80 лет, диагноз: меланома кожи спины (III уровень инвазии), состояние после комбинированного лечения. Помимо хирургического лечения получал химиотерапию (цисплатин, винбластин, дакарбазин) и иммунотерапию (интрон-А, пролейкин). На момент начала вакцинотерапии регистрировали метастазы: в левой подвздошной области, в правый надпочечник, в районе, локтевого сгиба справа, в паховой области слева, подмышечной впадине справа. В процессе вакцинотерапии был удален быстрорастущий метастаз в области подмышки справа. Больная Л. 61 год, клинический диагноз: меланома кожи спины, метастаз в мягкие ткани левого бедра, состояние после хирургического лечения в 1999-2002 годах. Метастаз в области левой паховой складки, состояние после хирургического лечения в сентябре 2003 года. Помимо хирургического лечения получала иммунотерапию (ЛАК-терапия + ронколейкин) и химиотерапию (цисплатин, винбластин, дакарбазин, араноза). На момент начала вакцинотерапии регистрировали метастазы в паховой области слева и в мягкие ткани в области послеоперационного рубца.
Больной Ч. 27 лет, диагноз: меланома кожи левой голени, состояние после комбинированного лечения, диссеминация в области послеоперационного рубца. Помимо хирургического лечения получал химиотерапию (цисплатин, винбластин, дакарбазин). На момент начала вакцинотерапии регистрировали метастазы в области внутренней поверхности левого бедра и по ходу левой паховой складки.
Методы исследования
Вакцинотерапия предполагает многократное введение нагруженных дендритных клеток больному. В случае, когда у пациента проводится забор небольшого количества крови перед каждой очередной вакцинацией, сохранение МПК не требуется, так как все клетки идут для приготовления вакцины. Когда же источником МПК служит лейкомасса или продукты лейкофереза, то количество выделенных клеток варьирует от сотен миллионов до нескольких миллиардов, поэтому большую часть мононуклеаров необходимо криоконсервировать. Обычно при криоконсервации клеточных линий используют замораживающую среду, состоящую из ЭТС (90%) и ДМСО (10%). В нашем случае присутствие ксеногенных белков было бы недопустимым, поэтому состав замораживающей среды был изменен. В связи с этим мы использовали смесь, которую применяют для криоконсервации клеток в банке криоконсервированных биоматериалов ГУ РОНЦ РАМН, состоящую из полиглюкина (95%) и ДМСО (5%). Преимуществом данного состава замораживающей среды является, во-первых, стандартность раствора полиглюкина, что нельзя сказать об ЭТС, во-вторых, его низкая цена и, в третьих, меньшее содержание ДМСО, что, безусловно, снижает токсическое воздействие, оказываемое на замораживаемые МПК.
Для того чтобы выяснить, влияет ли криоконсервация МПК на последующее культивирование дендритных клеток, была проведена серия экспериментов, в которых сравнивали две группы ДК. В первую группу входили ДК, которые получали из свежевыделенных МПК. Вторая группа была представлена ДК, которые получали из МПК, подвергшихся криоконсервации. Для этого из лейкомассы доноров выделяли мононуклеары периферической крови, часть из которых сразу использовали для культивирования дендритных клеток, тогда как другую часть криоконсервировали. В тот же день замороженные МПК размораживали, наносили на чашку Петри и культивировали ДК. Опыты показали, что криоконсервация практически не оказывала влияния на способность моноцитов прикрепляться к поверхности чашки Петри. На 9 сутки культуру дендритных клеток собирали и проводили 6] иммунофенотипирование. Различия в уровне экспрессии антигенов на дендритных клетках первой и второй групп были не достоверными (рис. 12).
Также необходимо было проверить возможность культивирования дендритных клеток после длительного хранения МПК. В экспериментах использовали мононуклеары периферической крови больного меланомой после более чем I года хранения в жидком азоте. Полученные данные свидетельствуют, что продолжительное хранение МПК в жидком азоте не отражается на способности моноцитов дифференцироваться в дендритные клетки, что подтверждается иммунофенотипом полученных ДК (рис. 13). Рисунок 13. Исследование экспрессии поверхностных антигенов на зрелых дендритных клетках больного меланомои полученных из МПК, которые более 1 года хранили в жидком азоте, методом проточной иитофлуориметрии.
Гистограммы красного цвета - исследуемые антигены, прозрачные гистограммы с черной линией - изотипические контроли. По оси абсцисс -интенсивность окрашивания клеток антителами к соответствующему маркеру, по оси ординат - количество событий. А - CD83; Б - CD86; В - CD227
Одним из важных свойств, которым обладают дендритные клетки, является поглощение экзогенных антигенов с последующей переработкой и презентацией пептидных фрагментов молекулами МНС. Захват антигенов может быть активным процессом (рецептор-опосредованным), например, за счет маннозного рецептора, который имеет сродство к антигенам имеющими в своем составе маннозу, так и рецептор-независимым. Как известно, способностью поглощать экзогенные антигены обладают только незрелые дендритные клетки, тогда как зрелые ДК практически полностью утрачивают эту функцию. Таким образом, о степени дифференцировки дендритных клеток можно судить не только по уровню экспрессии того или иного антигена на клеточной поверхности, а также по их способности или неспособности захватывать антигены. В тех случаях, когда исследуют захват внешних антигенов дендритными клетками, в качестве отрицательного контроля на поглощение является флуоресценция клеток, обусловленная сорбцией антигена, на клеточной поверхности. В ряде исследований таким контролем являлись клетки, которые инкубировали с антигеном при +4С, так как понижение температуры резко ослабляет активность всех биологических процессов, в том числе и фагоцитоза. Между тем, уровень сорбции, а, следовательно, и уровень флуоресценции при +4С может быть ниже, чем при +37С. Поэтому наиболее корректно контрольные пробы инкубировать при той же температуре, при которой проводится эксперимент по захвату антигена, т.е. при +37С. Для того чтобы клетки в контрольных образцах не поглощали антиген, многими исследователями используется прием направленного блокирования фагоцитоза, например, с помощью цитохалазина-Б.
В наших экспериментах в качестве модельных антигенов служили декстран и БСА, меченные ФИТЦ, т.е. антигены углеводной и белковой природы соответственно. Поглощение антигенов определяли на стадии незрелых так и зрелых ДК. На 7 сутки культивирования клетки обладали иммунофенотипом незрелых дендритных клеток, что характеризовалось в отсутствии экспрессии антигенов CD80 и CD83, хотя была выражена высокая экспрессия маннозного рецептора (рис.14).
Получение дендритных клеток из мононуклеаров периферической крови после криоконсервации
Когда речь идет о создании индивидуальной противоопухолевой вакцины, то для того чтобы разработанный метод мог быть широко применен в клинической практике, он должен отвечать ряду условий и характеристик.
Во-первых, вакцина должна быть безопасна. При использовании иммунотерапевтических подходов всегда есть риск развития у пациента аутоиммунных осложнений и аллергических реакций. При применении ОЛ в качестве источника опухолевых антигенов большинство белков входящих в его состав имеют нормальную природу. Если вместо опухолевого лизата использовать рекомбинантные опухолеассоциированные антигены или иммуногенные пептиды, то даже в этом случае существует вероятность подобных осложнений, так как в процессе культивирования всегда происходит гибель небольшого количества клеток, которые будут захвачены дендритными клетками. Наш трехлетний опыт клинического применения дендритных клеток для этих целей, показывает, что ни у одного больного не развивалось аутоиммунных осложнений. Использование ДК для вакцинации в диапазоне от 0,5x106 до 31x106 клеток на инъекцию не вызывало токсических явлений у пациентов. На основании этого можно заключить, что отработанная методика получения и нагрузки, дендритных клеток опухолевым лизатом, позволяет получать противоопухолевую вакцину, безопасную для использования у онкологических больных.
Во-вторых, методика культивирования дендритных клеток должна быть относительно несложной и воспроизводимой. Любой метод, состоящий из множества этапов, будет иметь меньше шансов для широкого применения в - - клинике, нежели методика с минимально-необходимым количеством стадий. Говоря о воспроизводимости, необходимо помнить, что вне зависимости от индивидуальных особенностей пациентов на выходе должны получаться ДК, обладающие схожими характеристиками. Методика, адаптированная нами для клинического применения, представлена небольшим числом стадий при производстве противоопухолевой вакцины на основе дендритных клеток. Для ее производства достаточно одного-двух сотрудников обладающих опытом работы с культурой клеток. Отработанный метод позволяет культивировать дендритные клетки из моноцитов доноров, онкологических больных, криоконсервированных МПК и получать на выходе достаточное количество зрелых ДК, нагруженных опухолевыми антигенами.
В третьих, себестоимость получения вакцины должна быть невысокой. Чем ниже цена производства вакцины, тем больше вероятность, что данный метод лечения найдет широкое применение в клинической практике. Себестоимость процедуры в основном определяется типом используемого оборудования и реактивов. Практически все оборудование, за исключением СОг-инкубатора, производит отечественная промышленность, а стоимость в 2-3 раза ниже по сравнению с зарубежными аналогами. При производстве вакцины основная часть затрат будет определяться стоимостью расходных материалов: питательных сред, ростовых факторов, пластиковой посуды. Все материалы, используемые нами для получения вакцины на основе дендритных клеток, за исключением сыворотки человека и ЧСА, были импортного производства. Перечень фирм, предлагающих одну и ту же продукцию довольно широк, что позволяет подобрать материалы необходимого качества и ценового диапазона. При культивировании ДК использовали реактивы высокого качества, что гарантировало воспроизводимость результатов, и при этом относительно недорогие, что позволило при небольших затратах провести I фазу клинических исследований. В результате, себестоимость производства противоопухолевой вакцины, в общем, оказалась невысокой.
В четвертых, самое главное условие, без которого все вышеперечисленные не имеют большого смысла - это способность вакцины стимулировать противоопухолевый клеточный иммунный ответ. После введения дендритных клеток, нагруженных опухолевым лизатом, у больных в местах инъекции развивалась реакция ГЗТ, что свидетельствует о развитии клеточного ответа. Реакция была специфична, так как на введение ДК ненагруженных ОЛ гиперчувствительность замедленного типа не развивалась. Наряду с этим было показано, что на фоне вакцинотерапии происходило увеличение доли цитотоксических Т-лимфоцитов специфичных к опухолевому лизату в периферической крови у больных. Следует отметить, эта закономерность была общей и не зависела ни от тяжести заболевания, за исключением больных на терминальной стадии, ни от предшествующей химио/иммунотерапии. У всех пациентов развивались схожие иммунологические реакции ГЗТ, увеличение содержания ЦТЛ в крови в процессе вакцинотерапии. Учитывая это можно заключить, что иммунная система больных сохранила способность к генерации противоопухолевого иммунного ответа даже при запущенном опухолевом процессе с большой опухолевой массой и/или даже после нескольких курсов химиотерапии. В связи с этим возникает вопрос: почему же развитие иммунного ответа у пациентов может не коррелировать с терапевтическим эффектом?
Описано довольно много способов, с помощью которых опухоль способна уходить от иммунного ответа организма (59). Суть всех этих вариантов «ускользания» заключается в том, чтобы не позволить иммунной системе развить специфический противоопухолевый ответ. Это может быть обусловлено: локальной иммуносупрессией, снижением иммунногенности опухоли, подавлением функциональной активности дендритных клеток и т.д. и т.п. В условиях настоящего подхода мы искусственно получаем дендритные клетки, нагруженные опухолевыми антигенами, способные генерировать противоопухолевый иммунный ответ. Процентное содержание цитотоксических Т-лимфоцитов специфичных к лизату опухолевых клеток увеличивается в периферической крови больных в процессе вакцинотерапии и, тем не менее, у большинства пациентов с распространенным заболеванием метастатические узлы продолжают расти. Можно конечно предположить, что растущая опухоль утратила часть из тех антигенных детерминант, к которым имели специфичность ЦТЛ, и поэтому для эффекторных клеток опухоль стала «невидимой». Между тем, в ряде работ - было показано отсутствие корреляции между наличием циркулирующих Т- -лимфоцитов, специфичных к пептидной последовательности опухолевых антигенов, и терапевтическим эффектом (26), и это наблюдалось несмотря на то, что метастатические узлы экспрессировали как опухолевые антигены, так и молекулы МНС I класса (101).
Одним из возможных объяснений несоответствия иммунологического ответа терапевтическому эффекту является то, что, по-видимому, опухоль может проявлять устойчивость к иммунологическим воздействиям, например, формировать резистентность к цитотоксическому действию лимфоцитов (72). Принимая во внимание, что опухоль гетерогенна по клеточному составу, то вполне вероятно, что среди множества клонов существуют и потенциально устойчивые, и под действием факторов отбора может происходить их селекция. Отбор устойчивых к действию ЦТЛ клонов можно наблюдать и при метастазировании, что было наглядно показано в экспериментальной работе (73). В связи с этим неудивительно, что применение противоопухолевой вакцины на основе дендритных клеток у больных меланомой с отдаленными метастазами в качестве первой линии терапии, не имело выраженного клинического эффекта (109). Учитывая все вышеперечисленные обстоятельства можно сделать вывод, что максимальный клинический эффект от противоопухолевой вакцины на основе дендритных клеток можно ожидать при использовании ее в адьювантном режиме после удаления первичного очага.
![Оценка эффективности использования рекомбинантного интерлейкина-2 у больных диссеминированной меланомой кожи и распространенным раком почки [Электронный ресурс]](/i/i/4598/208819.png "Оценка эффективности использования рекомбинантного интерлейкина-2 у больных диссеминированной меланомой кожи и распространенным раком почки [Электронный ресурс] Новик Алексей Викторович")
