Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Современные возможности лечения диссеминированного колоректального рака 9
1.2. Биотерапия злокачественных опухолей
1.2.1. Классификация противоопухолевых вакцин 17
1.2.2. Характеристика дендритных клеток 21
1.2.3. Противоопухолевые вакцины на основе дендритных клеток и способы их культивирования 24
1.2.4. Сведения об экспериментальном и клиническом применении противоопухолевых вакцин 30
Глава 2. Собственные исследования 46
2.1. Характеристика клинических наблюдений 46
2.2. Методы исследования 57
2.3. Культивирование дендритных клеток и получение опухолевого антигена 58
2.4. Иммунофенотипирование дендритных клеток и определение цитотоксических Т-лимфоцитов в крови онкологических больных 62
2.5. Приготовление противоопухолевой вакцины на основе дендритных клеток
Глава 3. Результаты оперативного лечения больных раком толстой кишки с отдаленными метастазами 68
3.1. Непосредственные результаты циторедуктивных и симптоматических операций 68
3.2. Отдаленные результаты лечения диссеминированного колоректального рака 77
Глава 4. Результаты лечения противоопухолевой вакциной 87
Заключение 95
Выводы 106
Практические рекомендации 108
Список литературы
- Классификация противоопухолевых вакцин
- Культивирование дендритных клеток и получение опухолевого антигена
- Приготовление противоопухолевой вакцины на основе дендритных клеток
- Отдаленные результаты лечения диссеминированного колоректального рака
Классификация противоопухолевых вакцин
Заболеваемость рака прямой и ободочной кишки неуклонно растет. За последние десятилетия частота данного заболевания в различных районах мира подвержена значительным колебаниям. В структуре онкологической заболеваемости в мире, колоректальный рак занимает четвертое место, удельный вес составляет от 2 до 10% в общей структуре заболеваемости. Ежегодно на нашей планете регистрируется около 600 тысяч человек, вновь заболевших. В России, также, заболеваемость неуклонно возрастает, в 1997 г. в структуре заболеваемости злокачественными опухолями рак ободочной кишки занял пятое место, составив 5,5%, при этом у мужчин эта форма рака составила 4,6%, у женщин 6,5%. Показатель заболеваемости населения России опухолями данной локализации составил 16,2 на 100 тыс. населения. Максимальные уровни отмечены в Санкт-Петербурге (33,6) и в Москве (30,3) [2,4, 8].
Смертность от рака ободочной и прямой кишки остается довольно высокой: По данным Nordlinder В.и Faucheron J.L. (1994 г.) до 50% пациентов погибают от прогрессирования заболевания в течение 3-5 лет после радикальной операции. По данным Чиссова В.И. (1999г.), в структуре смертности от злокачественных заболеваний в России за 1997 год, эта патология заняла четвертое место (6%), при этом у мужчин причиной смерти от этой патологии занимает пятое место (4,4%), среди женщин — четвертое место (8%). У 27,7% больных раком толстой кишки во время постановки первичного диагноза уже имеются клинически определяемые метастазы. Фактически этот показатель может быть значительно выше, так как одногодичная летальность, например, в Санкт-Петербурге в 2000 году составила 49,8%. [1, 2, 3, 11, 14].
Не менее важным обстоятельством, определяющий интерес к разбираемой проблеме, является успешное развитие хирургии, анестезиологии и химиотерапии в целом, что дает возможность достаточно широко применять циторедуктивные операции при колоректалыюм раке. Анализ литературных данных свидетельствует, что почти у 70% больных раком ободочной кишки устанавливают III и IV стадии заболевания, у каждого третьего больного из числа оперированных диагностируют отдаленные метастазы, преимущественно в печень и легкие. В таких случаях хирургический метод очень часто носит, как правило, симптоматическую направленность - формирование ко-лостомы, устранение кишечной непроходимости, формированию обходного анастомоза, устранение перифокалыюго воспаления и т.д. При изучении материалов вскрытий 104 больных, умерших от запущенных форм рака прямой кишки и неподвергавшихся радикальному лечению, у 53 (51%) непосредственной причиной смерти явились осложнения в течение опухолевого процесса — гнойно-воспалительные, тромбоэмболия, кишечная непроходимость, флегмона таза и перитонит. У 51 больного (49%) выявлена генерализация опухолевого процесса. При этом у 21 (39.6%) умершего больного от осложнений отдаленных метастазов на секции не было. Опухолевой процесс у этих больных до конца жизни оставался местным [6].
В последние годы все более популярным становятся так называемые циторедуктивные операции. Следует отметить, что понятие «циторедуктив-ная хирургия» изначально использовалась в онкогинекологии, когда после удаления первичной опухоли и/или отдаленных метастазов и проведения дополнительного химиотерапевтического лечения удавалось достичь значительного увеличения общей выживаемости больных [8,9]. Причиной повышенного интереса к выполнению такого рода операций являются данные о возможности с их помощью улучшить не только качество жизни больных [4, 9], но и отдаленные результаты.
Крайне важным является выбор метода хирургического вмешательства, причем риск паллиативной операции не должен превышать риск радикального лечения. Распространенность колоректального рака определяется различными клиническими формами, из которых можно выделить три основные. Первое - местнораспространенный процесс без отдаленных метастазов, это большие опухоли, которые прорастают все слои стенки кишки и распространяются на соседние органы и ткани. Второе - первичная опухоль любых размеров с отдаленными метастазами. Третье - генерализация опухолевого процесса [7]. Целесообразность выполнения паллиативных операций оправдана. Удаление первичного очага позволяет избежать тяжелых осложнений опухолевого процесса (кровотечение из распадающейся опухоли, кишечная неиро-ходимость, раковая интоксикация). Это позволяет предупредить или снизить теми дальнейшей диссеминации опухолевого процесса и открывает возможности для других методов лечения, при этом улучшается и «качество жизни» пациентов [4, 15, 20, 21].3а последние 10-15 лет значительно изменилось отношение к больным с диссеминированными формами колорскталыюго рака. Это стало возможным благодаря прогрессу в хирургическом лечении метастатических поражений печени. На сегодняшний день в мировой литературе нет разногласий о целесообразности выполнения резекций печени но поводу метастазов колорскталыюго рака [5, 7, 10, 11, 18]. Проведение такого рода операций зависит от возраста больного, общего состояния организма, распространенности процесса, количества метастазов в печени, и, прежде всего, от функционального состояния печени. Однако резекции печени, особенно обширные, остаются операциями, которые требуют высокой квалификации хирурга и доступны специализированным, хорошо оснащенным центрам. Наилучшие результаты достигнуты при хирургическом лечении метастазов в печень рака толстой кишки Ю.И. Патютко [13].
В последние годы появились сообщения использования уксусной кислоты для чрезкожного введения в метастатическую и первичную опухоль печени. По данным Ohnishi К (1996 г.), при чрезкожиом введении уксусной кислоты под контролем ультразвуковой томографии, при небольших размерах метастазов (до 3 см.), пятилетняя выживаемость составила 50%. В настоящее время чрезкожная и интраоперационная термоабляция метастатических очагов печени применяется очень широко.
Циторедуктивные операции при раке толстой кишки влияют на среднюю продолжительность жизни больных, что в свою очередь зависігг от уровня инвазии и гистологического типа опухоли, количества метастазов в печени и т.д. Эффективность лечения метастазов в печени считается лучше, если при исследовании печени выявляли меньше 4 метастатических очагов. Отсутствие гепатомегалип, перенесенного гепатита, цирроза, нормальная функциональная способность печени и биохимические показатели в сыворотке крови больных (ACT, АЛТ, ЩФ и её изоферментов) также являются благоприятными факторами прогноза [12]. Послеоперационная летальность, в большинстве случаев, связана с развитием печеночной недостаточности в раннем послеоперационном периоде [11]. Как видно из таблицы 1 но данным различных авторов общая пятилетняя выживаемость колеблется от 20 до 60%.
Культивирование дендритных клеток и получение опухолевого антигена
Дендритные клетки получали культивированием моноцитов периферической крови человека. Цельную кровь, лейкомассу или лейкоконцентрат (продукт лейкофереза), разводили в 1,5-2 раза средой RPMI-1640, после чего проводили центрифугирование в градиенте Ficoll-Paque р=1,077 в течение 40 мин при 300g. По окончании центрифугирования отбирали интерфазные кольца, содержащие мононуклеары периферической крови (МПК), переносили в чистую пробирку и разводили средой RPMI -1640. Для удаления примеси фиколла проводили центрифугирование при 300g в течение 20 мин. От тромбоцитов освобождались 5-кратной отмывкой средой RPMI-1640 (5 мин при HOg). После этого клетки ресусиендировали в полной среде, число их подсчитывалось в камере Горяева по стандартной методике и плотность клеток доводили до 5 млн/мл [32].
Для получения ДК в чашку Петри d=100 мм вносили 10 мл полной среды, содержащей 50 млн МПК и инкубировали в термостате (5% ССЬ, 37С). Через 1,5 часа среду с не прилипшими клетками (преимущественно лимфоцитами) аккуратно отбирали, а к клеткам, адгезированных на пластике, (преимущественно моноцитам) добавляли по свежую ПС, содержащую ГМ-КСФ (конечная концентрация 80 нг/мл) и ИЛ-4 (конечная концентрация 10 нг/мл). На вторые, четвертые и шестые сутки культивирования добавляли по 2 мл свежей ПС, содержащей 800 нг ГМ-КСФ и 100 нг ИЛ-4. За это время клетки откреплялись от пластика, увеличивались в размерах, на клеточной поверхности появлялись отростки клеток. На седьмые сутки культивирования для осуществления дифференцировки дендритных клеток производили полную замену среды на 10 мл свежей ПС, содержащей 200 нг ФНОа и 2500 нг ПГЕ2. Через 48 часов свободно плавающие клетки собирали и проводили их имму-нофенотипирование. ДК нагружали антигенами после замены культуральной среды добавлением к клеткам опухолевого лизата и инкубацией в течение 2х часов. После этого в культуру добавляли ФНОа и ПГЕг для индукции дифференцировки дендритных клеток. Получение опухолевого лизата и VNTR
К нативным антигенам относят опухолевый лизат (ОЛ), который получают из опухолевого материала больного [114]. Опухолевый лизат состоит из большого набора белков, гликопротеинов и т.д., которые высвобождаются во время лизиса опухолевых клеток. Источником опухолевого лизата хирургический материал. Опухолевая ткань кишки, взятая после выполнения цито-редуктивной операции. Опухоль механически измельчалась, тщательно отмывалась от дебриса средой RPMI 1640. Затем определяли число опухолевых клеток, переносили в среду и замораживали в жидком азоте. Для получения опухолевого лизата клеточную суспензию разрушали, многократно проводя замораживание-оттаивание образца клеток. Разрушенные клетки осаждали центрифугированием (2 мин при 12000гр), супернатант собирали, стерилизовали фильтрованием через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и разливали по аликвотам. Аликвоты хранили при температуре -20с.
VNTR22 - Рекомбинантные опухоль-ассоциированные антигены получают путем трансфекции соответствующего гена в бактерию, после чего наработанный белок подвергается очистке. Наиболее часто используемым реком-бинантным белком является муциноподобный антиген, который экспрессиро-ван в широком спектре опухолей. При использовании рекомбинантных антигенов для нагрузки дендритных клеток подбор больных обладающих определенным набором молекул ГКГС не требуется, так как захваченный белок будет ироцессирован антиген-презентирующими клетками в необходимом виде.
В ГНЦ генетике и селекции промышленных микроорганизмов РФ г. Москвы сконструирован ген слитного белка стрептавидин-оиухоль-ассоциированный антиген (VNTR MUC1) и получен слитный гибридный белок SAV VNTR.22- Для этого белка была показана высокая способность индуцировать синтез антител специфичных к природному аналогу рекомбинант-ного продукта (MUC1-белок поверхности карцином человека). Под руководством Гулько Л.Б. было произведено получение независимого вакцини 61 рующего препарата VNTR22 высокой степени чистоты путем ферментативного расщепления слитного белка SAV VNTR22 с использованием специфических протеаз. Этот белок используется в конструировании материалов с потенциальной противоопухолевой активностью. Преимуществом данного подхода заключается в том, что нет необходимости определять типы и подтипы ГКГС пациента, как в случае использования синтетических пептидов, так как рекомбинантный антиген будет поглощен дендритными клетками и представлен в нужном виде в комплексе с молекулами гистосовместимости [133].
Приготовление противоопухолевой вакцины на основе дендритных клеток
Результаты хирургического лечения оценивают но многим показателям. Одним из показателей эффективности хирургического лечения являются непосредственные результаты - частота различного рода осложнений и связанная с ними послеоперационная летальность.
Частота послеоперационных осложнений при раке ободочной и прямой кишки колеблется от 12 до 65% (Блохин Н.Н., 1981; Доценко А.П., Зай-чук А.И., 1989; Kukoch М., 1989; Rovato P. ct. al, 1990). По данным нашей клиники (В.И. Кныш, 1997) послеоперационные осложнения отмечены в 3,6%.
Послеоперационные осложнения разделены на три группы: 1) интрао-иерационные, возникшие во время операции (вскрытие просвета кишки, ранение соседних органов, кровотечение и др.); 2) ранние послеоперационные осложнения, развившиеся в ближайшем (в первые две недели после операции) послеоперационном периоде (гнойно-воспалительные и негнойные); 3) поздние, возникшие после выписки больного из стационара.
В нашем исследовании из 236 больных диссеминированным колорек-тальным раком 188 выполнены циторедуктивные операции и 48 -симптоматических операций. Всего отмечено три интраоперационных осложнений, которые возникли после выполнения циторедуктивных операций, что составляет 1,3%. Два осложнения - кровотечение и вскрытие просвета кишки были при комбинированных операциях; в нервом случае выполнялась левосторонняя гемиколэктомия (при кишечной непроходимости) и была ранена селезенка, во втором случае при брюшно-промежностной экстирпации был вскрыт просвет тонкой кишки. Еще одно интраоперационное осложнение - ранение мочеточника при выполнении чрезбрюшной резекции при дис-семинированном раке прямой кишки.
Частота послеоперационных осложнений в зависимости от вида операции. Как видно из таблицы 21 и рисунка 9 послеоперационные осложнения при циторедуктивных операциях встречались статистически достоверно в три раза чаще, чем при формировании обходных анастомозов или колостом у больных колоректальным раком с множественными метастазами в печень.
В таблице 21 представлены наиболее часто встречающиеся гнойно-воспалительные послеоперационные осложнения. Из 236 больных у 37 пациентов наблюдались послеоперационные осложнения, что составляет 16,1%, из которых у 20 были отмечены ранние послеоперационных осложнения. Данные представлены в таблице 22.
Как видно из представленных данных чаще других встречались абсцессы в брюшной полости и в малом тазу после выполнения циторедуктивных операций. На втором месте - нагноение послеоперационной раны и пиелонефрит. У двоих пациентов послеоперационный период осложнился перитонитом (0,8%) и у одного из 236 больных развилась пневмония.
Не менее важным среди ранних послеоперационных осложнений при хирургическом лечении диссеминированного колоректального рака являются, так называемые, негнойные осложнения. В нашем исследовании у 27 (11%) пациентов возникли такого рода осложнения. В таблице 23 представлены наиболее часто встречающиеся негнойные послеоперационные осложнения после паллиативных операций по поводу метастатического рака ободочной и прямой кишки. Как видно из представленной таблицы 23 наиболее частым осложнением этой группы явилась недостаточность швов анастомоза и культи прямой кишки 10 (4,3%), затем почечно-печеночная недостаточность 5 (2,1%). Среди ранних послеоперационных осложнений мы выделили еще одну отдельную группу урологические осложнения. Из этой группы наиболее чаще диагностированы пиелонефриты (в 3 раза), чем атония мочевого пузыря, данные, которых представлены на рисунке 11. атония мочевого пузыря; 25% послеоперационный пиелонефрит; 75% Рис. 11. Структура урологических послеоперационных осложнений. Как уже говорилось выше (таблица 11) у 6 больных, которым выполнено удаление первичного очага была диагностирована вторая опухоль. При изучении послеоперационных осложнений эта группа нациентов не включена в исследование. В таблице 24 представлена частота послеоперационных осложнений у больных после циторедуктивных операций в зависимости от хирургического вмешательства на прямой и ободочной кишке.
Как видно из представленных данных всего послеоперационных осложнений после циторедуктивных операций было отмечено у 31 (17,03%) пациента. Достоверных различий по частоте послеоперационных осложнений в зависимости от локализации опухоли (ободочная или прямая кишка) не выявлено.
В таблицах 25 и 26 представлены данные частоты осложнений при циторедуктивных операциях на ободочной и прямой кишке. Таблица 25 Частота послеоперационных осложнений у больных раком ободочной кишки в зависимости от объема оперативного вмешательства Виды операций Послеоперационные осложнения Всего есть нет Правосторонняя гемиколэктомия 618,2% 27 81,8% 33 Левосторонняя гемиколэктомия 3 21,4% 11 78,6% 14 Резекция сигмовидной кишки 4 10,5% 34 89,5% 38 Операция типа Гартмана 7 33,3% 14 66,7% 21 Операция Микулича 0 1 107 Pearson Chi-squar 4,933825 df=10 р=0,89554 Как видно из таблицы 25 достоверных статистических различий по частоте осложнений, в зависимости от объема операции у больных раком ободочной кишки, на всю группу не выявлено. Операция Гартмана выполнялась, в основном, у больных с осложненными формами рака, что и привело к увеличению частоты послеоперационных осложнений (33%). Таблица 26
Анализ данной таблицы 26 свидетельствует, что достоверных различий по частоте послеоперационных осложнений как на всю группу, так при сравнении осложнений при выполнении брюшноанальных резекций и брюшно-промежностных экстирпаций прямой кишки не выявлено.
Вторым, не менее важным, показателем непосредственных результатов хирургического лечения является показатель послеоперационной летальности. Увеличение послеоперационной летальности но данным различных авторов может быть связано как с наличием сопутствующей патологии, так и осложненным течением опухолевого процесса. Данные литературы свидетельствуют о том, что летальность после операций по поводу рака прямой и ободочной кишки, различного объема колеблется от 8 до 20% (Нуров А.У., 1977; Блохин Н.Н., 1981; Мельников Р.А., 1983; Kaufman Z. et al., 1989;
Stipa V. et al, 1991). По данным клиники онкопроктологии ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина (Кныш В.И., 1997) показатель летальности после радикальных операций составлял 8,1%, а в последние годы снизился до 2,2% (Барсуков Ю.А.).
Из 236 больных с множественными метастазами в печень и (или) в Другие органы, которым выполнены хирургические вмешательства различного объема, умерло 7 пациентов, что составляет 3,0 %. Причиной летальных исходов в большинстве случаев (5 больных) была острая почечно-печеночная недостаточность, развившейся в ранний послеоперационный период. В одном из них было отмечено сочетание почечно-печеночной недостаточности с коронарной недостаточностью. Причиной смерти еще 2 пациентов с диссеминированным колоректальным раком после операции были инфаркт миокарда и тромбоэмболия легочной артерии. Послеоперационные осложнения после циторедуктивных операции встречались достоверно чаще, чем после симптоматических операций, однако это не влияло на послеоперационную летальность. Наиболее частой причиной летальных исходов в послеоперационном периоде была печеночно-почечная недостаточность.
Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о том, что непосредственные результаты при выполнении паллиативных операций но поводу диссеминированного колоректалыюго рака не отличается от показателей оперативных вмешательств, выполненных при радикальных операциях.
