Введение к работе
ктуалыюсть проблемы
татистика роста заболеваемости и смертности от злокачественных новообра-шаний явственно показывает, что прогресс в лечении данных заболеваний по )авнениго с достижениями в других отраслях медицины относительно не ве-1К. Проблема осложняется недостаточно ранней диагностикой, и недостаточно [)фективными терапевтическими подходами, не позволяющими селективно шчтожить опухолевые клетки. Современные терапевтические подходы часто называются безуспешными, так как в них отсутствует понимание единой тео-яи микроэволгоции опухолевого процесса, ведущего к неожиданно высокой :терогенности форм опухолей. Большинство экспериментальных данных, на эторых основываются методы диагностики и терапии, базируется на материа-IX, полученных на первичных опухолях, зрелых метастазах и культурах опу-элевых клеток. Даже модели опухолей, включая ксенотрансплантанты челове-гских опухолей на иммуносупрессированных животных, отличающиеся высо-им уровнем роста злокачественной ткани, не учитывают основной характерники заболевания протекающего у человека - постепенной эволюции опухоле-ых клеток приводящей к направленной селекции наиболее агрессивных варн-іггов с одной стороны и к крайней гетерогенности с другой. Причинная и циклическая регуляция специфических цепей передачи сигна-ов полностью основывается и зависит от активности белковых фосфокиназ и юсфатаз. Эти ферменты, как правило, имеют низкую субстратную специфич-ость in vitro, но призваны выполнять строго специфические функции в клетке. !реди данных групп ферментов особо отличается фосфатаза белков типа 2А ЭР2А) которая эволюционно широко распространена во всех тканях организ-:ов всех типов, начиная с дрожжей. В организмах высших животных содержа-ие её достигает 0.1-1% от всех белков клетки, и ей принадлежит львиная доля бщей клеточной фосфатазной активности в большинстве тканей и организмов, иохимические и генетические исследования показали, что РР2А - один из
наиболее распространённых и в то же время консервативных ферментов, примеру, аминокислотные последовательности каталитической единицы РР2, человека и пивных дрожжей идентичны на 86%. Разрушение гена РР2А леталі но как для дрожжей, так и для млекопитающих, что указывает на то, что даі ный фермент абсолютно необходим для существования одно- и многоклето1 ных форм. Имеется масса данных, показывающая значение и вовлечение РР2і в регулирование клеточного метаболизма, репликацию ДНК, транскрипции сплайсинг РНК, трансляцию, прохождение клеточного цикла, морфогенез, ра: витие и трансформацию. Хотя до сих пор точные механизмы, через которы PP2A воздействует на эти процессы, во многих случаях до конца не определе ны. Классическая модель регуляции обратимого фосфорилирования белков уі верждает, что белковая фосфатаза обращает эффект протеин киназ дефосфори лируя их субстраты. Однако всё более становится очевидным, что большинств субстратов РР2А - это именно разнообразные киназы. Импульс, передаваемы: и усиливаемый каскадами фосфорилирующими друг друга киназ должен за глушаться во времени, иначе его эффект станет неуправляемым и будет напо минать игру на фортепиано с постоянно нажатой педалью легато, когда чере короткое время уже нельзя различить мелодии за какафонией вибрирующи; струн.
Открытие того, что РР2А и другие минорные фосфатазы регулируют актив ности множественных киназных каскадов, подготовило почву для ответа, ка: единственный фермент может обладать такими всеохватывающими функция ми. Имея столь широкий спектр подконтрольных эффектов, РР2А является ла комой целью для токсинов, вирусов и внутриклеточных ингибиторов. Вирусы включая большинство онкогенных вирусов, чей геном, по определению, очен; невелик, и которые должны экономно использовать заложенную информацию часто несут в геноме ингибиторы РР2А. Одним из примеров является малы! антиген t из генома вируса SV40, являющийся наиболее известным ингибито ром-перенаправлятелем активности РР2А
Непосредственно с балансом фосфорилирования/дефосфорилирования в клетках связана сеть промежуточных филаментов. Сборка/разборка и механическая гибкость этой подсистемы цитоскелета управляется через обратимое фосфорилирование ключевых эпитопов. Развитие опухолевого процесса требует от клеток сохранять способность к адаптации в недружественных условиях организма хозяина, в том числе способности к изменению формы, миграции, выживанию в суспензии в кровяном русле и инвазивному прикреплению к межклеточному матриксу. Нестин - онкофетальный промежуточный филамент 6 группы связывается со способностью клетки избегать терминальной дифферен-цировки и быстро менять форму без ущерба для систем роста и репликации.
Опухолевая клетка в условиях организма подвергается огромному разнообразию стрессов: химически гетерогенные условия в родительской ткани, зрелой опухоли, в кровотоке и органе-мишени; физические стрессы, включая стресс потока жидкости и стрессы от радиотерапии, стрессы, вызванные иммунной системой организма, и, наконец, апоптогенные стрессы под влиянием химиотерапии. Природа создала арсенал белков и факторов, условно называемых белками теплового шока, для выживания в условиях воздействия всеми указанными шоками, если это является выигрышной стратегией для организма. Опухолевые клетки взяли на вооружение данный арсенал для обеспечения своей жизнедеятельности и защиты от организма. Фактор белков теплового шока HSF1 является примером раннего и массированного ответа клеток ответственным за их выживание и приспособление к условиям среды. Как было показано ранее, данный фактор не только регулируется через обратимое фосфорилирова-ние/дефосфорилирование, но и сам может ассоциироваться с регуляторными субъединицами фосфатазы белков 2А, перенаправляя её субстратную специфичность.
Взятые вместе: баланс фосфорилирования, динамика промежуточных филаментов и модуляция стрессового ответа являются ключевыми факторами выживания опухолевых клеток и объектами нашего исследования.
Цель работы
Создание адекватных моделей опухолевого процесса на лабораторных жи вотных с врождёнными иммунодефицитами и изучение факторов, влияющих н; выживание опухолевых клеток в условиях метастазирования.
Задачи исследования
1. Провести характеристику и отбор опухолевых штаммов и линий животных
пригодных для моделирования опухолевого роста со спонтанной диссемина
цией опухолевых клеток.
2. Разработать методы количественной оценки диссеминации опухолевых кле
ток в кровотоке иммунодефицитных животных, методы картирования по
верхностных антигенов опухолевых клеток и методы получения антител ]
детерминантам маркерных белков, включая посттрансляционные модифика
ции.
-
Подробно изучить роль фосфатаз белков и баланса фосфорилирова ния/дефосфорилирования во избежании опухолевыми клетками апоптоза вызываемого противоопухолевыми цитокинами. Разработать систему опре деления сайтов фосфорилирования регуляторных белков in vivo и in vitro.
-
Изучить специфическую значимость факторов теплового шока для выжива ния опухолевых клеток в условиях терапии и стрессорных воздействий орга низма хозяина.
-
Создать технологию повторного экспресс-анализа диссеминирующих клетої в кровотоке без применения меток и красителей
-
Разработать методы визуализации поведения промежуточных филаментов і опухолевых и дифференцирующихся клетках. Выяснить какие киназы і фосфатазы ответственны за поддержание структурного баланса онкофеталь ных промежуточных филаментов в опухолевых клетках
-
Оценить сочетанную значимость изученных факторов при избежании опу холевыми клетками систем иммунологического надзора организма.
[аучнап новизна
В работе впервые в мировой практике показано, что спонтанно диссемини-ующие клетки опухолей человека могут быть регистрированы и прослежены в ровотоке модельных животных пропорционально степени иммунной супрес-ии организма хозяина, а также в ряде случаев, пропорционально сроками раз-ития опухолей. Усиление способности к метастазированшо сопровождается еорганизацией антигенного профиля, причём в наибольшей степени это каса-тся антигенов участвующих в иммунологическом распознавании. В работе первые продемонстрировано, что реорганизация эмбрионально-іифференцировочного промежуточного филамента нестина в процессе митоза вязана с возрастающим фосфорилированием нестина по остатку треонина-316; :с!с2-киназа играет основную роль в зависимой от фосфорилирования модификации нестина в опухолевых клетках; кроме того, нестин фосфорилирован и его ікспрессия регулируется в согласованности с активностью другой фосфокина-;ы - cdk5. Выявлен ранее неизвестный факт подавления TNF-a , Fas и TRAIL-шосредованного апоптоза, вызываемого ингибированием фосфатаз белков эк-югенными токсинами и внутриклеточным ингибитором РР2А - I2PP2A, и что это юдавление реализуется через стимулирование каскада передачи сигнала мито-~ен активируемой киназы (Erk), и происходит на ранних этапах исполнения, до жтивации каспаз первой ступени. Также впервые было доказано, что фосфори-шрование фактора белков теплового шока HSF-1 по серину 230 усиливает грансактивационную активность HSF1 в клетках опухолей и приводит к уси-иенной экспрессии HSF-70, защищающих клетки от апоптоза.
Практическая значимость
В результате проведенных исследований разработаны новые подходы к созданию экспериментальных моделей спонтанного метастазнрования опухолей человека на модельных животных. Были созданы (а) новые линии высокомета-стазирующих опухолей, включая аутофлуоресцентные опухоли, наследственно меченные зелёным флуоресцентным белком, (б) методы визуализации и анти-
генного картирования диссеминирующих опухолевых клеток, (в) концепи вовлечённости фосфатаз белков и их ингибиторов в поддержание баланса ф< форилирования в клетке, регулирующего системы передачи сигнала, апопт стрессорный ответ и динамику цитоскелета клетки опухоли.
Эти данные будут использованы при создании новых диагностических и л ниторинговых подходов к биотерапии опухолей.
Данные, полученные в результате исследований по значению фосфорилиг вания в регулировании поведения опухолевых клеток, послужат основой д разработки новых модуляторов активности фосфатаз белков для терапии or холевого процесса, методов индивидуального моделирования опухолевого щ цесса больных для экспресс тестирования лекарственной чувствительности.
Апробация работы
Апробация работы состоялась 17 октября 2001 г. на совместной научн' конференции с участием лабораторий экспериментальной диагностики и би терапии опухолей, клинической иммунологи, фармакологии и токсикологи отдела экспериментальной химиотерапии, отделения трансплантации костно мозга, интенсивной химиотерапии и реанимации, отделения изучения нові противоопухолевых лекарств РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.
Основные положения диссертации представлены на конференции "AID Cancer & Related Problems", Санкт-Петербург. Май 6, 1995, 35 Annual Meetii of the American Society for Cell Biology, Вашингтон, США, декабрь 9-13, 199 International Conference Comparative Physiology and Biochemistry. Национальнь парк имени Крюгера, ЮАР 31 август - 5 сентября 1997,2nd International Symp sium on the Green-Fluorescent Protein, Сан-Динго, США, Май 1999, 19th Conve tion of Physiological Society of Japan, Каназава, Япония, Апрель 1998, The 8 , і и 10th Annual BioCity Symposium, Турку, Финляндия 1999, 2000, 2001, Molec lar Chaperones & the Heat Shock Response. Колд Спринг Харбор, США, Май 3-2000, Life in the Cold lllh International Hibernation Symposium, Юнгольц, Авс
рия, Август 13-18, 2000, NorFA conference on Stress and Apoptosis, Копенгаген, Дания, Сентябрь 2001, 2nd International Symposium on Signal Transduction, Люксембург, Январь 2002; Workshop on FRET microscopy, Шарлотсвиль, США, Март 2002.
Публикации
Материалы, изложенные в диссертации, оформлены в виде 27 публикаций, в том числе одного патента на изобретение.
Объем и структура диссертации
![Значение биохимических показателей в комплексной диагностике и мониторинге метастазирования в кости рака молочной и предстательной желез [Электронный ресурс]](/i/i/4427/199270.png "Значение биохимических показателей в комплексной диагностике и мониторинге метастазирования в кости рака молочной и предстательной желез [Электронный ресурс] Пашков Михаил Витальевич")
![Модель управления предотвратимыми факторами риска материнской смертности от акушерских кровотечений в современных условиях [Электронный ресурс]](/i/i/4322/183780.png "Модель управления предотвратимыми факторами риска материнской смертности от акушерских кровотечений в современных условиях [Электронный ресурс] Лялина Елена Александровна")
