Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
ГЛАВА II. Характеристика клинического материала и методы исследования 34
2.1 Пациенты и характеристика клинического, биопсийного материала 34
2.2 Реактивы и методы исследования 39
2.3 Статистическая обработка результатов исследования 41
Глава 3. Результаты исследований 42
3.1 Характеристика субпопуляций интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы методом проточной цитометрии 42
3.1.1 Исследования на материале хирургически удаленной опухоли 42
3.1.2 Возможности изучения субпопуляций интратуморальных лимфоцитов методом проточной цитометрии на материале кор-биопсии опухоли у больных раком молочной железы 44
3.1.3 Сопоставление субпопуляционного состава лимфоцитов в материале кор-биопсии и материале удаленной опухоли 53
3.2 Сопоставление состава интратуморальных лимфоцитов с клиническими характеристиками и морфологическими признаками у больных раком молочной железы 57
3.3 Влияние полиоксидония на субпопуляции интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы 63
Обсуждение 85
Выводы 92
Список литературы 94
- Реактивы и методы исследования
- Статистическая обработка результатов исследования
- Возможности изучения субпопуляций интратуморальных лимфоцитов методом проточной цитометрии на материале кор-биопсии опухоли у больных раком молочной железы
- Сопоставление состава интратуморальных лимфоцитов с клиническими характеристиками и морфологическими признаками у больных раком молочной железы
Введение к работе
Актуальность темы
В структуре онкологических заболеваний женского населения в России, как и в большинстве развитых стран мира, рак молочной железы (РМЖ) занимает первое место, причем отмечается рост как показателей заболеваемости, так и рост смертности. В России в 2007 году его доля составила 20%. 1 млн. новых случаев рака молочной железы ежегодно регистрируется в мире по данным Всемирной организации здравоохранения. В Москве и Санкт-Петербурге 5-летняя выживаемость при РМЖ составляет 59,3-59,6%. У вновь выявленных больных около 35% случаев составляют III-IV стадии. Отдаленные метастазы возникают у 50% больных раком молочной железы, медиана выживаемости больных с метастатическим раком молочной железы составляет 24-36 месяцев, и только 15% живут более 5 лет (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2009).
У больных злокачественными опухолями отмечаются значительные нарушения различных звеньев иммунного ответа организма. Проведенные исследования у онкологических больных указывают на снижение количества естественных киллеров, Т-хелперов, функциональной активности Т-лимфоцитов, увеличение Т-супрессоров и их функциональной активности.
Снижение уровня Т-клеточной инфильтрации опухоли имеет определенную связь с регионарным метастазированием или наличием микрометастазов (Паниченко А.В., 2002; Крохина О.В., 2003). Доказано, что увеличение количества интратуморальных Т-киллеров является фактором благоприятного прогноза у больных раком молочной железы, преимущественно без регионарного метастазирования (Артамонова Е.В., Тупицын Н.Н., 2005). Наибольшее значение имеет инфильтрация опухоли CD8+ лимфоцитами. Динамика субпопуляций интратуморальных лимфоцитов в процессе неоадъювантной химиотерапии РМЖ взаимосвязана с прогнозом заболевания (Субботина А.А., Тупицын Н.Н., 2009).
Доказано, что инфильтрация опухолевой ткани рака молочной железы цитотоксическими лимфоцитами (CD8+) является фактором благоприятного прогноза, а выраженная инфильтрация CD4+ лимфоцитами и макрофагами, напротив, ухудшает прогноз (DeNardo D.G. et al., 2011; Ruffel B. et al., 2012).
Прогностическая роль субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов при раке молочной железы также достаточно хорошо известна. При однофакторном анализе главенствующая прогностическая роль принадлежит CD8+ лимфоцитам (Артамонова Е.В., 2009). В отсутствие выраженной инфильтрации рака молочной железы CD8+ клетками CD4+ лимфоциты способствуют опухолевой инвазии и развитию отдаленных метастазов рака молочной железы путем влияния на протуморальную
активность опухолеассоциированных макрофагов (DeNardo D.G. et al., 2009). Совокупность этих данных позволила предположить, что три клеточных типа – CD4+ и CD8+ лимфоциты, а также CD68+ макрофаги – могут играть главную роль в прогнозе рака молочной железы. Предложена трехмаркерная иммунная сигнатура для более точной оценки прогноза у больных раком молочной железы (DeNardo D.G. et al., 2011). Иммунный профиль CD68LowCD4LowCD8High характерен для первичного рака молочной железы, который даже в случаях только хирургического лечения, характеризуется высокими показателями общей и безрецидивной выживаемости. Напротив, иммунные ответы CD68HighCD4HighCD8Low соответствуют группе больных с риском развития отдаленных метастазов и низкими показателями выживаемости.
Таким образом, установлены прогностически благоприятные иммунологические
характеристики интратуморальных лимфоцитов при раке молочной железы. Актуальной
является задача по поиску путей иммунотерапевтического воздействия на
субпопуляционный состав интратуморальных лимфоцитов с целью его коррекции и улучшения прогноза у больных. Решению данной актуальной задачи и посвящена наша работа.
Цель исследования
Изучение количественного состава интратуморальных лимфоцитов, динамики их субпопуляций при проведении иммунокорригирующей терапии рака молочной железы.
-
Изучить количественный субпопуляционный состав интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы (на материале хирургически удаленной опухоли) методом многопараметровой проточной цитометрии.
-
На материале опухолевой ткани, полученном при кор-биопсии, определить уровень субпопуляций интратуморальных лимфоцитов по следующим показателям:
-
общий уровень лимфоидной инфильтрации – количество CD45+ лимфоцитов по отношению к общему числу событий, набранных при проточной цитометрии;
-
процент зрелых Т-лимфоцитов (CD3+) среди лимфоцитов (CD45+);
-
процент зрелых CD4+CD3+ T-лимфоцитов;
-
процент зрелых T-цитотоксических лимфоцитов CD3+CD8+;
-
соотношение CD8/CD4;
-
процент активированных (регуляторных) CD4+CD25+ клеток;
-
процент NK-клеток – CD3-CD56+;
-
процент TNK клеток – CD3+CD56+.
-
Провести лечение препаратом «Полиоксидоний» больным раком молочной железы с оценкой клинических показателей и морфологических признаков его эффективности (индукция апоптоза)
-
Изучить динамику показателей интратуморальных лимфоцитов в процессе иммунотерапии полиоксидонием.
-
Сопоставить иммунологические изменения в ходе иммунотерапии с клиническими характеристиками, морфологическими признаками и рецепторным статусом опухоли
-
Определить показания для проведения иммунокорригирующей терапии у больных операбельным раком молочной железы.
Научная новизна
Впервые на достаточном клиническом материале проведен анализ
субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов больных раком молочной
железы. Уровень общей лимфоидной инфильтрации рака молочной железы определяется,
в первую очередь, Т-цитотоксическими клетками (CD8+). Установлено, что в материале
опухолей больных раком молочной железы преобладали зрелые Т-клетки (CD3+),
количество которых достигало 95,2% от числа лимфоцитов, в среднем 86,5±1,2%.
Количество CD4-лимфоцитов незначительно преобладало над количеством
цитотоксических лимфоцитов (CD8+) – в среднем 45,7% и 43,7% соответственно. Соотношение CD8:CD4 в целом по группе составило 1,09. Уровень клеток естественных киллеров (CD45+CD3-CD56+) был, как правило, незначительным и не превышал 5,29%. Т-регуляторные клетки находились в диапазоне от 0,58 до 9,13%, в среднем – 4,2±0,5%. Новым является факт, что в процессе иммунотерапии полиоксидонием большинство субпопуляций интратуморальных лимфоцитов не изменяются, вместе с тем, достоверно снижается количество интратуморальных естественных киллеров, а выраженность эффекта полиоксидония (индукция патоморфоза) определяется, в первую очередь, нарастанием пропорции интратуморальных CD4+ лимфоцитов.
Практическая значимость
Научно-практическое значение проведенной работы определяется двумя основными аспектами – диагностическим и лечебным.
В диагностическом плане убедительно доказана возможность проведения полноценного изучения субпопуляций интратуморальных лимфоцитов по материалу кор-биопсии методом многоцветной проточной цитометрии. Это дает основание для формирования групп больных, которым показана иммунотерапия в неоадъювантном режиме, т.е. до проведения хирургического лечения.
Лечебный аспект выполняемого диссертационного исследования заключается в том, что применение полиоксидония у больных раком молочной железы вело к развитию иммуно-опосредованного апоптоза. Данный феномен наблюдался у 30% больных. Также научно-практическое значение данной работы являются полученные сведения по целесообразности включения полиоксидония в арсенал препаратов, применяемых в неоадъювантном режиме у больных операбельным раком молочной железы.
Апробация диссертации
Апробация диссертации состоялась 30 октября 2013 года на совместной научной конференции подразделений: кафедры онкологии факультета последипломного образования ГБОУ ВПО «МГМСУ им. А.И. Евдокимова» и кафедры онкологии ГБОУ ВПО « I ММУ им. И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, а также отделений опухолей молочных желез, опухолей женской репродуктивной системы, радиохирургии и лаборатории иммунологии гемопоэза НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина» РАМН.
Личный вклад автора
Аавтором самостоятельно проведен аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме. Разработан дизайн исследования, статистическая обработка материала, полученном в ходе исследования. Под руководством и при непосредственном участии автора проведено внедрение новых форм диагностики и лечения рака молочной железы.
Автором осуществлен анализ, интерпретация собранных материалов, сформулированы выводы и практические рекомендации, оформлена диссертационная работа.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Научные положения соответствуют паспорту специальности 14.01.12 – «онкология», конкретно пункту 6.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе в 3 журналах, рекомендованных ВАК России.
Объем и структура диссертации
Реактивы и методы исследования
Иммунология рака – это одна из наиболее интригующих проблем онкологии. С одной стороны (теоретически) – здесь вс просто: антигенность опухолей доказана давно, и это положение является незыблемым и не подлежащим пересмотру [94, 42, 87, 147, 55, 90, 102]. С другой стороны (на практике) вс обстоит прямо противоположным образом: иммунокомпетентный организм человека или животного-носителя опухоли практически никогда не способен отторгать антигенные опухоли [144, 80, 156, 196]
Парадокс состоит в том, что организм не способен отторгать антигенные опухоли, а существование антиген-специфических противоопухолевых иммунных ответов является убедительно доказанным и неоспоримым [54, 157].
За долгую, более чем 50-летнюю историю развития и становления иммунологии рака открыты многие фундаментальные иммунологические феномены, расшифрованы механизмы цитотоксического действия лимфоцитов и антител, но практический вклад иммунологии в лечение рака и, в частности рака молочной железы, вс ещ остается незначительным. В последние два года наметился явный прорыв в данной области. Авторитетнейшие фундаментальные американские журналы PNAS (Proceedings of National Academy of Sciences of the USA) и Cancer Discovery опубликовали статьи, доказывающие главенствующую роль иммунной системы человека в прогнозе рака молочной железы [74, 161]. Открытия эти сделаны при изучении тонких взаимодействий между Т-хелперными (CD4), Т-цитотоксическими (CD8) лимфоцитами и макрофагами, присутствующими в ткани опухоли, то есть интратуморальными клетками иммунной системы. К аналогичным результатам пришли и отечественные, российские ученые, убедительно доказавшие важную прогностическую роль количества и качественного состава интратуморальных лимфоцитов, в особенности CD8+ Т-цитотоксических клеток в прогнозе рака молочной железы [4, 1]. Результаты этих работ проливают свет на то, какие клетки иммунной системы являются наиболее важными с точки зрения противоопухолевого иммунитета, и открывают перспективы поиска иммунологических путей воздействия для активации данных клеточных типов.
Для лучшего понимания этого вопроса остановимся на описании клеток-эффекторов противоопухолевого иммунитета и на том, как данные клеточные типы представлены в составе интратуморальных лимфоцитов. Цитотоксические реакции клеток иммунной системы в отношении раковых клеток реализуются непосредственно в опухоли. Именно по этой причине изучение уровней инфильтрации опухоли лимфоцитами, макрофагами, плазмоцитами привлекало внимание исследователей в течение длительного времени [14]. Вначале эти исследования велись на морфологическом уровне, затем методами иммуногистохимии и сравнительно недавно в арсенале подходов к количественному изучению субпопуляционного состава лимфоцитов появилась многоцветная проточная цитометрия.
Большинство авторов расценивали выраженную лимфоидную инфильтрацию опухоли, отмечаемую на морфологическом уровне, как проявление защитных функций организма и более благоприятного прогноза. Однако безоговорочно такую точку зрения принимать, по-видимому, нельзя: необходимо учитывать возраст больных, стадию заболевания, тип лечения и, конечно же, субпопуляционный состав и функциональную активность тумор-инфильтрирующих лимфоцитов [14], а также иммунофенотипические особенности опухолевых клеток [9]. Хотя лимфоциты и инфильтрируют многие мышинные и человеческие опухоли, но спонтанная регрессия опухолей наблюдается редко. Даже относительно значения воспалительных клеток в опухоли или окружающих ее тканях нет единства мнений [67, 68, 71, 202]. Вместе с тем, многие работы продемонстрировали связь повышенных уровней тумор-инфильтрирующих лимфоцитов с более хорошим прогнозом [67, 68, 202].
Однако простое допущение, что накопление лимфоцитов в опухоли является непременно благоприятным для больного может быть не соответствующим действительности. По данным отечественных и зарубежных авторов, выраженная лимфоидная инфильтрация встречается у 45-70% больных РМЖ [3, 51]. Большинство исследователей трактуют высокую степень интенсивности лимфоплазмоцитарной инфильтрации опухоли как признак благоприятного прогноза [17, 139, 30]. Другие исследователи отрицают или ставят под сомнение концепцию защитной роли лимфоидной инфильтрации опухоли [35, 38, 10]. Они считают, что наличие выраженной инфильтрации в большом проценте случаев должно теоретически приводить к регрессии или стабилизации опухолевого процесса, однако этого, как правило, в клинике не наблюдается. Так, Володько Н.А. (1988) [10] считает, что мононуклеарная инфильтрация при РМЖ не может являться показателем благоприятного прогноза, поскольку она встречается с одинаковой частотой и в группе с благоприятным прогнозом, и при агрессивном течении заболевания. Ею установлено, что лимфоциты, инфильтрирующие опухоль, могут проявлять как неспецифическую супрессорную, так и хелперную активность. Высокие уровни лимфоцитарной инфильтрации ассоциированы с увеличением выживаемости у больных моложе 40 лет [130] и с благоприятным прогнозом у части больных, опухоли которых сильно инфильтрированы макрофагами [150]. По данным Чобанян Н.С. [38] лимфоплазмоцитарная инфильтрация опухоли не оказывает существенного влияния на выживаемость больных, а пациентки молодого возраста при отсутствии инфильтрации вообще имеют более высокие показатели выживаемости.
Статистическая обработка результатов исследования
По данным Conha A. [70] стромальная лейкоцитарная инфильтрация рака молочной железы не зависит от экспрессии антигенов HLA II класса на опухолевых клетках. Различий в количественном составе и строении воспалительных инфильтратов между HLA-DR+ и HLA-DR- опухолями не обнаружено. Аналогичным образом, [207] не наблюдали корреляции между снижением экспрессии HLA II на раковых клетках и величиной воспалительного инфильтрата.
Рассматривая взаимосвязи иммунофенотипа раковых клеток с местными проявлениями иммунных реакций, важно учитывать, что мономорфная экспрессия или полное отсутствие того или иного антигена в пределах опухоли от одного больного наблюдается крайне редко. Значительно чаще имеет место гетерогенность опухолевых клеток по этому признаку, то есть различные участки опухоли экспрессируют молекулы HLA с различной интенсивностью. По этим причинам очень важно оценить уровень лимфоидной инфильтрации именно в той зоне опухоли, которая экспрессирует интересующий антиген.
При реализации подобного подхода выявлены интересные закономерности [107]. Уровни экспрессии различных молекул HLA-II коррелировали с плотностью локальной лимфогистиоцитарной инфильтрации (Ii: p=0,003; HLA-DR: p = 0,0005; HLA-DP: p = 0,0000005; HLA-DQ: p = 0,001). Следовательно, в большинстве случаев экспрессия Ii/HLA-D антигенов на раковых клетках была непосредственно взаимосвязана с уровнями близлежащей лимфогистиоцитарной инфильтрации. Однако в 26% рака молочной железы не отмечено связи между уровнями экспрессии HLA-II на раковых клетках и интенсивностью инфильтрации опухоли мононуклеарными клетками. Это явление названо неадекватной экспрессией Ii/HLA-D.
Другим количественным подходом, позволяющим точно оценить взаимосвязь экспрессии молекул HLA на опухолевых клетках с особенностями субпопуляций тумор-инфильтрирующих лимфоцитов является метод проточной цитофлуориметрии. Этим методом было установлено [195], что диапазон экспрессии молекул HLA-I составляет от 1 до 74% (среднее - 12,9%), HLA-DR - 1-69% (среднее - 14,3%). Экспрессия HLA-I коррелировала с уровнями С04-клеток (р 0,05) и С08-клеток (р 0,02). Пропорция CD8+HLA-DR+ клеток коррелировала с экспрессией на опухоли молекул HLA-I (р 0,001) и HLA-II (р 0,001). Аналогичным образом, активированные Т-хелперные клетки (CD4+HLA-DR+) коррелировали с экспрессией на опухоли молекул HLA-I (р 0,01) и HLA-II (р 0,02). Отмечена также корреляция уровней CD25+CD4+ клеток с экспрессией антигенов I (р 0,05) и II классов (р 0,03) гистосовместимости на опухоли. Вместе с тем, наличие трансферринового рецептора на тумор-инфильтрирующих лимфоцитах не было взаимосвязано с экспрессией антигенов гистосовместимости на клетках рака молочной железы. Эти данные убедительно свидетельствуют о важной роли опухолевых антигенов гистосовместимости в развитии противоопухолевого иммунитета при раке молочной железы.
Помимо лимфоцитарных субпопуляций (CD4, CD8 Т-клетки, CD20 В-лимфоциты) множество клеток миелоидной линии, в числе которых опухолеассоциированные макрофаги CD68+, инфильтрируют ткань рака молочной железы [76].
Роль макрофагов в противоопухолевом иммунитете остается неясной. Так, Fidler Т. [87], сообщает об увеличении скрытого периода возникновения опухоли у животных при введении им активированных in vitro макрофагов. В эксперименте на мышах при изучении роста трансплантируемых опухолей введение ингибиторов макрофагов укорачивало латентный период для аденокарциномы BSP3 [131]. В эксперименте на крысах было показано, что снижение инфильтрации опухоли макрофагами наблюдается при прогрессировании процесса [60]. Оригинальную точку зрения о возможности противоопухолевой активности высказали Окулов В.Б. [21]. По их мнению, в опухолевой ткани образуется ряд агентов, под влиянием которых макрофаги усиленно продуцируют ростовые факторы, ускоряющие пролиферацию клеток опухоли и повышающие их гетерогенность и инвазивность, то есть способствующие росту опухоли. По данным различных авторов, на долю макрофагов в лимфоплазмоцитарном инфильтрате опухоли приходится до 80% [137]. Содержание макрофагов в опухоли и РЛУ можно измерять на основании экспрессии панмакрофагального антигена СD163 с использованием отечественного МКА D11.
Большинство исследований у больных раком молочной железы свидетельствуют о том, что инфильтрация опухолевой ткани CD68+ клетками коррелирует с признаками неблагоприятного прогноза [53, 136, 75], более высокой степенью злокачественности опухоли [82, 191, 112], повышенным ангиогенезом [190, 187, 54, 67], снижением выживаемости без признаков заболевания [75, 187, 115, 62] и повышенным риском развития отдаленных метастазов в случаях изучения в сочетании с эндотелиальными маркерами и маркерами раковых клеток [155].
Для визуализации макрофагов в ткани рака молочной железы нами широко используются МКА D11 (CD163), полученные в лаборатории иммунохимии, руководимой академиком Г.И.Абелевым, ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН. Эти МКА позволяют выявлять весь спектр макрофагов, присутствующих как в строме опухоли, так и в зонах сплошного роста раковых клеток [22].
Возможности изучения субпопуляций интратуморальных лимфоцитов методом проточной цитометрии на материале кор-биопсии опухоли у больных раком молочной железы
В представленной работе нами оценено влияние разрешенного к клиническому использованию в онкологии иммуномодулятора полиоксидония на уровни интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы.
Иммунотерапия полиоксидонием проведена у 20 женщин, больных раком молочной железы. Диагноз во всех случаях был установлен на основании морфологического исследования опухолевой ткани. Больные проходили клиническое и инструментальное обследование, а также лечение в соответствии со стандартами, утвержденными Министерством Здравоохранения и социального развития РФ. 20 больным в возрасте от 32 до 78 лет (медиана – 53,5) проводилась кор-биопсия опухоли, последующее лечение полиоксидонием, радикальная операция. Полиоксидоний применялся внутримышечно в дозе 12 мг в 1-й, 2 й, 3-й, 5-й, 7-й дни (1-й день – день кор-биопсии). Препарат был предоставлен бесплатно в рамках протокола совместных исследований ФГБУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина» РАМН и НПО «Петровакс». Протокол был утвержден этическим комитетом РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН. Все больные подписывали информированное согласие. Операция осуществлялась на следующий день после последнего введения полиоксидония.
Инфильтративный протоковый рак установлен у 14 пациенток (70,0%), инфильтративный дольковый – 4 (20%), тубулярный – 1 (5%), медуллярный – 1 (5%). Рецепторы эстрогенов были положительны в 16 случаях из 20 (80%), рецепторы прогестерона – в 14 из 20 (70%). Статус по Her2/neu: 0 – 9 (45%), 1+ – 7 (35,0%), 2+ – 3 (15,0%), 3+ – 1 (5,0%). В одном из 3 случаев, расцененных как 2+, экспрессия рецептора расценена как положительная на основании результатов FISH-реакции. Таким образом, положительный статус по Her2/neu имел место у 2 больных (20%). Пролиферативный индекс (Ki-67) находился в диапазоне от 7 до 75% (среднее – 33,9±17,4%). У 12 больных установлена 2-ая степень злокачественности (70,6%), у 5 – 3-я (29,4%).
Размеры опухоли в основном (95,0%, 19 больных) соответствовали индексу рТ2, лишь в одном случае (5,0%) – рТ1. Метастазы в регионарные лимфатические узлы установлены у 14 (70,0%) больных (N1 – 7 /35%/, N2 – 7 /35%/), у 6 больных (30%) метастазы отсутствовали. Отдаленных метастазов у больных анализируемой группы не было. В соответствии с клиническими стадиями заболевания больные распределились следующим образом: I стадия – 1 (5%), IIа – 5 (25%), IIb – 7 (35%), IIIа – 7 (35%).
Иммунологическое исследование материала кор-биопсии и удаленной опухолевой ткани проводили методом 4-цветной проточной цитометрии с использованием следующих комбинаций антител: 1-ая проба – CD4/CD3/CD25/CD45, 2-ая проба – CD8/CD3/CD56/CD45. Анализ данных проводили с использованием программы WinMDI или (в случаях, требующих дополнительной компенсации параметров флуоресценции) - программы FCS, версия 3. Статистическая обработка проводилась с использованием программы SPSS/ Все больные хорошо переносили введение полиоксидония. Осложнений нами не отмечено. Ни у кого из больных во время проведения иммуномодулирующей терапии и в послеоперационном периоде не было инфекционных заболеваний.
Интересно отметить, что по результатам морфологического исследования хирургически удаленной опухоли у 6 из 20 больных (30%), получавших в неоадъювантном режиме только полиоксидоний, отмечен лечебный патоморфоз: у 3 больных – 1 степени, у двух больных – патоморфоз второй степени, у 1 больной – патоморфоз 4 степени. Нами оценены следующие иммунологические показатели интратуморальных лимфоцитов: Общий уровень лимфоидной инфильтрации - количество CD45+ лимфоцитов по отношению к общему числу событий, набранных при проточной цитометрии. Процент зрелых Т-лимфоцитов (CD3+) среди лимфоцитов (CD45+). Процент зрелых CD4+CD3+ Т-лимфоцитов. Процент зрелых Т-цитотоксических лимфоцитов CD3+CD8+ Соотношение CD8/CD4
Процент активированных (регуляторных) CD4+CD25+ клеток Процент NK-клеток - CD3-CD56+ Процент TNK клеток - CD3+CD56+
Субпопуляционный состав интратуморальных лимфоцитов по материалу исследования кор-биопсии рака молочной железы (до назначения полиоксидония) и удаленной опухоли (после назначения полиоксидония) представлен в предыдущем разделе.
Сравнительная оценка субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов, выделенных из удаленной опухоли, представлена в таблице 3.
Группа изученных опухолей, представленная в таблице 3, была неоднородна: у 20 больных исследование проводилось после применения полиоксидония, у 17 -полиоксидоний в неоадъювантном режиме не применяли. Сравнение этих групп больных представлено в таблице 3.14 Ни по одному из изученных показателей нами не установлено различий между группами больных, получавших полиоксидоний и не получавших данный препарат.
Сопоставление состава интратуморальных лимфоцитов с клиническими характеристиками и морфологическими признаками у больных раком молочной железы
Роль изучения интратуморальных лимфоцитов при раке молочной железы была подтверждена иммуногистохимией и проточной цитометрией на материале хирургически удаленной опухоли [4, 1, 27, 31, 75, 162]. Исследования кор-биопсии не нашли широкого применения, так как считается, что материала, получаемого при кор-биопсии, недостаточно для иммунологического анализа. Вместе с тем, именно данные, получаемые при кор-биопсии, могли бы быть использованы для планирования и проведения лечебных мероприятий (химиотерапия, иммунотерапия) в неоадъювантном режиме у больных с неблагоприятным прогнозом.
В работе Н.А.Субботиной и соавторов [27] показано, что иммуногистохимический анализ материала кор-биопсии с использованием люминисцентной микроскопии позволяет в полной мере охарактеризовать субпопуляционный состав интратуморальных лимфоцитов. Вместе с тем, иммуногистохимическая оценка позволяет оценить уровни интратуморальных лимфоцитов лишь полуколичественно, что является менее точным при оценке динамики изменений после проведенного лечения.
Прогностическая роль субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов при раке молочной железы также достаточно хорошо известна. При однофакторном анализе главенствующая прогностическая роль принадлежит CD8+ лимфоцитам [1]. В отсутствие выраженной инфильтрации рака молочной железы CD8+ клетками CD4+ лимфоциты способствуют опухолевой инвазии и развитию отдаленных метастазов рака молочной железы путем влияния на протуморальную активность опухолеассоциированных макрофагов [74]. Совокупность этих данных позволила предположить, что три клеточных типа – CD4+ и CD8+ лимфоциты, а также CD68+ макрофаги – могут играть главную роль в прогнозе рака молочной железы. При анализе общей выживаемости 179 больных раком молочной железы высокие уровни CD4+ лимфоцитов ухудшали прогноз (р=0,032), так же как и низкие уровни CD8+ клеток (р=0,012). При этом плотность макрофагов в опухолевых срезах не влияла на прогноз [75]. Следует отметить, однако, что выраженная макрофагальная инфильтрация опухоли, как правило, ассоциировалась с низкой реакцией CD8+ лимфоцитов. На основании этих данных предложена трехмаркерная иммунная сигнатура для более точной оценки прогноза у больных раком молочной железы [75]. Иммунный профиль CD68LowCD4LowCD8High характерен для первичного рака молочной железы, который даже в случаях только хирургического лечения, характеризуется высокими показателями общей и безрецидивной выживаемости. Напротив, иммунные ответы CD68HighCD4HighCD8Low соответствуют группе больных с риском развития отдаленных метастазов и сниженной выживаемостью.
В нашей работе впервые для оценки количественных взаимоотношений между субпопуляциями интратуморальных лимфоцитов применен метод 4-цветной проточной цитометрии. Установлено, что среди интратуморальных лимфоцитов рака молочной железы преобладают зрелые Т-клетки (CD3+), их субпопуляции CD4 и CD8 находятся в примерно равных количествах. Выявлены низкие уровни NK-клеточной инфильтрации рака молочной железы, что соответствовало данным зарубежных авторов [162].
Мы изучили влияние полиоксидония, применяемого в неоадъювантном режиме, на состав интратуморальных лимфоцитов при раке молочной железы. Полиоксидоний является синтетическим иммуномодулятором, влияющим преимущественно на клетки врожденного иммунитета. Иммуномодулирующие свойства полиоксидония являются основанием для его применения без предварительной оценки иммунного статуса. Вместе с тем, изучение субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов в процессе лечения полиоксидонием может способствовать отбору групп больных, у которых применение препарата наиболее обоснованно.
Режим введений полиоксидония был разработан совместно с НПО «Петровакс». Внутримышечное введение препарата в дозе 12 мг хорошо переносилось больными. Интересно отметить, что у 6 из 20 больных (30%) после применения полиоксидония в неоадъювантном режиме отмечен патоморфоз опухолевой ткани. В одном из этих случаев он расценен как патоморфоз 4 степени, то есть опухолевые клетки отсутствовали. Подобные изменения было бы трудно трактовать как доказательные без предварительной верификации диагноза. Именно поэтому, у всех больных раком молочной железы, которым в неоадъювантном режиме применялась иммунотерапия полиоксидонием верификация диагноза осуществлялась на основании морфологического изучения опухолевой ткани, полученной методом кор-биопсии. Следует отметить, что явления патоморфоза опухоли никогда не наблюдаются у пациенток, не получавших неоадъювантную полихимиотерапию, а в наших наблюдениях частота патоморфоза составила 30%. Несомненно, механизм данного явления является иммуно-опосредованным и требует дальнейшего детального изучения.
Основное внимание в работе было уделено динамике субпопуляций интратуморальных лимфоцитов в процессе неоадъювантной иммуномодулирующей терапии полиоксидонием. Наблюдаемые изменения в целом можно характеризовать как позитивные. При неизменном проценте зрелых Т-клеток в опухоли (CD3+) отмечено перераспределение субпопуляций лимфоцитов – снижение или повышение CD4+ лимфоцитов и разнонаправленные изменения процентного содержания CD8+ лимфоцитов. Отмечено некоторое нарастание общего уровня лимфоидной инфильтрации опухоли
