Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 10
I. 1. Эмбриональное развитие сосудов сетчатки в норме 10
I. 2. Особенности строения сосудистой системы сетчатки недоношенных детей 20
I. 3. Особенности пролиферативного процесса при ретинопатии недоношенных 21
I. 3. 1. Основные проявления ретинопатии недоношенных 21
I. 4. Влияние гипоксии и гипероксигенации на развитие сосудов сетчатки 24
I. 5. Факторы риска и основные тенденции в профилактике и лечении РН
31
1.6. Методы лечения ретинопатии недоношенных 39
ГЛАВА II. Материалы и методы 41
П. 1 .Экспериментальная часть 42
П.1.1. Разделение новорожденных животных на группы 43
П.1.2. Методика приготовления и исследования тотальных препаратов сетчатки 45
П. 1.3. Методика приготовления и исследования плоскостных парафиновых срезов тотальных препаратов сетчатки 48
П. 1.4. Методика приготовления и исследование полутонких срезов препаратов сетчатки 49
П.2.Клиническая часть 50
П.2.1 Разделение пациентов, страдающих ретинопатией недоношенных на группы и подгруппы 51
112.2. Распределение детей в группах и подгруппах в зависимости от массы тела 52
П.5. Статистическая обработка материала 52
ГЛАВА III. Результаты исследований .' 53
III. 1. Сравнительная характеристика групп по массе тела 53
Ш.2. Характер влияния гипоксии и гипероксии на пролиферативную активность сосудов сетчатки у новорожденных млекопитающих (крысы) 54
111.3. Характер влияния различных режимов выраженных колебаний парциального давления кислорода во вдыхаемом воздухе на пролиферативную активность собственных сосудов сетчатки у новорожденных млекопитающих (крысы) 61
Ш.4.Сравнительный анализ влияния изменений парциального давления кислорода во вдыхаемом воздухе и различных режимов проведения гипероксигенации на пролиферативную активность собственных сосудов сетчатки у новорожденных млекопитающих (крысы) 68
III.5. Сравнительный анализ изменения диаметра сосудов на полутонких срезах сетчатки в группах сравнения у новорожденных млекопитающих (крысы) 72
III. 6. Клиническая часть 80 >
Ш.6. 1. Взаимосвязь продолжительности пребывания недоношенных новорожденных на ИВЛ, кислородной палатке и кувезе с тяжестью ретинопатии недоношенных 80
III. 6. 1. Среднее количество дней на ИВЛ, кислородной палатке (60% 02), кювезе (40% 02) в группах исследования 80
III. 6. 2. Количество дней на искусственной вентиляции легких, кислородной палатке и кислородной маске в подгруппах исследования 81
III. 7. Динамика концентрации кислорода во вдыхаемой газовой смеси (Fi02) в группах сравнения 83
ГЛАВА IVОбсуждение результатов 86
Выводы 92
Список литературы
- Эмбриональное развитие сосудов сетчатки в норме
- Особенности пролиферативного процесса при ретинопатии недоношенных
- Методика приготовления и исследования тотальных препаратов сетчатки
- Характер влияния гипоксии и гипероксии на пролиферативную активность сосудов сетчатки у новорожденных млекопитающих (крысы)
Введение к работе
Пролиферативные заболевания сетчатки являются первой причиной слепоты и слабовидения, самыми распространенными из которых являются пролиферативная диабетическая ретинопатия, ретинопатия недоношенных, посттромботическая ретинопатия. Несмотря на то, что в литературе имеется много работ посвященных выявлению факторов риска, описания клиники и лечения этих заболеваний, причины возникновения пролиферативных изменений в сетчатке до сих пор не известны.
Совершенствование методов выхаживания новорожденных, внедрение в практику новых диагностических и лечебных технологий обеспечивает выживаемость детей с низкой и экстремально низкой массой тела, ранее считавшихся нежизнеспособными (Володин Н.Н., 2004; Антонов А.Г., 2004). Заболеваемость ретинопатией недоношенных (РН) детей, рожденных весом до 2000гр., по данным разных авторов составляет 17-35% по России и заняла лидирующее место среди причин слепоты с раннего детского возраста во всех развитых странах (А.В.Хватова с соавт.2000).
Общепризнано, что одним из основных факторов, ведущих к развитию ретинопатии недоношенных, является действие кислорода (Campbell К., 1951; Kinsey V., 1956). При критических состояниях у недоношенных одним из ведущих патологических проявлений является гипоксия - чаще дыхательная или циркуляторная. При лечении таких пациентов невозможно избежать применения оксигенотерапии. Поэтому в профилактике РН большое значение имеет выяснение роли кислорода и механизма его действия в развитии данного заболевания и пролиферативного процесса в сетчатке вообще.
Несмотря на большое количество экспериментальных работ по изучению влияния различных вариантов оксигенотерапии на развитие ретинопатии, на сегодняшний день отсутствуют четкие практические рекомендации по режимам ее проведения у недоношенных новорожденных с целью предотвращения
развития пороговой стадии заболевания. Очевидна сложность решения данной проблемы применительно к клинике: экспериментальная ретинопатия недоношенных воспроизводится у здоровых животных и гипероксигенация является единственным фактором, провоцирующим данное заболевание. При подборе режима оксигенации в неонатальных центрах приходится прежде всего учитывать особенности общего состояния новорожденного, которое, как правило, отличается высокой степенью тяжести с вовлечением практически всех органов и систем организма. Постоянно появляющиеся сообщения о выявлении новых факторов риска возникновения РН свидетельствуют о том, что данная проблема далека от разрешения. Тем не менее, к настоящему времени возникла необходимость систематизации уже известных факторов риска возникновения пролиферативных стадий ретинопатии недоношенных, в том числе местных, и выделение среди них наиболее значимых.
Выявление основных местных факторов риска возникновения патологической неоваскуляризации сетчатки и степень влияния на них концентрации кислорода во вдыхаемой ребенком газовой смеси позволят применять наиболее адекватные режимы кислородотерапии.
Цель работы: оценить влияние различных режимов проведения и отмены гипероксигенации на пролиферативную активность эндотелия сосудов сетчатки у новорожденных млекопитающих (крыс) и течение ретинопатии у недоношенных новорожденных.
Задачи исследования:
Выяснить характер влияния гипоксии, гипероксии, переменных режимов проведения оксигенотерапии и ее отмены на пролиферативную активность клеток сосудов сетчатки в соответствующих группах новорожденных млекопитающих (крысы).
Провести сравнительный анализ влияния гипоксии и различных режимов проведения гипероксигенации на пролиферативную активность собственных сосудов сетчатки у новорожденных млекопитающих (крысы).
Провести сравнительный анализ влияния гипоксии и различных режимов проведения гипероксигенации на сосудистый тонус.
Выявить связь изменений калибра сосудов сетчатки под влиянием гипоксии и различных режимов проведения гипероксигенации с пролиферативной активностью собственных сосудов сетчатки у новорожденных млекопитающих (крысы).
Провести сравнительный анализ влияния различных режимов проведения и отмены гипероксигенации на частоту и тяжесть возникновения ретинопатии у недоношенных детей.
6. Разработать объективные диагностические критерии, позволяющие
корректировать режимы проведения и отмены оксигенотерапии у недоношенных
детей.
Научная новизна и практическая значимость:
1. Впервые проведен сравнительный анализ влияния гипероксии, абсолютной гипоксии и переменных режимов гипероксигенации на пролиферативную активность клеток сосудов сетчатки с использованием объективных критериев оценки - иммуногистохимического окрашивания пролиферирующих ядер клеток с полуколичественным и морфометрическим анализом.
Впервые, в отличие от предшествующих исследований, показано влияние не «относительной», а абсолютной гипоксии на пролиферативную активность клеток сосудов сетчтаки при незавершенном эмбриональном ангиогенезе у новорожденных млекопитающих.
Показана взаимосвязь степени дилятации сосудов сетчатки - основного фактора риска патологической неоваскуляризации при РН - с различными режимами проведения гипероксигенации у новорожденных млекопитающих.
Проведен статистический анализ влияния различных режимов проведения и отмены гипероксигенации на частоту и тяжесть пролиферативних стадий ретинопатии у недоношенных детей.
Выданы практические рекомендации по оптимизации режимов выведения недоношенных детей из условий гипероксии с целью уменьшения частоты возникновения и тяжести РН.
Основные положения, выносимые на защиту:
Низкая концентрация кислорода во вдыхаемой газовой смеси не оказывает значимого повышения пролиферативной активности сосудов сетчатки у новорожденных млекопитающих. Пролиферативная активность клеток сосудистой стенки сетчатки резко возрастает при использовании режимов оксигенации с большой амплитудой колебаний парциального давления кислорода во вдыхаемой газовой смеси.
Одним из значимых факторов, влияющих на пролиферативную активность сосудов сетчатки является степень дилятации ретинальных сосудов.
Быстрое снижение концентрации кислорода во вдыхаемой новорожденным газовой смеси является фактором риска возникновения и быстрого прогрессирования пролиферативных стадий ретинопатии недоношенных.
Феномен резкой вазодилятации, способствующий повышению пролиферативной активности клеток сосудов сетчатки, а также являющийся основным фактором риска пролиферативных стадий ретинопатии недоношенных, проявляется как реактивное состояние на неадекватные режимы отмены оксигенотерапии.
С целью сокращения частоты и тяжести пролиферативных стадий ретинопатии недоношенных снижение концентрации кислорода во вдыхаемой новорожденным газовой смеси при гипероксигенации должен подбираться индивидуально. Основным критерием адекватности режимов отмены оксигенотерапии является степень дилятации сосудов глазного дна.
Эмбриональное развитие сосудов сетчатки в норме
Исследование развития сосудистой системы сетчатки, начатое около двух веков назад, по-прежнему привлекает интерес. Увеличение частоты возникновения тяжелой патологии сетчатки, сопровождающейся патологическим ангиогенезом, привело к необходимости понимания основных процессов закладки и нормального развития ретинальных сосудов. Несмотря на большое число научных работ, применение различных экспериментальных моделей, совершенствование гистологических и иммуногистохимических методов исследования, механизмы развития сосудистой системы сетчатки до настоящего времени остаются спорными.
У человека внутренние сосудистые сплетения сетчатки начинают развиваться на стадии 14-16 недель гестации (в области диска зрительного нерва) и достигают ога serrata с назальной стороны на 36 неделе, а с темпоральной — на 40 неделе беременности [227, 158, 252, 263].
Формирование глубоких сосудистых сплетений, граничащих с внутренним ядерным слоем, начинается позже, около 24-ой недели и продолжается до рождения. Области, такие как перифовеа остаются аваскулярными на протяжении жизни человека [133, 158, 265].
Формирование кровеносных сосудов происходит за счет двух принципиально разных механизмов — васкулогенеза и ангиогенеза [273, 276, 277, 37].
Под васкулогенезом понимают способ первичного образования сосудов из клеток-предшественников эндотелиоцитов (ангиобластов, гемангиобластов) [273, 276,277,63,136].
Долгое время считалось, что васкулогенез встречается только в период эмбриогенеза. Однако исследования последних лет внесли изменение в представления о процессе васкулогенеза и показали его причастность к новообразованию сосудов у взрослых. Были выделены эндотелиальные клетки-предшественники (Endothelial Progenitor Cells, ангиобласты) из костного мозга взрослых (животных и человека). Было показано, что периферическая кровь взрослого человека и животных таюке содержит ангиобласты, которые участвуют в образовании новых сосудов. Этот процесс было предложено называть постнатальным васкулогенезом [220, 235, 236].
При ангиогенезе образование сосудов происходит за счет отпочковывающихся эндотелиальных клеток от функционирующих кровеносных сосудов [280, 277, 278].
У позвоночных начальные стадии васкулогенеза наиболее полно изучены на хориоаллантоисе куринных эмбрионов. Показано, что предшественниками эндотелиоцитов у них являются гемангиобласты и ангиобласты [200, 180, 181, 276, 327]. Однако не вполне понятно насколько корректно использование полученных данных для описания развития сосудов в развивающемся эмбрионе.
Гемангиобласты обладают способностью дифференцироваться как в эндотелиоциты, так и в клетки крови. Ангиобласты не связаны с гемопоэзом и являются предшественниками только эндотелиальных клеток. Установлено, что ангиобласты обладают достаточно высокой инвазивностью. Поэтому кровеносные сосуды в различных частях зародыша и в зачатках его органов могут развиваться как из ангиобластов местного происхождения, так и из инвазивных ангиобластов. Эти два процесса названы соответственно васкулогенезом 1-го и 2-го типа [249, 130].
Обнаружено, что на ранних стадиях васкулогенеза, ангиобласты выделяют вещества типичные для зрелого эндотелия сосудов, а именно фибронектин, ламинин, CD31 (platelet endothelial cell adhesion molecule), рецепторы ангиопоетина (Tie-2) и сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и тем самым инициируют дифференцировку первичных (зачаточных) сосудов [276, 90, 87, 37, 325].
Таким образом, в период эмбриогенеза описано образование изолированных друг от друга островков примитивного эндотелия, превращающегося в первичные кровеносные сосуды, названные протокапиллярами.
В современной эмбриологии физиологический смысл и эволюция протокапилляров трактуется по-разному.
Одни авторы считают, что первичное диффузное протокапиллярное русло ремодулируется во вторичное, органоспецифическое гемомикроциркуляторное ложе. Предполагалось, что этот переход проявляется гибелью и редукцией части протокапилляров в сосудистых сетях артериолярного и венулярного звеньев за счет морфофункциональной перестройки сохранившихся первичных капилляров и новообразующихся на их основе вторичных (окончательных) капилляров [35, 36, 11, 181, 276, 277, 278, 87, 136, 327].
Данная концепция означает, что в раннем пренатальном онтогенезе центральные и периферические отделы системы кровообращения формируются раздельно, а затем по механизму встречного (от центра к периферии и от периферии к центру) роста соединяются [11, 35, 36, 87, 136, 327, 181, 277].
Однако имеются данные, что протокапилляры в конструировании эмбрионального внутриорганного кровеносного русла не участвуют. Их наличие в развивающихся тканях плода человека отражает собой всего лишь проявление в пренатальном онтогенезе филогенетически более древнего вида роста сосудов, утратившего у высших млекопитающих и человека свое прежнее значение.
Особенности пролиферативного процесса при ретинопатии недоношенных
Результатом внедрения новых технологий, позволивших выхаживать детей, рожденных раньше срока, явилось резкое возрастание среди них числа слепых и слабовидящих [6, 9, 13, 15, 33, 34, 41, 108, 323].
Одним из первых офтальмологов, обративших внимание на появление ретрохрусталиковой фиброваскулярной ткани у недоношенных детей, был Terry (1942), предполагавший, что ее источником является фетальная интраокулярная сосудистая система («первичное стекловидное тело») [310, 274]. Начался поиск причин и механизмов развития заболевания, названного «ретролентарная фиброплазия».
Было замечено, что заболевание развивается у детей рожденных до 36 недели гестации и имеющих массу тела при рождении менее 2500г и длину тела до 45 см [5, 18, 10, 14, 19, 24, 66, 73, 74, 83, 141, 144, 251, 252, 253, 286, 310, 320].
Актуальной проблемой было определение единого критерия жизнеспособности недоношенного ребенка, который был принят в 1974 году на конференции ВОЗ: вес ребенка при рождении не менее 500 грамм, срок гестации не менее 22 недель [61, 307]. В России эти критерии жизнеспособности были введены в 1992 г. [10].
Термин «ретинопатия недоношенных» предложил Parker Heath, который в 1956г. был признан, как наиболее точно отражающий процесс развития заболевания, тогда как «ретролентарная фиброплазия» определял лишь конечную его стадию; некоторые авторы придерживаются этого термина до настоящего момента [2, 3, 38].
Ретинопатия недоношенных (РН) - витрео-ретинальное заболевание недоношенных детей, в основе которого лежит незрелость сетчатки к моменту преждевременных родов [22, 40, 309, 142, 144, 147, 204]. Патологическая пролиферация новообразованных сосудов сетчатки и следующая за ней пролиферация фиброзной ткани являются основными проявлениями РН. Особенностью патологических новообразованных сосудов, отличающей их от нормальных сосудов сетчатки является экстраретинальный рост (в направлении полости стекловидного тела) по границе васкулярной и аваскулярной ее зон [185, 198]. Чем меньше площадь перфузируемой сетчатки, тем более тяжело и быстро протекает заболевание.
Классификация ретинопатии недоношенных.
До 1982 г единой классификации данного заболевания не существовало. На съезде офтальмологов, организованном Hindle в Калгари (Канада 1982), была принята Международная Классификация ретинопатии недоношеных (в основу которой легла классификация Flynn J.T.), дополненная в 1984г [71, 72,143, 288, 311,313].
Предложено разделение ретинопатии недоношенных в зависимости от: 1) активности процесса; 2) локализации (зоны сетчатки); 3) протяженности пролиферативного процесса, 4) от стадии заболевания.
Стадии РН. стадия - формирование демаркационной линии, которая представляет собой тонкую белую линию вдоль границы перфузируемой и непрефузируемой сетчатки. Сопутствующими офтальмоскопическими признаками являются нормальные или умеренно суженные на всем протяжении ретинальные сосуды. Гистологическое исследование сетчатки показало, что демаркационная линия представляет собой локальную гиперплазию веретенообразных и незрелых эндотелиальных клеток.
2 стадия - преобразование демаркационной линии в вал, представляющий собой объемную структуру, возвышающуюся над плоскостью сетчатки, белого или розового цвета. Выявляются извитые и расширенные перед валом сосуды сетчатки, при прогрессировании процесса возникают артериовенозные шунты, нарушается дихотомическое деление сосудов, что проявляется возникновением «щеток» на их концах.
3 стадия характеризуется развитием экстраретиналъной фиброваскулярной пролиферации в проекции вала. В патологический процесс вовлекается стекловидное тело, по которому происходит экстраретинальный рост фиброваскулярной ткани. Выявление экстраретинального роста сосудов на 5 смежных или 8 суммарных меридианах определяется как пороговая стадия, и является показанием к срочному лечению - лазеркоагуляции или криокоагуляции сетчатки, которая должна быть произведена не позднее 72 часов от момента выявления.
4 стадия характеризуется частичной отслойкой сетчатки, которая может быть спровоцирована как тракцией растущей по структурам стекловидного тела фиброваскулярной ткани, так и экссудативным процессом. В зависимости от вовлечения в процесс макулы 4 стадию подразделяют на: 4А - локальная отслойка сетчатки без вовлечения макулы и 4В - с вовлечением центральной зоны.
Методика приготовления и исследования тотальных препаратов сетчатки
После короткой промывки в PBS препарат сетчатки погружали в раствор первичного антитела, содержащий также 1% нормальную сыворотку козы и 0,1% Triton Х-100. Обработка свободно плавающей сетчатки в растворе первичного антитела проводили в течение 12 часов при температуре + 4С. В качестве первичных использовали антитела к следующим маркерам: фактору фон Виллебрандта (vWF) (Chemicon, USA), KI-67, ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA) (Novo Castra, USA). Антиген vWF является маркером эндотелиальных клеток, a KI-67 и PCNA - маркерами пролиферации клеток. Затем после троекратной промывки в PBS сетчатки обрабатывали вторичными антителами: антимышиными, конъюгированными с флуоресцентным красителем Су-2, и антикроличьими, конъюгированными с флуоресцентным красителем Texas Red, (Jackson, USA). Обработку вторичными антителами в разведении 1:200 в PBS с добавлением 0,1% Triton Х-100 проводили 2 часа при комнатной температуре. Затем, после тщательной 5-кратной промывки в PBS, сетчатку помещали на предметное стекло, покрывали глицерином и покровным стеклом. Изучение сосудистой системы сетчатки проводили с помощью светового микроскопа Olympus СХ41 с флуоресцентной насадкой и цифровой камерой (Olympus, Camedia С - 4000), а также с помощью конфокального микроскопа фирмы «Leica». Анализ пролиферативной активности сосудов проводили посредством измерения средней интенсивности флуоресценции клеток сосудов сетчатки. Изображение окрашенных сосудов вводилось с помощью цифровой камеры и оценивалось с помощью программы для морфоденситометрии (Программа Lucia Morpho (фирма Nikon). В качестве единицы измерения была выбрана условная единица (УЕ) измерения -«интенсивность свечения», которая является суммой интенсивности свечения (площадь свечения х интенсивность свечения) отдельных точек (пикселей) в исследуемом поле зрении.
Глаза 7, 15-дневных крысят приблизительно 1,5 - 2,5 мм в диаметре препарировались под бинокулярным микроскопом. После срединного разреза в области лимба удалялась роговица, а затем и хрусталик, после чего сетчатку отслаивали от хориоидеи и склеры. Для лучшего распрямления сетчатки было сделано 4-5 надрезов по направлению к диску зрительного нерва.
Затем сетчатка помещалась между двумя фильтровальными прокладками, смоченными в физиологическом растворе в специальную кассету. После чего кассета помещалась в 4% раствор формальдегида на 3 - 4 часа. Затем образцы проводили по батарее спиртов и ксилолов, заливали в парафин по стандартной методике. Использовали парафин, с температурой плавления 54С (Германия). Затем с помощью одноразовых лезвий марки R35 на ультратоме 1У (LKB, Швеция) готовили серийные парафиновые срезы толщиной 3-5 мкм и наносили их на стекла с адгезивным покрытием (полилизиновые), депарафинировали по стандартному протоколу. Далее срезы по 5 минут промывали в деионизированной дистиллированной воде и фосфатном буфере (рН 7,4). Все использованные в иммуногистохимических реакциях растворы готовили только на деионизированной воде.
Предварительная обработка срезов производилась по методу восстановления антигенных детерминант ткани по методике Shi S-R и соавт. (1997) с помощью предварительной обработки срезов, погруженных в ЭДТА буфер (рН 8,7) в микроволновой печи при мощности 690 Вт 2 раза по 5 минут. Затем срезы охлаждались 20 минут при комнатной температуре, промывались
PBS 2 p. x 10 мин. и на них наносились первичные антитела. Инкубация с первичными антителами длились 18 часов при 4С. Затем срезы тщательно отмывались в буфере 3 р. х 15 мин., и первичные антитела визуализировали с помощью системы EnVision (anti-mouse и anti-rabbit, фирмы DAKO, Дания) по прилагаемой прописи. Срезы докрашивали гематоксилином Майера течение 2-5 минут. В качестве контроля использовались соответствующие позитивные и негативные контроли - иммунные и не иммунные сыворотки.
Интенсивность иммунногистохимической реакции в каждом препарате контролировалась под микроскопом (Olympus AN3, Япония) с встроенной цифровой камерой (Olympus DP50, Япония) с последующим сохранением на CD-диске. Анализ пролиферативнои активности проводился по полуколичественному методу. Оценка пролиферации проводилась двумя экспертами по следующим критериям: «-» (или 0 баллов) отсутствие окраски ядер эндотелиальных клеток; «+»(или 1 балл) окраска единичных ядер эндотелиальных клеток в отдельных сосудах; «++» (или 2 балла) окраска групп ядер эндотелиальных клеток в отдельных сосудах; «+++» (или 3 балла) окраска ядер эндотелиальных клеток в большинстве сосудов.
Характер влияния гипоксии и гипероксии на пролиферативную активность сосудов сетчатки у новорожденных млекопитающих (крысы)
Одной из самых популярных теорий патогенеза РН и других пролиферативных заболеваний (сопровождающихся новообразованием сосудов) является т.н. «гипоксическая теория», согласно которой образование новых сосудов в эмбриональной сетчатке и неоваскуляризация при патологии сетчатки имеют много общего и связаны с выделением вазопролиферативного фактора в ответ на гипоксию [143, 225, 226, 228].
Впервые на взаимосвязь между ишемической сетчаткой и патологической неоваскуляризацией указал Михаельсон, который выдвинул гипотезу, что формирование новых сосудов от ретинальных вен является ответом на накопление вазоформативного фактора в ишемической сетчатке [226].
Однако вскоре выяснилось, что одним из основных факторов риска возникновения ретинопатии недоношенных является не гипоксия, а гипероксигенация [99, 255]. Сложившееся противоречие между безусловной логикой «гипоксической» теории патогенеза патологического роста новообразованных сосудов сетчатки и важной роли повышенного содержания кислорода во вдыхаемом воздухе и крови у недоношенных новорожденных при развитии пролиферативных стадий ретинопатии не разрешено до настоящего времени.
В результате экспериментальных и клинических исследований было выявлено, что во-первых, пролиферативная ретинопатия хорошо воспроизводится у здоровых доношенных млекопитающих только при использовании гипероксигенации, причем тем чаще, чем больше амплитуда изменений парциального давления кислорода во вдыхаемой газовой смеси [258, 77, 103]; во-вторых, дополнительное назначение кислорода с начальными, «пороговыми» стадиями и даже злокачественными формами РН приводило к ремиссии пролиферативного процесса [260, 261]. Однако в доступной для нас литературе мы не встретили работ посвященных влиянию собственно гипоксии на прлиферативную активность сосудов сетчатки и течение ретинопатии недоношенных. Спорным является вопрос о корректности применения термина «относительная гипоксия» для описания режимов резких перепадов концентрации кислорода во вдыхаемой газовой смеси, используемых у новорожденных млекопитающих с незавершенным ангиогенезом. Патофизиология этого состояния, вероятно, значительно сложнее.
Иммуногистохимическое исследование плоскостных срезов тотальных препаратов сетчатки показало, что изменение среднего числа ядер клеток сосудов окрашенных маркерами пролиферации (PCNA, KI-67) коррелирует с показателями уровня кислорода во вдыхаемой газовой смеси и выявило снижение пролиферативной активности клеток сосудов у новорожденных крысят в группе гипоксии, подвергавшихся 11% 02 в течение 7 суток по сравнению с контрольной группой и выраженное снижение пролиферативной активности клеток сосудов в группе гипероксии (50% 02 в течение 7 дней) по сравнению с контрольной и группой гипоксии.
В нашем исследовании пролиферативная активность клеток сосудов сетчатки резко отличается в зависимости от режимов изменения парциального давления кислорода во вдыхаемой газовой смеси и демонстрирует выраженное повышение их пролиферативной активности в группе с переменным (50% - 11%) режимом оксигенации по сравнению с контрольной группой и резкое повышение в группе с переменным (100% - 20,6%) режимом оксигенации по сравнению как с контрольной, так и с группой гипероксия 50%-гипоксия 11% режимом оксигенации. Иммуногистохимическое исследование плоскостных срезов тотальных препаратов сетчатки показало, что изменение среднего числа ядер клеток сосудов окрашенных маркерами пролиферации (PCNA, KI-67) резко отличается в зависимости от возраста животных, но еще больше зависит от режимов оксигенации вдыхаемой ими , причем исследуемые параметры в некоторых группах при данном методе исследования отличались почти в 10 раз.
Так, минимальные значения пролиферативной активности клеток сосудов были выявлены в группе 2 (гипероксия), максимальные в 4 группе (гипероксия 100% -нормоксия). В группе 1 (гипоксия) исследуемые параметры были достоверно ниже, чем в контрольной группе того же возраста и значительно ниже, чем в обоих группах с резкими колебаниями содержания кислорода во вдыхаемой газовой смеси.
Таким образом, проведенное исследование не выявило линейной зависимости пролиферативной активности клеток сосудистой стенки сетчатки от парциального давления кислорода во вдыхаемой газовой смеси - она была ниже нормы как при гипероксии, так и при гипоксии и демонстрировала максимальные значения при резкой отмене предельной концентрации кислорода (100%) во вдыхаемом воздухе.
Известно, что местным фактором риска возникновения неоваскуляризации при ретинопатии недоношенных являются дилятация сосудов сетчатки [193, 284, 285]. В современной Международной классификации ретинопатии недоношенных этот фактор не учитывается как главный. Классификация, предложенная Kingham (1978) справедливо акцентирует внимание на изменении калибра и извитости сосудов, как в центральной зоне, так и на периферии, подчеркивая, что именно эти признаки [193] являются главными критериями прогрессирования заболевания. Степень дилятатции сосудов сетчатки напрямую коррелирует с тяжестью РН, достигая крайних значений при «плюс»-болезни [31].
