Введение к работе
Актуальность проблемы
В начале 1970-х годов возникло новое направление хирургии сетчатки – эндовитреальная хирургия. Благодаря этой технологии появилась возможность проводить операции в самых тяжелых случаях, когда отслойка сетчатки сопровождается грубыми изменениями стекловидного тела при наличии спаек, шварт, гемофтальма (Антелава Д.Н. и др., 1986; Machemer R. et al., 1971).
Одним из основных нововведений в области хирургических технологий является создание мощных источников света и эндоиллюминационных систем. Впервые внешний щелевой осветитель был использован в начале 1970 года. В 1976 году G.A. Peyman использовал оптическое волокно, вводимое в полость стекловидного тела, в процессе проведения 20G 3-х портовой витрэктомии. В последующем различные типы широкоугольных эндоиллюминационных источников света стали доступны для использования и стали стандартными инструментами для эндоиллюминации при pars plana витрэктомии. (Peyman G.A., 1976; Ryan E.H., 1997)
Новые источники света на основе ксенона и паров ртути значительно увеличили мощность, позволяя достичь достаточной освещенности. Однако естественное желание хирурга достичь наибольшей яркости освещаемой поверхности входит в противоречие с риском фототоксического воздействия на сетчатку, поэтому стремление к максимальной освещенности операционного поля должно быть сбалансировано мерами, защищающими сетчатку от повреждения (Chow D.R., 2011; Smith B.T., Belani S., 2005; van den Biesen P.R. et al., 2000; . et al., 1968; Gandorfer A. et al., 2003; Grisanti S. et al., 2004).
По мнению ряда авторов, основную фототоксическую опасность для сетчатки представляет свет в ультрафиолетовой (УФ) и фиолетово-синей области спектра. Свет этих длин волн способен запускать деструктивные фотохимические реакции свободно-радикального окисления (Marmor M.F. et al., 1980; Algvere P.V. et al., 2006; Ham W.T. et al., 1980, 1984; Flynn H.W. et al., 1988; Brod R.D. et al., 1989; Rattner A. et al., 2008).
Снижению фототоксической опасности для сетчатки способствует использование в хирургическом осветительном оборудовании стандартных фильтров, отсекающих нижние волны спектра и дополнительных фильтров для верхних волн спектра. Однако проведенный анализ многочисленных исследований в области фотоиндуцированных повреждений сетчатки свидетельствует о том что, не смотря на соответствие выпускаемого осветительного оборудования современным международным стандартам технического регулирования и использование светоотсекающих фильтров, ряд авторов отмечает проявление фототоксических эффектов в послеоперационном периоде (Berler D.K., Peyser R., 1983; Dawson W.W., 1976; Azzolini C. et al., 1994; Kremers J.J.M., 1988; Meyers S.M. et al., 1982; Morgan J.I. et al., 2008; Reichel E., 1994; Rossi T. et al., 2009).
Использование клеточных культур в качестве тест-систем оценки фототоксического потенциала различных источников света, находясь в рамках, предписанных международными стандартами испытаний биологической безопасности (клеточная концентрация, входящие в состав питательных сред компоненты, условия инкубирования, буферные среды), тем не менее, имеют множество вариаций культивирования и, как следствие, присущие каждой конкретной тест-системе преимущества и недостатки. Использование клеточного материала человека наиболее приближено к определению факторов риска фототоксичности различных источников света, однако получение дифференцированных клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ) имеет высокую вероятность контаминации РПЭ с клетками нейральной сетчатки и элементами стекловидного тела. К тому же исследование фототоксичности in vitro на монослойной культуре РПЭ позволяет прогнозировать только острый фототоксический эффект в тестах in vivo на животных и человеке не выявляя фототоксический потенциал и непрямые механизмы фототоксичности (ЕАSС, 2012; Пеннияйнен В.А., Лопатина Е.В., 2005).
В последние годы в экспериментальной биологии значительное внимание уделяется разработке методов культивирования, при которых сохраняется трехмерная структура соматических тканей с характерными для них межклеточными взаимодействиями и поддержанием достаточно длительное время морфологии и функционального состояния. В международной номенклатуре эти методы культивирования обозначаются как 3D-система (three dimensional system). Используемая нами культура клеток РПЭ человека во вторичноприкрепленной 3D (сфероидной) форме позволяет сохранить клетки в эпителизованном функциональном состоянии, что приближает эту модель к нативным тканям. В плотном компактном сфероиде клетки РПЭ сохраняют поляризацию, характерную для эпителиальных тканей, экспрессируя на поверхности ламинин и коллаген, посредством которых хорошо защищены от разного рода воздействий, что кардинально отличает эту культуру от монослойных (2D) культур РПЭ. Однако в настоящее время отсутствуют данные по оценке фототоксического потенциала различных источников света на этой культуре клеток (Сабурина И.Н., Репин B.C., 2010).
Таким образом, на сегодняшний день нет единого мнения о величине фототоксической опасности источников эндовитреального освещения, остаются дискутабельными вопросы выбора биологических тест-систем в качестве адекватного объекта исследования in vitro, не определены сроки и порядок проведения экспериментальных исследований культурального материала, актуальными остаются вопросы качественной и количественной подготовки клеточных культур для проведения всесторонней оценки величины и выраженности фототоксической нагрузки.
Исходя из вышесказанного, в настоящий момент существует объективная необходимость детального изучения свойств, применяемых осветительных систем и выявление безопасных параметров воздействия, что может быть проведено на монослойной 2D и сфероидной 3D культуре клеток РПЭ человека.
Цель исследования. Оценка параметров фототоксического действия ксенонового и ртутного источников света операционных осветителей на морфологические свойства изолированных клеток ретинального пигментного эпителия человека и подбор экранирующего светофильтра в эксперименте.
Задачи исследования
1.Провести теоретические расчеты и экспериментальное обоснование биологически опасных и безопасных параметров светового воздействия ксенонового и ртутного источников света на клеточные структуры сетчатки.
2.Исследовать фототоксическое действие ксенонового и ртутного источников света на 2D культуру ретинального пигментного эпителия человека и сфероидную 3D культуру ретинального пигментного эпителия человека.
3.Подобрать экспериментальным путем светофильтр, экранирующий культуры клеток ретинального пигментного эпителия человека от повреждающего действия ксенонового и ртутного источников света.
4.Оценить ультраструктурные изменения культуры клеток ретинального пигментного эпителия человека после фототоксического действия ксенонового и ртутного источников света и фотозащитного действия подобранного светофильтра.
Научная новизна результатов исследования
1.Впервые показано, что встроенные светофильтры ртутного эндовитреального операционного осветителя допускают до 40% синего излучения в полосе пропускания видимого белого света, что способно оказывать фототоксическое и апоптотическое действие.
2.Впервые показано, что волновые и энергетические параметры ксенонового и ртутного источников света, при временных интервалах свыше 30 минут и расстоянии 5 мм, в культуре клеток ретинального пигментного эпителия человека, являются активаторами дегенеративных процессов индуцированного апоптоза замедленного действия, что проявляется повреждением цитоскелета, клеточных ядер и крипт митохондрий.
3.Впервые установлено, что применение светофильтра, подобранного экспериментальным и расчетным путем, отсекающего синее смещение видимого спектра белого света в интервале длин волн от 410 до 475нм препятствует фототоксическому повреждению линейных 2D и сфероидных 3D культур ретинального пигментного эпителия, вне зависимости от используемого осветителя.
Практическая значимость результатов исследования
1.Впервые показано, что клеточные культуры ретинального пигментного эпителия 2D и 3D форм являются адекватными объектами для оценки фототоксического воздействия ртутных и ксеноновых эндовитреальных осветителей и могут применяться для оценки величины фототоксической опасности в хирургическом осветительном оборудовании.
2.Светоиндуцированные фотоповреждения, вызванные современным хирургическим осветительным оборудованием, не провоцируют быстрой гибели клеточных культур, однако накопление факторов апоптоза замедленного типа способно оказывать патологическое влияние в течение длительного периода после оперативного вмешательства, а значит необходима интра- и послеоперационная патогенетически ориентированная терапия у этой категорией пациентов.
3.Осветители, используемые в ходе оперативного вмешательства, должны содержать фильтр, отсекающий свет в интервале длин волн не менее 480 нм для предупреждения или снижения фототоксической опасности. Спектр предложенного светофильтра приближен к спектру пропускания естественного хрусталика человека с характерной точкой 50-ти % пропускания на 450 нм, практически не ослабляет свет в основной видимой области 500 – 700 нм, а так же ослабляет свет в области фототоксического повреждения (при 400 – 500 нм) на 30% и может быть рекомендован для применения в хирургическом осветительном оборудовании «Photon II» и «Accurus 800DS», а также в других осветителях любого типа нового поколения со сходными характеристиками светового потока.
Основные положения, выносимые на защиту
1.На основании физических методов исследования определен диапазон спектра светового воздействия ксенонового и ртутного источников эндовитреального освещения на клетки ретинального пигментного эпителия человека, которые индуцируют фототоксический эффект, но которые не нивелируются встроенными светофильтрами.
2.Светофильтр, найденный экспериментальным и расчетным путем с отсечением длин волн короче 475 нм, препятствует фототоксическому апоптотическому действию света и позволяет увеличить время безопасной световой экспозиции.
3.Тест-система, созданная на основе сфероидной 3D-культуры клеток ретинального пигментного эпителия человека, является наиболее информативной по оценке воздействия на ультраструктурном уровне повреждающего действия ксенонового и ртутного света операционных эндоосветителей и позволяет оценить светоиндуцированные субклеточные апоптические нарушения ретинального пигментного эпителия по повреждениям цитоскелета, клеточных ядер, крипт митохондрий.
Внедрение в практику
Результаты исследований внедрены в работу операционных блоков головной организации ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России, Центра фундаментальных и прикладных медико-биологических проблем Учреждения и Лаборатории клеточной биологии и патологии развития ФГБУ НИИ Общей патологии и патофизиологии РАМН.
Результаты диссертационной работы используются в лекционных курсах для клинических ординаторов, аспирантов и курсантов Научно-педагогического центра ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н.Федорова» Минздрава России.
Апробация работы
Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Федоровские чтения – 2013» (Москва, 2013) и научно-практических конференциях ФГБУ «МНТК «МГ» им. акад. С.Н. Федорова» (Москва, 2012, 2013).
На Всероссийской научной конференции с международным участием «Федоровские чтения» (2013) доклад на тему: «Экспериментальное исследование безопасности и профилактики фототоксического действия эндовитреальных источников света» занял первое место.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 3 – в журналах, рецензированных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа изложена на 96-ти страницах машинописного текста; иллюстрирована 5-ю таблицами, 19-тью рисунками. Работа состоит из введения и 4-х глав, включающих литературный обзор, материалы и методы исследования, 2-х глав результатов собственных исследований, содержит заключение, выводы и практические рекомендации. Список литературы включает 155 источников, из них 15 - отечественных и 140 - иностранных.
Культивирование клеток РПЭ человека и изучение полученных в ходе исследования препаратов с последующей фоторегистрацией осуществляли на базе Центра фундаментальных и прикладных медико-биологических проблем ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России (руководитель – д.м.н. Борзенок С.А.) и на базе лаборатории клеточной биологии и патологии развития ФГБУ НИИ Общей патологии и патофизиологии РАМН (руководитель – д.б.н. Сабурина И.Н.).
Теоретические расчеты и экспериментальное обоснование параметров светового воздействия ксенонового и ртутного источников света, исследование защитных свойств светофильтра подобранного экспериментальным и расчетным путем от повреждающего действия ксенонового и ртутного источников света проводились на базе лаборатории физико-химических основ рецепции Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН (зав. лабораторией – д.б.н., профессор, академик РАН Островский М.А.).
